Tổng quan về Collagen và ứng dụng của Collagen

Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổ

CHƯƠNG 1: COLLAGEN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ COLLAGEN

1.1.1 Khái quát về Collagen [2]

 Collagen là một protein có cấu trúc bậc 4 điển hình, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 25% - 35% tổng lượng protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống Collagen được phân bố trong các bộ phận như da,

cơ, gân, sụn, răng, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao quanh các cơ và là thành phần chính của dây chằng và gân, Khoảng 10% protein trong

cơ ở động vật có vú là collagen, các protein ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen

 Trong thành phần của da, collagen chiếm khoảng 70% cấu trúc da và được phân bố chủ yếu ở lớp hạ bì của da, tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ các đặc tính cơ học của da như : sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm, Nó đóng vai trò kết nối tế bào, kích thích quá trình trao đổi chất, tạo độ đàn hồi cho da Sự suy giảm về số lượng và chất lượng collagen sẽ dẫn đến hậu quả lão hóa của cơ thể mà sự thay đổi trên làn da, khuôn mặt là dấu hiệu dễ nhận biết nhất: làn da bị khô, nhăn nheo bắt đầu từ các đường nhăn mảnh trên khóe mắt, khóe miệng, lâu dần thành nếp nhăn sâu, các đường nét khuôn mặt bị chùng nhão và chảy xệ Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống và tác động của môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương , khi đó sợi collagen sẽ mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá hủy Chính vì vậy mà collagen đóng vai trò là một trong những chất quan trọng hàng đầu của ngành thẩm mỹ, đặc biệt là chăm sóc da, phẫu thuật thẩm mỹ, phẫu thuật bỏng

 Collagen cũng được phân bố ở giác mạc, và tồn tại dưới dạng tinh thể Trong mô cơ, collagen chiếm khoảng từ 1% đến 2% Trong cơ thể người, collagen chiếm từ 20 – 25% protein của cơ thể

 Collagen là thành phần chính của mô liên kết, có chức năng tạo độ vững chắc và đàn hồi Collagen có tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và cơ quan nền tảng trong cơ thể Collagen cung cấp cho các mô liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó Theo quan điểm y sinh, collagen đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển, hàn gắn vết thương, là thành phần hoạt hoá các tiểu cầu trong máu và sự hình thành mạch Thêm vào đó sự phát triển của một số bệnh di truyền được xác định là do sự đột biến trong cấu trúc gen của collagen Những rối loạn trong quá trình tổng hợp hoặc phân giải collagen đều được ghi lại như là nguyên nhân của nhiều căn bệnh phức tạp như chứng viêm khớp, xơ gan, bệnh đái đường và ung thư cũng như những bệnh có liên quan đến sự lão hoá Collagen phân bố khắp nơi trong cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc Trong gân và dây chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn hồi Chính nhờ tính chất này mà cơ thể có thể di chuyển, vận động một cách nhịp nhàng và uyển chuyển Collagen còn là chất nền hữu cơ có trong xương và men răng giúp chúng chống lại sự rạn nứt Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ Bên cạnh các chức năng cơ học,

ở giác mạc, thủy tinh thể, trật tự cấu trúc của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt duy trì thị lực

 Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng Sự linh hoạt của nó là nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ những chức năng nhất định Xét về mặt kinh tế, nguồn nguyên liệu giàu collagen dùng để sản xuất

ra gelatine- chất có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau: thực phẩm, y học và

dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ nhiếp ảnh,

1.1.2 Lịch sử phát triển của Collagen

Theo tiếng Hy Lạp, collagen có nghĩa là “người sản xuất keo hồ”, nói đến quá trình nấu da và gân của ngựa cùng những loài động vật khác để thu được hồ Keo dán

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 2

collagen đã được người Ai Cập sử dụng cách đây 4000 năm và người Mỹ sử dụng nó cách đây khoảng 1500 năm.

