Đề tài sản xuất phenylalanine

Phenylalanine là một trong tám acid amin không thay thế, cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ các nguồn bên ngoài.. Nhu cầu phenylalanine trên thế giới 3,06

MỤC LỤC

1 TỔNG QUAN VỀ PHENYLALANINE 3

2 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG 5

2.1 Nguyên liệu sản xuất phenylalanine 5

2.2 Nguyên liệu phụ 7

2.3 Vi sinh vật 9

2.3.1 Yêu cầu chọn giống 9

2.3.2 Chọn giống vi sinh vật 9

2.3.2.1 Đặc điểm của E coli 10

2.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng E coli có thể sử dụng được 10

2.3.2.3 Tổng hợp phenylalanine ở E.coli 11

3 QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ 13

4 GIẢI THÍCH QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ 15

4.1 Chuẩn bị nguyên liệu 15

4.1.1 Làm sạch 15

4.1.2 Nghiền 16

4.2 Thủy phân 17

4.2.1 Hồ hóa 17

4.2.2 Dịch hóa 17

4.2.3 Đường hóa 17

4.3 Chuẩn bị môi trường 18

4.4 Nhân giống 19

4.5 Lên men 19

4.6 Tách sinh khối 21

4.7 Trao đổi ion và nhả hấp phụ 22

4.8 Cô đặc chân không 24

4.9 Kết tinh 26

4.10 Ly tâm tách tinh thể 27

4.11 Sấy 28

4.12 Đóng gói 28

5 SẢN PHẨM 29

6 THÀNH TỰU 31

7 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32

DANH MỤC HÌNH Hình 1: Công thức cấu tạo phenylalanine 3

Hình 2: Hạt bắp 5

Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp 6

Hình 4: Vi khuẩn E.coli 10

Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E coli 11

Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E coli 12

Hình 7: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanine 13

Hình 8: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanine 14

Hình 9: Thiết bị làm sạch 15

Hình 10: Cấu tạo của máy nghiền búa 16

Hình 11: Thiết bị thủy phân ở áp suất cao 18

Hình 12: Bốn giai đoạn trong sản xuất L-phenylalanine có tính chất khác nhau cần kiểm soát khác nhau để thu được sản lượng cao trong thời gian ngắn nhất 20

Hình 13: Cấu tạo thiết bị lên men 20

Hình 14: Thiết bị lên men 20

Hình 15: Máy ly tâm siêu tốc loại ống 22

Hình 16: Các hạt nhựa trao đổi ion trong thiết bị trao đổi ion 23

Hình 17: Thiết bị trao đổi ion 24

Hình 18: Sơ đồ thiết bị cô đặc nhiều nồi 25

Hình 19: Thiết bị kết tinh bằng phương pháp làm lạnh 27

Hình 20: Thiết bị ly tâm lọc 27

Hình 21: Thiết bị sấy chân không 28

Hình 22: Phenylalanine ở dạng bột 29

DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm) 4

Bảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt 6

Bảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp 6

Bảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N) 7

Bảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác 7

Bảng 6: Thành phần dinh dưỡng trong 100g dịch chiết nấm men 7

Bảng 7: Chỉ tiêu sản phẩm phenylalanine 29

- Hòa tan trong H2O, không màu

- Độ hòa tan nước: 1-5g/100 ml ở 25ºC

- Tính ổn định: ổn định trong điều kiện bình thường Không bền với các tác nhân ôxi hóa mạnh

Phenylalanine là một trong tám acid amin không thay thế, cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được mà phải lấy từ các nguồn bên ngoài Đối với cơ thể người nhu cầu là 4,4g/người/ngày

Từ những năm 1980 đến nay nhu cầu về phenylalanine ngày càng tăng Trước đây người ta sản xuất phenylalanine bằng phương pháp enzyme, từ cuối năm 1996 tại Trung Quốc

phenylalanine được sản xuất bằng phương pháp lên men

Việc sản xuất phenylalanine trên thế giới chủ yếu tập trung ở Mỹ, Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc, Tây Âu Nhu cầu phenylalanine trên thế giới 3,06.108kg/năm

