Đề tài Sản xuất sinh khối vi sinh vật làm thức ăn gia súc

LỜI MỞ ĐẦU Nhiều vi sinh vật VSV có khả năng tổng hợp được lipid và tích lũy trong tế bào với lượng khá lớn.. Nấm men là loài vi sinh vật đầu tiên được nhận thấy có sự tích lũy lipid các

LỜI MỞ ĐẦU

Nhiều vi sinh vật (VSV) có khả năng tổng hợp được lipid và tích lũy trong tế bào với lượng khá lớn Nấm men là loài vi sinh vật đầu tiên được nhận thấy có sự tích lũy lipid cách đây khoảng hơn một thế kỷ Sau đó, các vi sinh vật tích lũy lipid khác cũng được nhận ra như vi khuẩn, nấm mốc, vi tảo

Những nghiên cứu về vi sinh vật giàu lipid được chú ý đến nhiều hơn do lipid vi sinh vật có chứa nhiều acid béo không no quan trọng Vi sinh vật là cơ thể có tốc độ sinh trưởng rất mạnh, khả năng tăng trưởng nhanh Chỉ trong một thời gian rất ngắn ta có thể thu nhận được một khối lượng sinh khối rất lớn Đồng thời các vi sinh vật giàu lipid có khả năng sống trên mọi cơ chất như rỉ đường, gỗ tạp, rơm rạ, bã mía, nườc thải … Chính

vì những lý do đó nên vi sinh vật được đưa vào sản xuất sinh khối để làm thức ăn cho gia

súc giàu lipid

Trong quá trình thực hiện bài báo cáo nhờ sự chỉ dẫn tận tình của các thầy cô thuộc

Bộ môn Công nghệ thực phẩm, đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, nhóm em đã hoàn thành đề tài này, xin cảm ơn sự giúp đỡ của quý thầy cô, cũng như cảm ơn sự động viên, giúp đỡ của các bạn trong quá trình thực hiện đề tài

Bài báo cáo của nhóm em không tránh khỏi thiếu sót, xin quý thầy cô chỉ dẫn thêm, giúp chúng em có kinh nghiệm để thực hiện những báo cáo tiếp theo

Xin chân thành cảm ơn

2

I GIỚI THIỆU CHUNG

Không phải tất cả các vi sinh vật đều có thể tích lũy lipid Các vi sinh vật chứa nhiều lipid thường thấy :

Vi khuẩn : Mycobacterium, Corynebacterium, Azotobacter, Rhizobium,

Bacillus,Pseudomonas, Spirillum

Nấm mốc: Geotrichum, Candidum, Mucor, Fusarium, Penicillium, Aspergillus

Đặc biệt nấm men là đối tượng được nhiều nhà nghiên cứu chú ý nhất, như các

nấm men Rhodotorula glutinis, Trichosporon pullulans, Metschnikơia (Candida)

pulcherrima và Saccharomyces cerevisiae

Hình 1 : Hình giọt lipid cuả giống Cryptococcus curvatus

I.1 Môi trường

Sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền và hiệu suất chuyển hoá cao đó là các loại phế liệu, phụ phẩm của một số ngành công nghiệp khác Nguồn nguyên liệu này rất phong phú, đa dạng, rẻ tiền, dễ kiếm như: rỉ đường, khi thuỷ phân gỗ tạp, rơm rạ, bã mía… do vậy giá thành của sản phẩm sẽ thấp Đồng thời sử dụng nguyên liệu này sẽ góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do chất thải và nước thải

Đặc trưng của môi trường nuôi cấy vi sinh vật giàu lipid

− Nồng độ N rất thấp và nồng độ C là dư thừa Tỷ lệ C:N thường dao động trong khoảng 30:1- 50:1

− Nồng độ chất khô khoảng 2-10%, thường sử dụng ở nồng độ 8%

Bảng 1: Sự phát triển của Rhodotorula glutinis và hàm lượng lipid theo nồng độ mật rỉ củ

− Nguồn Nitơ: NH4Cl, NH4NO3, (NH4)3PO4, (NH4)2SO4, Casein, rượu bắp ngâm, Peptone, Trypone, Urea, dịch chiết nấm men