Từ hơn 2000 năm trước, con người đã biết sử dụng mô liên kết và sản phẩm của nó trong chế biến thực phẩm để tạo ra các sản phảm dạng gel, các chất dính Người Ai Cập cổ đại đã sản xuất ra được collagen và những nghiên cứu cho thấy trong những thế kỉ tiếp theo đã thật sự xuất hiện collagen trong các bữa tiệc, ví dụ trong món cá hồi hay bánh hoa quả,

Năm 1682, một người Pháp tên Papin đã công bố một kết quả là đã thu được một hỗn hợp giống jelly từ xương Từ năm 1700, thuật ngữ collagen trở nên thông dụng

Năm 1754, bài báo đầu tiên trong lĩnh vực chất dính được công nhận ở Anh về việc sản xuất chất dán của một người thợ làm đồ gỗ Các chất hồ dán tự nhiên được sản xuất trên thành phần cơ bản là collagen và một vài chất khác

Năm 1850, công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện tại Mỹ, nguồn nguyên liệu chính lúc này là xương

Năm 1871, một phát hiện quan trọng của bác sĩ người Anh Richard Leach Maddox về ứng dụng của collagen đã đưa đến bước đột phá trong ngành công nghiệp hình ảnh, vị bác

sĩ đã cải tiến “dry plate” với một lớp gelatin – bạc bromua và còn nhạy hơn khi so với “wet plate” Sau đó nghiên cứu của Charles Bennet đã tiếp tục hoàn thiện phương pháp dùng “dry plate” Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là giảm rất nhiều thời gian trong công nghiệp nhiếp ảnh

Cuối thế kỉ 19, khi ngành công nghiệp sản xuất collagen xuất hiện đã làm tăng thêm các ứng dụng của collagen trong các ngành công nghiệp khác và ổn định tính chất sản phẩm

Năm 1930, ngành sản xuất collagen được phát triển mạnh mẽ khi da heo được xem như là một nguồn nguyên liệu thu nhận collagen Ngành công nghiệp sản xuất collagen ở

Châu Âu chỉ mới bắt đầu khoảng những năm 1930 nhưng Châu Âu lại trở thành khu vực sản xuất collagen quan trọng nhất trên thế giới.

Năm 1950, công nghiệp sản xuất collagen có những bước phát triển đáng kể về kĩ thuật, từ đó là nền tảng cho các tiêu chuẩn trong sản xuất và chất lượng sản phẩm ngày nay Ngày nay, sự hiểu biết về acid amin và protein nói chung, collagen cũng như gelatin nói riêng ngày càng nhiều Thêm vào đó là những tiến bộ trong kĩ thuật đã giúp sản phẩm collagen đạt an toàn vệ sinh, chất lượng theo tiêu chuẩn quốc tế và yêu cầu nghiêm

ngặt của các yếu tố kĩ thuật

1.1.3 Nguồn gốc thu nhận Collagen

 Trong những năm trước đây, để đáp ứng nhu cầu trong công nghiệp, collagen được trích ly chủ yếu từ da, xương của các loài gia súc và lợn Khoảng thời gian gần đây, sự bùng phát của các loại bệnh truyền nhiễm như bệnh bò điên (Bovine Spongiform Encephalopathy – BSE, Tranmissible Spongiform Encephalopathy – TSE) và bệnh lở mồm long móng (Food and Mouth Disease – FMD) ở lợn và gia súc đã hạn chế phạm vi sử dụng của collagen có nguồn gốc từ những loài động vật trên bởi vì những bệnh truyền nhiễm có khả năng lây truyền sang con người thông qua các mô của động vật Bên cạnh đó, ở một số quốc gia, collagen trích ly từ lợn không được sử dụng vì rào cản tôn giáo Với những nguyên nhân trên, các nhà khoa học đang tập trung vào các nghiên cứu của họ để tìm ra những nguồn collagen thay thế Da, xương, vây, vảy của cả những loài cá nước ngọt, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa, cá biển, da gà, da ếch, da mực,…có thể được sử dụng như những nguồn thay thế