Phenylalanine được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm và sản xuất aspartame

L-phenylalanine có trong một số loại thực phẩm như thịt bò, cá, đậu nành, sữa, trứng…

Bảng 1: Hàm lượng phenylalanine trong một số thực phẩm (g/100g thực phẩm)

Phenylalaninne food sources (grams/100 gram food) Phenylalanine content

Chickpeas (garbanzo beans, bengal gram), mature seeds, raw 1,03

Seeds, sesame butter, tahini, from raw and stone ground

Beef, round, top round, separable lean and fat, trimmed to

Beef, top sirloin, separable lean only, trimmed to 1/8" fat,

Chicken, broilers or fryers, thigh, meat only, raw 0,78

Chicken, broilers or fryers, wing, meat and skin, raw 0,70

2 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG

2.1 Nguyên liệu sản xuất phenylalanine

Để sản xuất phenylalanine ta có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu như: gạo, bắp, mật rĩ… Trong bài này chúng tôi trình bày phương pháp sản xuất phenylalanine từ bắp

Hình 2: Hạt bắp

Bắp có nguồn gốc từ Nam Mỹ, những khu vực nóng như Amazon, Peru và được coi như là một loại cây trồng dùng cho chăn nuôi, sau đó được gieo trồng khắp nơi và trở thành một loại lương thực thực phẩm chủ yếu ở nhiều nước

Bắp được chia làm 6 loại:

- Bắp đá: hạt có màu vàng, trắng ngà hoặc có màu tím, hạt rất cứng, dùng để sản xuất bột

bắp

- Bắp bột: hạt màu vàng, trắng, dùng để sản xuất bột bắp

- Bắp răng ngựa: hạt có hình dạng giống răng ngựa, vàng, dùng sản xuất bột bắp

- Bắp đường: vỏ nhăn nheo, màu vàng, trắng, hàm lượng đường, protein rất cao, chủ yếu

để sản xuất dịch đường glucose

- Bắp rỗ: đầu hơi nhọn, hạt cứng, cũng dùng để sản xuất bột bắp

- Bắp nếp: trắng đục, dạng đầu tròn, khi nấu chín dẻo dính

2.1.1 Cấu tạo

Cấu tạo hạt bắp gồm có 5 thành phần chính là: tầng vỏ, lớp biểu bì, phôi, nội nhũ và mũ hạt Ngoài ra đầu dưới của hạt còn có gốc hạt liền với lõi

Hình 3: Cấu tạo của hạt bắp

B ảng 2: Cấu tạo của hạt bắp so với khối lượng của toàn hạt

Các phần của hạt bắp

- Nội nhũ là phần tập trung hầu hết tinh bột bắp

- Tinh bột là nguồn carbohydrate chính của bắp chứa khoảng 72% amylose, 28% amylopectin

- Protein trong bắp bao gồm zein chiếm khoảng 39%, globulin khoảng 10%, glutelin khoảng 30% và albumin chiếm khoảng 7%

B ảng 3: Thành phần hóa học của hạt bắp Thành phần

hóa học Vỏ hạt (%)

N ội nhũ (%) Phôi (%)

B ảng 4: Thành phần acid amin trong protein bắp (g acid amin/16g N)

(Theo Rinson và Hartwing 1977)

B ảng 5: Nhiệt độ hồ hóa của bắp và một số tinh bột khác

Tinh bột tự nhiên Nhiệt độ hồ hóa (t 0 C)

Riboflavin 14,3mg Fe 3,7mg Vitamin B6 1,3mg Mg 180mg Folate 1010mcg Phospho 104mg Vitamin B12 0,5mcg K 2600mg Choline 65,1 mg Na 3600mg

2.3.1 Yêu cầu chọn giống

- Khả năng sinh độc tố: không có

- Khả năng sinh tổng hợp sản phẩm chính: sản lượng phenylalanine tạo thành là lớn nhất