− Muối hòa tan: (NH4)2SO4, KH2PO4, MgSO4 7H2O

Bảng 2 : Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tích lũy lipid và thành phần acid béo của

Candida 107 phát triển ở cùng tốc độ pha loãng trong nuôi cấy liên tục 1 giai đoạn và 2

giai đoạn

pH

pH phụ thuộc vào từng loài nhưng thường khoảng 3.5-7.5 Sự ảnh hưởng của pH lên sự tích lũy lipid là không đáng kể và ít được quan tâm pH ảnh hưởng lên thành phần acid béo cũng khá ít

Để điều chỉnh pH người ta thường dùng acid citric

Thông thoáng khí

Việc cung cấp không khí giàu O2 có ý nghĩa rất quan trọng trong việc tích lũy lipid của vi sinh vật Quá trình hình thành acid béo không bão hòa là một quá trình phụ thuộc mức độ

O2 và thành phần acid béo của lipid cũng bị ảnh hưởng

Bảng 3 : Ảnh hưởng của tỉ lệ thông thoáng khí trong sự tích lũy lipid và thành phần của

Candida 107 phát triển ở cùng tỷ lệ pha loãng trong nuôi cấy một giai đoạn và hai giai

đoạn

6

I.3 Đặc điểm sinh lý

Các vi sinh vật có khả năng tích lũy béo có khả năng phát triển trong điều kiện nguồn Nitơ vô cùng bé, và khi nguồn Nitơ đã cạn kiệt vẫn có thể sống trong 24 - 48h Sự cạn kiệt của nguồn Nitơ so với các thành phần dinh dưỡng khác chính là lý do dẫn đến sự tích tụ lipid

Các vi sinh vật giàu béo có một loại enzyme đặc biệt mà các loài vi sinh vật không

có khả năng tích lũy lipid không có, đó chính là : ATP: citrate lyase

Các vi sinh vật quan trọng trong sự tổng hợp lipid trong vi sinh vật giàu béo là: ATP: citrate lyase (ACL), malic enzyme (ME), AMP deaminase, isocitrate dehydrogenase (ICDH)

Cơ chế tích lũy lipid

Sự tích lũy lipid trong vi sinh vật giàu béo bắt đầu khi nó cạn kiệt một chất dinh dưỡng trong môi trường; thường là Nitơ, nhưng với sự dư thừa carbon ( thường ở dạng glucose) vẫn được duy trì Glucose tiếp tục được tế bào sử dụng và biến đổi thành triacylglycerol với tốc độ nhanh hơn hay chậm hơn khi lipid được tổng hợp trong giai đoạn phát triển cân bằng Tuy nhiên, vì sự cạn kiệt về nguồn Nitơ dẫn đến sự phát triển tế bào bị ngăn chặn, lúc này lipid được hình thành và tích lũy trong các tế bào sống ( những tế bào không thể phân chia được nữa) Từ đó ta có vi sinh vật “ béo phì” Cuối giai đoạn tích lũy lipid tế bào cần được thu nhận và xử lý ngay Nếu glucose hay cơ chất khác trở nên cạn kiệt vào cuối quá trình lên men thì vi sinh vật sẽ bắt đầu sử dụng lipid như vai trò của nguyên liệu tích lũy cho phản ứng, như một kho dự trữ của carbon, năng lượng, và thậm chí có thể là nước

Vấn đề hóa sinh đầu tiên có thể nhận thấy sau sự cạn kiệt về nguồn Nitơ từ môi trường phát triển là sự hoạt hóa của AMP deaminase:

Sự hoạt động này có thể thấy như một cơ chế tìm ammonia, cái có thể trở thành một đơn

vị giới hạn ngắn để giảm bớt sự thiếu hụt Nitơ trong các tế bào Kết quả của sự giảm AMP thì xảy ra đồng thời với sự thay đổi đột ngột trong sự tiêu thụ O2 của tế bào và thải