 Trong số những nguồn thay thế, cá cung cấp một nguồn nguyên liệu thô tốt nhất vì:

- Dễ tìm, sẵn có để sử dụng

- Không có sự lây truyền bệnh

- Không gặp phải trở ngại về mặt tôn giáo

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 4

- Có khả năng thu được collagen với hiệu suất cao

Khoảng 70% tổng trọng lượng cơ thể của cá bị bỏ đi dưới dạng các phế phẩm như

da, xương, vây, đầu, vảy, ruột,…trong suốt quá trình chế biến Việc tận dụng những chất thải này có thể nâng giá trị kinh tế của các loài cá lên

 Dựa vào thành phần % của tổng lượng collagen tính trên tổng lượng protein, các loài cá được chia thành 3 nhóm:

− Nhóm có hàm lượng collagen thấp: tổng lượng collagen chiếm đến 5 % so với tổng lượng protein

− Nhóm có hàm lượng collagen trung bình : tổng lượng collagenchiếm từ 5 ÷ 10 % tổng lượng protein

− Nhóm có hàm lượng collagen cao: tổng lượng collagen trên

10 % tổng lượng protein

Thịt của những loài cá khác nhau chứa hàm lượng khác nhau của collagen hòa tan trong acid (acid soluble collagen) và collagen không hòa tan (insoluble collagen) Hàm lượng collagen tổng cộng dao động từ 0,3 ÷ 2,99 % so với trọng lượng tươi của các mô, tương ứng với phạm vi từ 1,58 ÷ 13,39 % so với tổng lượng protein

Bảng 1.1 Thành phần collagen trong thịt cá

Loại cá Collagen hòa tan trong acid

(so với trọng lượng tươi) (so với trọng lượngtươi)Collagen không hòatan (so với trọng lượngtươi)Collagen tổng (so với protein tổng)Collagen tổngCá chim

Cho đến nay, hầu hết các loại mỹ phẩm trên nền collagen đều có chứa protein chiết xuất từ gia súc Bởi sự bộc phát của bệnh bò điên BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy – mad cow disease), collagen từ gia súc đang dần rút khỏi phạm vi sử dụng, thay vào đó là nguồn collagen được trích từ cá, đặc biệt là cá da trơn: cá tra, cá ba sa Nguồn collagen được chiết tách từ nguồn nguyên liệu này có nhiều đặc điểm tốt hơn cho việc ứng dụng trong thực phẩm, y học và mỹ phẩm Trong công nghệ sản xuất mỹ phẩm, mỹ phẩm trên nền collagen từ gia súc có tốc độ hấp thụ rất chậm trên da người Đối mặt với vấn đề này, liệu pháp tiêm collagen vào da được giới thiệu Tuy nhiên, những bất lợi của cách thức này là đắt tiền, đau đớn và đi kèm với nó là những rủi ro nguy hiểm cho con người Hiện nay, các nhà khoa học Phần Lan đã phát triển một tiến trình trích ly collagen từ cá Không giống với những loại collagen thu được từ những phương pháp trước đây, collagen từ cá được hấp thụ hoàn toàn trên da người Vì cá sống trong phạm vi rộng lớn với các điều kiện về nhiệt độ,

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 6

độ sâu và áp suất khác nhau Điều này có nghĩa là collagen trích từ da cá có một sức chống chịu đặc biệt với các phá hủy lý và hóa học

Đối với các thuốc hay thức uống có chứa collagen, collagen từ cá cũng được chứng minh là có tốc độ hấp thụ vào máu nhanh hơn gấp 1,5 lần so với collagen từ lợn