- Khả năng thích nghi và tốc độ sinh trưởng : dễ nuôi cấy, thích nghi tốt với môi trường, tốc độ sinh sản nhanh

- Điều kiện nuôi cấy: môi trường nuôi cấy dễ kiếm, rẻ tiền

2.3.2 Chọn giống vi sinh vật

Trong thiên nhiên, có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp phenylalanine, nhưng số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp nhiều phenylalanine để sử dụng trong qui mô sản

xuất công nghiệp là không nhiều Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin do chúng tự

tổng hợp được thường đủ đáp ứng yêu cầu bản thân nhưng trong điều kiện không bình thường nào đó lượng các acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra ngoài môi trường Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinh

vật Để thu nhận phenylalanine từ vi sinh vật ở quy mô công nghiệp, cần phải tiến hành phân

lập giống, tuyển chọn, gây đột biến, chọn điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp Chọn loài vi sinh vật tích lũy được nhiều acid amin là khâu quan trọng nhất Người ta đã xác định nhiều loài vi sinh vật tổng hợp được phenylalanine với lượng khác nhau Trong số đó đáng kể

là vi khuẩn và nấm men có thể tổng hợp được một lượng khá lớn phenylalanine, tiêu biểu là các loài:

Hiện nay, người ta tạo ra được các chủng E.coli tái tổ hợp, đột biến có khả năng tổng

hợp phenylalanine cao Các tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý như tia bức xạ ion hóa hay tác nhân hóa học, sử dụng các chất oxy hóa mạnh như etylen hoặc các chất gây đồng

vị phóng xạ mạnh Qua khâu đột biến ta thu dược những chủng mới có khả năng tổng hợp

phenylalanine cao như là E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine Trong bài này chúng tôi sẽ giới

thiệu việc sử dụng thể E.coli đột biến dị dưỡng tyrosine để sản xuất phenylalanine Escherichia coli đột biến dị dưỡng tyrosine (E.coli W3110)

2.3.2.1 Đặc điểm của E coli

Chi (genus): Escherichia

Loài (species): E coli

- Gram âm, kỵ khí tùy tiện, không sinh bào tử

- Tế bào hình que dài khoảng 2 μm, đường kính

- Có thể sử dụng nhiều cơ chất khác nhau

- Sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí hay kỵ khí dùng nhiều cặp oxy hóa khử khác nhau, bao gồm sự oxi hóa pyruvic acid, formic acid, hydroge, amino acids và sự giảm cơ chất như oxygen, nitrate, dimethyl sulfoxide và trimethylamine N-oxide

2.3.2.2 Nguồn dinh dưỡng E coli có thể sử dụng được

 Nguồn cacbon:

Glucose, lactose, mannitol, maltose, fructose, galactose, sorbitol, glycerol, acid cinamic

 Nguồn nitơ:

 V ô cơ: ammonia, nitrate, NH4Cl, (NH4)2SO4, (NH4)2-H-citrate

 H ữu cơ: peptone, L-asparagine, adenine, adenosine, agmatine, L- and D-alanine,

allantoin (anaerobically), [gamma]-aminobutyrate, arginine, aspartate, cytidine, cytosine, glucosamine, glutamine, glutamate, glycine, ornithine, proline, putrescine, L- and D-serine, threonine

2.3.2.3 Tổng hợp phenylalanine ở E.coli

Hình 5: Sơ đồ tổng quan về các phản ứng trong trung tâm trao đổi chất của E coli

Chữ viết tắt được sử dụng:

PTS: phosphoenolpyruvate phosphotransferase system Tkt: transketolase

G6P dh:glucose-6-phosphate dehydrogenase Tal: transaldolase

Sed7P: sedoheptulose 7-phosphate E4P: erythrose 4-phosphate

Hình 6: Con đường sinh tổng hợp acid amin vòng thơm trong E coli

Để chỉ ra các loại quy định, các loại kí hiệu được sử dụng:

– – –,kiểm soát phiên mã và dị lập thể bởi acid amin mạch vòng criptional;