CO2 Điều này tác động đến isolate(NAD+- linked) dehydrogenase (ICDH) trong thời gian

ty lạp thể hoạt động chậm hoặc ngừng hoạt động Enzyme này trong vi sinh vật giàu béo

là một đòi hỏi tuyệt đối cho AMP, nhưng đối với tế bào vi sinh vật không giàu béo thì không cần thiết Sự khử hoạt tính của ICDH xuất hiện khi sự giảm lượng AMP trong tế bào Sự ngừng hoạt động của ICDH nhanh chóng dẫn đến sự hình thành citrate từ isocitrate, sau đó nhanh chóng cân bằng với citrate theo aconitase Citrate được vận chuyển khỏi ty lạp thể, theo hệ thống vận chuyển malate hay citrate, và được tách ra trong dịch bào tương bởi một enzyme, enzyme này thi không có mặt trong tế bào không giàu béo Đó là ATP: citrate lyase (ACL)

Những vi sinh vật không có ACL thì không thể tích lũy lipid Một số vi sinh vật được tìm thấy có chứa enzyme này nhưng cũng không tích lũy lipid hoặc tích lũy rất thấp Sự có mặt của enzyme này không giải thích được vì sao những loài vi sinh vật giàu béo khác nhau thì có khả năng tích lũy lipid khác nhau Điều này cho thấy rằng ACL là yếu tố tiê n quyết để xảy ra sự tích lũy lipid nhưng nó không là yếu tố duy nhất để sự tích lũy lipid xảy ra Do đó hoạt động của enzyme khác sẽ đảm nhận trách nhiệm điều khiển phạm vi sinh tổng hợp lipid trong sinh vật, và enzyme điều khiển này chính là malic enzyme (ME)

Malic enzyme hoạt động như là một nguồn NADPH duy nhất cho sự tổng hợp acid béo (FAS) Nếu ME bị ức chế, hoặc bị khuyết tật về mặt di truyền thì sự tích lũy lipid sẽ rất chậm Không có nguồn NADPH nào khác dùng cho FAS Độ bền của ME có vai trò quyết định và nó gắn liền với FAS Khi ME ngừng hoạt động thì sự tích lũy lipid cũng ngưng lại Không có một enzyme nào khác cho thấy có sự tương quan

8

Hình 2 : Sơ đồ sinh tổng hợp lipid của vi sinh vật giàu béo

Đặc điểm lipid vi sinh vật

Những loại lipid được tìm thấy trong các vi sinh vật giàu béo thì rất đa dạng và phụ thuộc vào từng loài Tricacylglycerol chiếm khoảng 95% trong các lipid, những loại lipid phổ biến khác như glycolipid, monovà diacylglycerol thường chiếm khoảng 10% tổng lượng lipid Ngoài ra còn có một số loại lipid không phổ biến như sulfo- và peptidolipid, các hydrocarbon, sterol, polyhydroxyalkanoate, wax ester, glycerosulfate và các ether lipid được tìm thấy trong vi khuẩn Nấm men và nấm mốc sản xuất ra những loại khác nhau của carotenoid, steroid, sphingolipid của glycolipid Các acid béo phân nhánh và acid béo hydroxy xuất hiện trong lipid của vi khuẩn Lipid của vi tảo cho thấy một tỷ lệ cao khác thường của các acid béo không bão hòa cao phân tử ( PUFAs) liên kết với các lipid phân cực Acid béo của nấm men thì tương tự như dầu thực vật, với oleic, palmitic, linoleic, và acid stearic tự do Acid béo của nấm mốc thì đa dạng hơn nấm men, với các acid béo mạch ngắn ( C10-C14), PUFAs, và các acid béo hydroxy

Hình 3 : Các loại lipid của vi sinh vật

10

Hình 4 : Các loại acid béo của vi sinh vật

Bảng 4: Hàm lượng lipid và mức độ thành phần acid béo chính trong sinh khối của các vi

tảo tích lũy lipid

Bảng 5: Hàm lượng lipid và mức độ thành phần acid béo chính trong sinh khối của các

nấm men tích lũy lipid

Bảng 6: Hàm lượng lipid và mức độ thành phần acid béo chính trong sinh khối của các

nấm mốc tích lũy lipid

12

Bảng 7: Tỉ lệ sản sinh lipid của một số loại vi sinh vật

II VI SINH VẬT :Rhodotorula glutinis

Rhodotorula glutinis được phân lập từ những vùng đất bị nhiễm bẩn như xung quanh khu

vực nhà máy đường, nhà máy sản xuất mì chính ( monosodium glutamate)…

Khối lượng : khoảng 6.85*10-6 μg.cell-1

( theo James E Haney, Department of Zoology, University of New Hamsphir e, Durham 03824)