Hình 1.1 Đồ thị so sánh khả năng hấp thụ vào máu của collagen

trích ly từ cá và từ lợn

 Việt Nam là một nước đang phát triển, có nền nông nghiệp với các sản phẩm phong phú Trong đó, các sản phẩm từ cá chiếm một phần lớn trong kim ngạch xuất khẩu Những năm gần đây, việc nuôi cá da trơn : cá tra, cá ba sa rất phát triển, đặc biệt ở Đồng bằng sông Cửu Long Trong quá trình chế biến cá, song song với những chính phẩm dùng cho việc xuất khẩu (chủ yếu là fillet) là một khối lượng lớn các phụ phẩm như da, xương, vây,… Đây là những nguồn giàu collagen, có thể sử dụng thay thế cho những nguồn cung cấp

So sánh khả năng hấp thụ vào máu giữa collagen từ cá và

Collagen cổ điển như da, xương từ lợn, bò Việc tận dụng những nguồn này sẽ góp phần làm tăng giá trị kinh tế của các loài cá da trơn ở nước ta

1.2 CẤU TẠO COLLAGEN

1.2.1 1.2.1 Thành phần hóa học của Collagen [1]

 Thành phần protein trong collagen có gần đầy đủ các loại acid amin, bao gồmtất cả 20 loại acid amin ( Schrieber và Gareis,2007) Thành phần acid amin có thể thay đổi tùy theo nguồn gốc của collagen, nhưng vẫn tồn tại một vài tính chất chung và duy nhất cho tất cả collagen

Trong thành phần collagen không chứa cystein và trytophan, nhưng chứa một lượng lớn glycine (Gly), chiếm khoảng 33% và proline (Pro), chiếm tỉ lệ 12% và hydroxyproline (Hyp), chiếm tỉ lệ 22% (Theo Balian và Bowes 1977) Collagen là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine (Hyl), ngoài ra trong thành phần Collagen còn chứa khoáng, chiếm tỉ lệ 1%

Bảng 1.2 So sánh thành phần các acid amin trong collagen và các loại protein khác (số gốc/1000 gốc)

 Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có Hydroxyproline được hình thành sau quá trình điều chỉnh proline khi được kết hợp vào vị trí Y trong chuỗi Gly-X-Y Hydroxyproline có công thức phân tử là C5H9NO3, khác với proline, trong công thức cấu tạo của Hyp có gắn nhóm OH nằm ở vị trí cacbon gamma, acid amin này có vai trò quan trọng trong sự ổn định cấu trúc của collagen, là dẫn xuất của proline trong quá trình hình thành chuỗi collagen có sự xúc tác của enzyme hydroxylase proline và sự có mặt của Vitamin C để giúp bổ sung thêm Oxy, thiếu vitamin C sẽ làm chậm quá trình tổng hợp hydroxyproline, ảnh hưởng đến quá trình xây dựng cấu trúc protein gây ra những rối loạn trong cơ thể.

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của hydroxyproline

 Phân tử collagen bao gồm 3 chuỗi xoắn lại với nhau tạo thành collagen helix tạo thành cấu trúc 3D- một mô hình lý tưởng cho các liên kết hydro giữa các chuỗi ( Te Nijenhuis, 1997) Mỗi chuỗi trong triple- helix quay theo chiều kim đồng hồ Triple-helix dài xấp xỉ 300nm và chuỗi có khối lượng phân tử khoảng 105 kDa (Papon, Leblon và Meijer, 2007) Triple-helix được ổn định bởi liên kết hydro nội giữa các chuỗi Trong cấu trúc phân tử collagen, do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen Sự biến tính collagen làm cho các cầu nối bị tách một phần hoặc hoàn toàn gây nên sự tách rời các chuỗi do phá hủy các liên kết hydro, chính điều này làm mất đi cấu trúc triple-helix Mô hình

triple-“ triple-helice” của collagen dựa trên những nghiên cứu về hiện tượng nhiễu xạ sợi Chuỗi nhiễu xạ sợi thể hiện trên mức trung bình của toàn bộ phân tử collagen , và mô hình đặc trưng thể hiện đó là sự sắp xếp lặp đi lặp lại của các chuỗi polypeptid, thông thường là Gly-Pro-Hyp