· · · , kiểm soát dị lập thể; —, kiểm soát phiên mã

Chữ viết tắt được sử dụng: ANTA, anthranilate; aKG, a-ketoglutarate; CDRP, deoxyribulose 5-phosphate; CHA, chorismate; DAHP, 3-deoxy-d-arobino-heptulosonate 7-phosphate; DHQ, 3-dehydroquinate; DHS, 3-dehydroshikimate; EPSP, 5 enolpyruvoylshiki-mate 3-phosphate; E4P, erythrose 4-phosphate; GA3P, glyceraldehyde 3-phosphate; HPP, 4-hydroxyphenlypyruvate, I3GP, indole 3-glycerol- phosphate; IND, indole; l-Gln, l-glutamine; l-Glu, l-glutamate; l-Phe, l-phenylalanine; l-Ser, l- serine; l-Trp, l-tryptophan; Tyr, l-tyrosine; PEP, phosphoenolpyruvate; PPA, prephenate; PPY,

1-(o-carboxyphenylamino)-1-phenylpyruvate; PRAA, phosphoribosyl anthranilate; PRPP, 5-phosphoribosyl-a-pyrophosphate; Pyr, pyruvate; SHIK, shikimate; S3P, shikimate 3-phosphate.

Ở thể E.coli bình thường tyrosine được tổng hợp đồng thời với phenylalanine Ở thể đột

biến dị dưỡng tyrosine con đường tổng hợp tyrosine sẽ không có

Nguyên liệu

Giống

Enzyme amylase

Glucose, tyrosine Nhân giống

Hình 7: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanine

Tách sinh khối

Trao đổi ion

Cô đặc chân không

Kết tinh

Dịch sau lên men

4 GIẢI THÍCH QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ

4.1 Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị nguyên liệu cho quá trình thủy phân Bắp được đem làm sạch và nghiền để tạo kích thước nhỏ giúp cho quá trình thủy phân xảy ra dễ dàng

hạt chính và tạp chất bé (đất, cát…)

4.1.2 Nghiền

 M ục đích:

Quá trình nghiền nhằm mục đích phá vỡ màng tế bào, đồng thời giải phóng tinh bột ra

khỏi tế bào Chuẩn bị cho quá trình thủy phân tinh bột

 Các bi ến đổi:

 Vật lý:

- Thay đổi kích thước của nguyên liệu

- Tế bào tinh bột bị phá vỡ, giải phóng tinh bột dưới dạng hạt có kích thước nhỏ

 Hoá sinh:

- Khi vỏ tế bào bị phá vỡ, các enzyme trong tế bào cũng được giải phóng và có điều

kiện hoạt động, nhất là các enzyme thủy phân tinh bột

 Thi ết bị:

Bắp ở dạng nguyên hạt khó bị thủy phân để tạo thành dịch đường, do vậy bắp cần phải được nghiền thật nhỏ, để phá vỡ cấu trúc tinh bột tạo điều kiện cho sự hút nước, trương nở hạt tinh bột, tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với hạt tinh bột, thủy phân tinh bột thành dịch đường, có thể chọn thiết bị nghiền búa, nghiền trục…để thực hiện quá trình này Trong khuôn

khổ bài này giới thiệu máy nghiền búa Dưới đây là hình ảnh và cấu tạo đơn giản của thiết bị nghiền búa

Hình 10: Cấu tạo của máy nghiền búa

 Nguyên tắc hoạt động: vật liệu trong máy nghiền búa được nghiền nhỏ, do sự va đập của búa vào vật liệu và chà xát vật liệu giữa búa và thành máy Các hạt vật liệu sau khi nghiền

có kích thước nhỏ hơn lỗ lưới phân loại sẽ đi ra ngoài, các hạt có kích thước lớn hơn lỗ lưới phân loại sẽ được tiếp tục nghiền

 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nghiền:

- Tính chất nguyên liệu: kích thước của nguyên liệu, độ cứng, độ ma sát, cấu trúc,