II.2 Điều kiện sinh trưởng

Rhodotorula glutinis sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí bão hòa O2

Nhiệt độ môi trường : 28-290

C

pH : 4-8 ( tối ưu cho quá trình tích lũy lipid là 7-8)

Áp suất : 1at

14

II.3 Môi trường nuôi cấy

Nguồn C : Rhodotorula glutinis có thể sử dụng nhiều loại đường làm nguồn C như : fructose, glucose, saccharose, galactose, lactose, maltos, raffinos, starch , xylose…

Rhodotorula glutinis thường được dùng nuôi cấy trong môi trường chất thải có nhiều

đường để tận thu năng lượng

Nguồn N: NH4Cl, NH4NO3, (NH4)3PO4, (NH4)2SO4, Casein, Corn steep liquor, Peptone,Trypone, Urea, Yeast extract…

Môi trường nuôi cấy tối ưu cho quá trình tích lũy lipid trong tế bào Rhodotorula

glutinis phải đảm bảo lượng C có hàm lượng vượt trội so với hàm lượng N hoặc P Do

trong điều kiện môi trường như vậy kích thích nấm men sản sinh ra enzyme Phosphofructokinase Enzyme này có tác dụng định hướng C từ chu trình Pentophosphate (HMP) vào chu trình Tricarboxylic acid ( ATC) ( Biochemical and biophysical researc h communications, p.681-687, vol 100, No.2), chủ yếu tạo ra các triacid 3C làm tiền chất cho quá trinh sinh tổng hợp lipid

Muối khoáng : Nấm men sinh trưởng yếu và lượng lipid thấp đã được giữ trên môi trường không có NaH2PO4 Khi cho thêm 0.5g/l muối trên cho phép nấm men lên men tốt hơn, tích lũy nhiều lipid hơn Cũng theo nghiên cứu thì lượng muối NaCl tối ưu cho nấm men sinh trưởng là 4% Việc bổ sung cùng một lúc các muối K2SO4, ZnSO47H2O,FeCl3

và MgSO4 không có ảnh hưởng gì nhiều tới quá trình lên men

Hình 6: Đồ thị tích lũy lipid đặc trưng cho nấm men phát triển trong môi

trường lên men gián đoạn với tỷ lệ C:N cao

Hình 7: Đồ thị thể hiện sự tích lũy lipid của nấm men trong điều kiện nuôi cấy liên tục

với tỉ lệ C:N cao

Khả năng lên men : Rhodotorula glutinis có khả năng lên men trong điều kiện gián

đoạn có bổ sung cơ chất cho lượng lipid tích lũy nhiều hơn so với lên men gián đoạn

Consumed sugar (%)

Dry wt(mg)

Dry wt(mg)

% of dry

III NGUYÊN LIỆU

III.1 Mật rỉ đường mía

Là một hỗn hợp khá phức tạp chứa đựng nhiều đường không kết tinh, chứa các hợp chất Nitơ, vitamin, các hợp chất vô cơ, chất kích thích sinh trưởng, chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật ( SO2, hydro oxymethylfurfurol), vi sinh vật tạp nhiễm …

Mật rỉ đường có màu nâu sậm, màu này rất khó bị phá huỷ trong quá trình lên men Màu bám vào sinh khối và sản phẩm do đó việc tách màu khó khăn và tốn kém Tuy nhiên đây lại là môi trường giàu nguồn Cacbon, cung cấp nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật phát triển và là loại nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm

Thành phần hoá học của mật rỉ đường mía:

Chất khô (%khối lượng mật rỉ) 80-85 Đường tổng (%khối lượng chất khô) 48-56 Chất hữu cơ khác (%khối lượng chất khô) 9-12 Sucrose (%khối lượng chất khô) 32-45 Glucose (%khối lượng chất khô) 5-11 Frutose (%khối lượng chất khô) 6-15 Nitơ tổng (%khối lượng chất khô) 0.3-0.5