 Một đặc điểm đặc trưng của collagen là sự sắp xếp đều đặn của các amino acid trong mỗi mắt xích của từng chuỗi xoắn ốc collagen này Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptid nối với nhau giống như sợi dây thừng Cấu trúc của collagen tương tự như hình xoắn ốc, mỗi một chuỗi polypeptid trong collagen được cấu tạo từ các acid amin theo một trật tự, thông thường là Gly – Pro – Y, hoặc Gly – X – Hyp

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 10

Hình 1.3 Trình tự sắp xếp các acid amin trong phân tử Collagen

Trong đó X, Y là những đơn vị aminoacid khác nhau, có thể là proline (Pro) và hydroxyproline ( Hyp) chiếm khoảng 1/6 chiều dài chuỗi Glycine chiếm gần 1/3 trong tổng số các amino acid và nó được phân bố một cách đều đặn tại vị trí mỗi 1/3 xuyên suốt trong phân tử collagen Do glycine có các nhánh phụ nhỏ nhất nên sự lặp lại của nó cho phép các chuỗi polypeptide kết hợp chặt chẽ với nhau hình thành nên một đường xoắn ốc với khoảng trống nhỏ ở phần lõi Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline và glycine đã chiếm ½ chuỗi Collagen Các acid amin còn lại chiếm ½

Bảng 1.3 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide

hoặc disaccharide glucosylgalactose, liên kết với phần dư hydroxylysine thông qua nhóm hydroxyl chức năng của amino acid Tỷ lệ của mono/disaccharide phụ thuộc vào loại collagen và tình trạng sinh học Chức năng của các đơn vị carbohydrate vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ, nhưng ảnh hưởng của chúng trong việc gắn kết phần bên phân tử collagen hình thành nên sợi và bán kính của sợi đang được nghiên cứu

Ngoài ra, trong phân tử collagen có những vùng gồm khoảng 9 ÷ 26 amino acid tại các điểm đầu mút amino hay carboxyl của chuỗi Các vùng này không sáp nhập với cấu trúc xoắn ốc và được gọi là telopeptide

1.2.2 Cấu trúc phân tử Collagen [1]

 Phân tử collagen là một protein hình trụ, có cấu trúc bậc 4, do các đơn vị tropocollagen cấu trúc bậc 3 tổ hợp theo các hướng dọc và ngang làm collagen có nhiều mức cấu trúc Đơn vị cơ bản của collagen là “Tropocollagen”, liên kết với nhau tạo thành những sợi nhỏ Tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1.5nm, gồm ba sợi polypeptide (còn gọi là 3 chuỗi α) cuộn lại với nhau, mỗi chuỗi α

cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn, hay còn gọi là proline I ( xoắn trái với 3.3 gốc aminoacid/ vòng, liên kết peptid có hình thể cis ),

ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba xoắn ốc (triple helix) hay còn gọi là proline II ( xoắn trái với 3 gốc aminoacid/ vòng, liên kết peptid có hình thể trans), khoảng cách giữa hai gốc tính từ hình chiếu của chúng lên các trục là 0,31nm Hai cấu trúc này có thể chuyển đổi cho nhau và thường thì dạng II trong môi trường nước thì bền hơn

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 12

Hình 1.4 Cấu trúc của Tropocollagen ( triple helix )

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc liên kết với nhau bằng các liên kết ngang tạo thành các sợi theo chu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67nm và có 1 khoảng trống 40nm ở giữa những phân tử liền kề nhau Nhờ vào cấu trúc có trật tự, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học riêng Vì thế collagen rất chắc, dai và bền