độ ẩm, tính mẫn cảm nhiệt của nguyên liệu

- Thiết bị: lực tác dụng lớn thì quá trình nghiền nhanh, kích thước lỗ sàng càng bé thì mức độ nghiền càng mịn

- Dưới tác dụng của nhiệt, độ nhớt của dung dịch tăng và đạt giá trị cực đại

- Hạt tinh bột trương nở cực đại

- Thể tích hạt tinh bột cực đại

 Hóa lý:

- Khả năng hòa tan tăng

- Dung dịch trở nên đồng nhất

- Ở nhiệt độ cao, khả năng hút nước của hạt tinh bột càng mạnh

 Sinh học: không có những biến đổi quan trọng, một số vi sinh vật bị ức chế

 Hóa học: có sự tạo thành liên kết hydro với nước

- Tăng diện tích tiếp xúc cho hạt tinh bột

 Hóa lý: tăng khả năng hòa tan cho hạt tinh bột

 Hóa học: liên kết hydro với nưóc bị phá vỡ

 Sinh học: vi sinh vật có thể bị ức chế hay tiêu diệt

- Tăng hàm lượng chất khô

- Tăng khả năng truyền nhiệt

- Giảm độ nhớt

 Hóa lý: tăng khả năng hòa tan

 Hóa sinh: có sự tác dụng của α-amylase và gluco-amylase lên các mạch amylose và amylopectin tạo thành hỗn hợp sản phẩm chủ yếu là glucose và các dextrin mạch ngắn

 Hoá học: có thể xảy ra phản ứng Maillard tạo thành các hợp chất làm sậm màu dung dịch

 Phương pháp thực hiện và thiết bị:

Sử dụng phương pháp hồ hóa và dịch hóa ở áp suất cao

- Phối trộn nguyên liệu và nước theo tỷ lệ 1/3(m/m), chỉnh pH thích hợp

- Gia nhiệt đến 140-160oC (4,5-6 bar), thời gian gia nhiệt 30-45 phút Thời gian dừng 40-60 phút

- Làm nguội đến 90oC bổ sung chế phẩm α-amylase chịu nhiệt

- Làm nguội đến 60oC, đường hóa bằng chế phẩm enzyme thích hợp

Hình 11: Thiết bị thủy phân ở áp suất cao

4.3 Chuẩn bị môi trường

- Mục đích: bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật, chỉnh pH

- Môi trường lên men:

4.4 Nhân giống

 M ục đích: tăng số lượng vi sinh vật, chuẩn bị cho quá trình lên men

 Bi ến đổi:

- Sinh học: Số lượng tế bào tăng lên (tăng sinh khối)

- Hóa sinh: Các phản ứng trao đổi chất của vi sinh vật

 Phương pháp thực hiện: Chọn môi trường lên men có thành phần chính là glucose

 Vật lý: nhiệt độ lên men tăng do quá trình trao đổi chất sinh năng lượng

 Hóa lý: thay đổi độ nhớt, tạo những hợp chất keo

 Hóa học: hàm lượng cơ chất và thành phần dinh dưỡng giảm xuống, hàm lượng phenylalanine tăng lên

 Vi sinh: lượng sinh khối tăng lên, vi sinh vật sinh tổng hợp phenylalanine

 Phương pháp thực hiện: lên men tĩnh có bổ sung cơ chất

Thực hiện lên men hiếu khí, trong quá trình lên men có bổ sung glucose và tyrosine

Bổ sung glucose vào khi hàm lượng glucose trong môi trường giảm xuống tới mức 5g/l, dùng dung dịch có hàm lượng glucose 700 g/l bổ sung vào để giữ nồng độ glucose trong dung dịch ở mức 5g/l Trong quá trình trao đổi chất, E coli sẽ sử dụng nguồn cacbon để

tạo ra 4 sản phẩm chính là: sinh khối, phenylalanine, acid acetic và CO2 E.coli sẽ có xu hướng sản xuất ra nhiều acid acetic khi môi trường lên men có hàm lượng đường cao Tuy