Thành phần tro rỉ đường mía (% tổng khối lượng tro) : K2O 30-50; Na2O 0.3-9.0; CaO 7-15; MgO 2-14; P2O5 0.5-2.5; SiO2 1-7 và các khoáng khác

Ngoài ra trong rỉ đường còn có một số vitamin (tính theo microgam trên một gam rỉ đường) như sau:

Thiamine : 8.3 Folic acid : 0.038 Riboflavin : 2.5 Pyridoxine : 6.5 Nicotimic acid: 21.0 Biotin : 12.0 Pantothenic acid : 21.4

Những ưu điểm của mật rỉ đường mía:

 Giá rẻ

 Khối lượng lớn, dồi dào

 Sử dụng tiện lợi

 Nguồn cung cấp khá phổ biến

 Đặc biệt ở nước ta không phạm đến c hính sách lương thực

Chỉ tiêu chất lượng mật rỉ đường:

Dịch đường lên men cần thoả mãn:

 Chỉ tiêu hóa học : độ đường : 14-160 (S), chất khô không ít hơn 75% khối lượng, hàm lượng saccharose từ 31- 50%, pH 4.5- 6.0 , hàm lượng Nitơ tổng không ít hơn 1.4%, số lượng vi sinh vật không quá 15000 VSV/ 1g nguyên liệu

 Chỉ tiêu hóa lý : pha rắn trong dịch mật rỉ giảm đáng kể

 Chỉ tiêu sinh học: lượng vi sinh vật : ít tốt

 Chỉ tiêu cảm quan: độ sệt, màu vàng

Trong rỉ đường luôn có mặt vi sinh vật với nồng độ rất lớn, thường gặp nhất là những vi sinh vật gây màng và gây chua, dẫn tới làm giảm chất lượng của rỉ đường Vì vậy, trong sản xuất ta hay dùng fluosilicate natri 20

/000 so với trọng lượng mật rỉ để bảo quản

III.2 Nước

Nước sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men là nước sử dụng trong sinh hoạt (nước máy) Nếu sử dụng nước giếng phải xử lý chúng để chất lượng loại nước này đạt chất lượng như nước máy dùng trong sinh hoạt

Nước được coi như nguyên liệu chính dùng trong sản xuất vì đây là công nghệ lên men hiếu khí

Các yêu cầu về nước :

- Có độ cứng từ 4 – 8o

(1o tương đương 10 mg CaO/l)

- Không màu, không mùi, không vị

- Các chất sau không được quá mức cho phép (mg/l): Cl

< 0,5; SO4-2 < 80; As < 0,05; Zn < 5; Cu < 3; FeO < 3

Tổng số vi khuẩn hiếu khí <10 cfu/L (37o

C), không chứa Coliforms, không chứa Faecal

streptococci và các vi khuẩn clostridia khử sulphit

Lên men Làm nguội

IV.1.1 XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU

 Bước 1:Acid sulfuric đậm đặc (3.5kg/tấn mật rỉ), khuấy đều, 850C,ly tâm: 6h xử lý

 Bước 2 :Pha loãng

Các biến đổi của nguyên liệu :

- Vật lý : thể tích và tỉ trọng mật rỉ giảm, màu sắc trong hơn vì được loại tạp chất bẩn

- Hóa lý: thu được pha lỏng từ dạng huyền phù ban đầu

- Hóa học: sau khi lọc dung dịch hầu như không thay đổi về thành phần hóa học tuy nhiên có thể tổn thất một ít các chất có ích theo cặn như protein, vitamin,chất màu v.v

- Sinh học: loại bỏ một số vi sinh vật không mong muốn theo cặn

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình :

- Chất lượng mật rỉ, độ nhớt hay kích thước và tính chất của tạp chất muốn loại bỏ đều

ảnh hưởng đến tốc độ xử lý nguyên liệu

- Phương pháp sử dụng và thiết bị xử lý như chất trợ lắng, chất trợ lọc, vải lọc…\

Thiết bị sử dụng: lọc ly tâm

Hình 8: Sơ đồ nguyên lý của thiết bị lọc ly tâm