Hình 1.5 Liên kết ngang giữa các phân tử Tropocollagen

Các tropocollagen sẽ liên kết ngang với nhau theo kiểu cộng hóa trị và chính nhờ vào liên kết này mà các phân tử tropocollagen hình thành nên sợi collagen Các sợi collagen rất dài và mảnh, chúng sắp xếp tạo thành mạng collagen

Hình1.6 Cấu trúc của procollagen và sự chuyển từ procollagen sang tropocollagen

Các bước hình thành nên collagen:

 Bước 1: Tổng hợp chuỗi alpha, giai đoạn trước procollagen trên riboxom và trong mạng lưới nội chất

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 14

 Bước 2: Sự tổ hợp 3 chuỗi alpha hình thành procollagen.

− Sự hình thành cầu nối disulphide giữa các phần của chuỗi polypeptide tại đầu C-

− Ba chuỗi alpha liên kết lại, hình thành chuỗi xoắn ốc, tạo procollagen

 Bước 5: Quá trình tự sắp xếp của collagen phân tử hình thành nên sợi collagen

 Bước 6: Tạo các liên kết ngang giữa các phân tử collagen đứng cạnh nhau

Hình 1.7 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối

lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa Chuỗi α được cấu tạo bởi khoảng 1000 amino acid Các chuỗi α khác nhau (α1, α2 và α3) ở thành phần amino acid Sự phân bố của các chuỗi α1, α2 và α3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sự khác nhau về gene

1.2.3 Cấu trúc sợi của collagen [3]

 Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm những sợi mảnh, nhỏ Thông qua quá trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4 ÷ 8 phân tử collagen hoặc với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril) Những sợi này có đường kính từ 10 ÷ 500 nm tùy thuộc vào loại mô và giai đoạn phát triển Các sợi collagen sẽ thiết lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle)

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 16

Hình 1.8 Cấu trúc sợi của collagen

 Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen Các vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn Các sợi lớn hơn sẽ kết hợp với nhau tạo thành những bó sợi collagen Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức kết hợp và mức độ tập trung khác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặc tính khác nhau của mô

Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính chu kỳ nhất định Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một khoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau

Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang các sợi collagen, tạo cho các mô có được độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính

cơ học riêng biệt

Có vài liên kết bên trong mỗi chuỗi triple helix và một số lượng biến thiên các liên kết ngang giữa các chuỗi để hình thành nên những tổ hợp có trật tự (như sợi collagen) Các bó sợi lớn hơn được tạo nên nhờ vào sự trợ giúp của một vài loại protein (bao gồm những loại collagen khác nhau), glycoprotein và proteolycan để hình thành các loại mô

Chuỗi polypeptide

Phân tử collagen

Vi sợi Sợi

Bó sợi

khác nhau từ sự sắp xếp luân phiên của những thành phần trên Sự không hòa tan của collagen là một trở ngại cho việc nghiên cứu nó cho tới khi người ta phát hiện tropocollagen có thể được trích ly từ những động vật còn non do chưa xảy ra liên kết ngang hoàn toàn Tuy nhiên, sự phát triển của kỹ thuật hiển vi (Electron Microscopy (EM) và Atomic Force Microscopy (AFM)) và sự nhiễu xạ tia X đã cho phép các nhà nghiên cứu thu được những hình ảnh chi tiết về cấu trúc của collagen Những tiến bộ này có ý nghĩa quan trọng trong việc hiểu được cách thức mà collagen tác động lên mạng lưới tế bào, sự xây dựng, phát triển, phục hồi, thay đổi của mô trong quá trình phát triển.

Hình 1.9 Sự sắp xếp của phân tử collagen trong một sợi

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 18

1.3 PHÂN LOẠI COLLAGEN [4]

 Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng.Chúng được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen Họ collagen được phân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử Sự phân bố trong các mô của những loại protein khác nhau thể hiện tính đa dạng và phạm vi đáng chú

ý, từ những loại collagen riêng biệt như collagen II, X có trong sụn đến những loại collagen dạng sợi phân bố rộng khắp như collagen I và V Những loại collagen khác nhau thực hiện những chức năng chuyên dụng trong các mô và có phương thức sắp xếp riêng biệt của các siêu phân tử Một số loại được cấu tạo từ một tam phân (homotrimer), trong khi đó những loại khác được cấu tạo từ nhiều tam phân Loại collagen phong phú nhất là những collagen dạng sợi hình thành những nền tảng cấu trúc của da, gân, xương, sụn và những loại mô khác

Hình 1.10 Một vài dạng sinh học của collagen

Dựa theo cấu trúc và cách tổ chức sắp xếp các phân tử trong chuỗi, collagen được phân chia thành 7 nhóm chính : collagen dạng hình sợi, FACIT collagen, collagen dạng mạng, collagen dạng giữ chặt, collagen chuyển màng, collagen màng nền và các loại collagen có chức năng duy nhất khác Những loại collagen này khác nhau về chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn ốc

Bảng 1.4 Phân loại và vị trí phân bố các loại collagen

Collagen dạng sợi

chằng, giác mạc,

lưới sọi của cá mô( phổi, gan, lách,

xương,

XI α1(XI)α2(XI)α3(XI) Sụn, thủy tinh thể,

biểu bì - da, niêm mạc miệng, Dạng mạng lưới lục

FACIT collagen

FACIT collagen

máu, phổi, cơ vân,

con người

phôi da, xương ức sụn, gân,

Collagen chuyển

màng

ruột, sụn bào, phổi, gan,

biểu bì – da,

té bào cơ trơn, thận,

tụy,

phiến keratin,

Collagen loại I là phổ biến nhất và thường ở trong các mô liên kết như da, xương, gân Collagen loại II hầu như tồn tại ở các mô sụn Collagen loại III lại phụ thuộc rất lớn vào độ tuổi của động vật, da heo còn trẻ chứa tới 50%, theo thời gian tỷ lệ này giảm 5÷ 10% Những loại colagen khác chỉ hiện diện với lượng rất nhỏ và chỉ ở một vài cơ quan đặc biệt

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV Những bệnh tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp, sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình thường

1.3.1 Collagen dạng sợi

Collagen dạng sợi cổ điển bao gồm các loại I, II, III, V, XI Những loại collagen này có khả năng kết hợp tạo thành một tổ hợp cấu trúc siêu phân tử được định hướng cao, đó là chuỗi sợi so le bậc 4 với đường kính từ 25 – 400nm Dưới kính hiển vi điện tử, những sợi này được xác định bởi một mô hình đặc trưng với một dải chu kỳ khoảng 70nm ( được gọi là chu trình D) dựa vào sự sắp xếp so le của mỗi đơn phân collagen riêng biệt

 Loại I Collagen loại I là collagen chiếm thành phần và được nghiên cứu nhiều

nhất Nó chiếm hơn 90% khối lượng của xương và là thành phần chính của mô liên kết trong gân, da, dây chằng, giác mạc, chiếm thành phần rất ít trong sụn, thủy tinh thể,

Cấu trúc triple_helix của collagen loại I bao gồm hai chuỗi xoắn α1 giống hệt nhau và một chuỗi α2 Trong cơ thể sinh vật, hầu hết chuỗi xoắn α3 được kết hợp vào hỗn hợp có chứa loại III collagen ( có trong da và lưới sợi) hoặc loại IV collagen ( có trong xương, gân và giác mạc) Trong hầu hết các cơ quan đặc biệt là trong gân, collagen loại I có chức năng tạo nên độ giãn, chắc Trong xương, nó tham gia xây dựng cấu trúc của xương, đảm bảo khả năng chịu tải trọng, độ cứng chắc của xương

 Loại II

Collagen loại II là thành phần đặc trưng và chiếm hàm lượng cao trong sụn trong suốt Tuy nhiên, hàm lượng collagen loại II này ngày càng chiếm tỉ lệ lớn trong tổng số collagen ( khoảng 80%) khi được tìm thấy trong các cơ quan như : thủy tinh thể, các biểu mô giác mạc, dây sống, Cấu trúc triple_helix của collagen loại II được đặc trưng bởi ba chuỗi

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 22

xoắn α1 hình thành một phân tử “ homotrimeric” tương tự nhau về kích thước và cả chức năng sinh học như của collagen loại I.

Những sợi collagen khác trong sụn đóng vai trò kết hợp với collagen loại II, cũng như loại XI và IX nhằm để giới hạn đường kính trong khoảng từ 15 – 50nm Khác với collagen loại I , chuỗi xoắn collagen loại II chứa hàm lượng hydrolysine khá cao, cân bằng nồng độ của proteoglycan – một thành phần đặc trưng ở dạng ngậm nước của sụn trong suốt

 Loại III

Giống như loại II, collagen loại II cũng được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1 Collagen loại III được phân bố rộng rãi trong các mô ngoại trừ xương Nó là thành phần quan trọng của những sợi lưới trong các mô hở ở phổi, gan, lá lách, Phân tử “Homotrimeric” thường kết hợp với collagen loại I tạo thành một thành phần phong phú trong các mô đàn hồi

Bảng 1.5 Sự phân bố acid amin của 3 chuỗi α trong collagen loại I và loại III

α1 ( loại I) α2 ( loại I) α1 ( loại III)

Theo những nghiên cứu trước đây cho thấy, collagen loại V là một hình thức đặc thù của collagen loại I và loại III ở trong xương, giác mạc và nằm xen kẽ trong cơ bắp, gan , phổi Collagen loại XI cũng phân phối rộng trong cơ sụn như loại II Một lượng lớn phía cuối đầu amino non- collagen của chúng chỉ được tổng hợp một phần và sự hợp nhất của hai loại collagen để tạo thành cấu trúc “heterotrimer” được cho là để kiểm soát khả năng lắp ráp, sinh trưởng và đường kính của chúng Kể từ đó, cấu trúc triple helix được cho là một màn che trong các mô, chúng được đặt ở trung tâm hơn là trên bề mặt Do vậy, collagen loại V có chức năng như là một cấu trúc sợi cốt lõi cùng với loại I và III xung quanh trục trung tâm Tương tự như mô hình này, collagen loại XI được cho hình thức cốt lõi của những sợi collagen loại II.

1.3.2 “Fibril – Associated Collagens with Interrupted Triple helices”:FACIT

collagen

Cấu trúc cơ bản của những loại collagen này được đặc trưng bởi những phần thuộc collgen bị gián đoạn bởi những chuỗi ngắn không xoắn và những phân tử “ trimer” hóa có liên quan đến bề mặt của các sợi khác nhau

 Loại IX

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 24

Collagen loại IX được phân bố trong sụn và thủy tinh thể như collagen loại II Collagen này thuộc loại “ heterotrimeric”, cấu trúc bao gồm 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau tạo thành ba đoạn xoắn hai bên hình cầu Phân tử collagen loại IX được đặt dọc theo bề mặt của sợi collagen loại II theo hướng đối song với nhau Sự tương tác này được ổn định bởi liên kết cộng hóa trị từ lysine đến đầu amino của collagen loại II

 Loại XII và XIV

Collagen loại XII và loại XIV có cấu trúc gồm 3 chuỗi xoắn α1 kết hợp với nhau, các loại collagen này được phân bố chủ yếu trong xương da, gân phổi, thành mạch máu, cũng như collagen loại XIX và XX, chức năng của các collagen này vẫn chưa dược tìm hiểu rõ

1.3.3 Collagen vi sợi

Collagen loại VI được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α1, α2 và α3 khác nhau với cấu trúc xoắn mở rộng và kéo dài dạng hình cầu Chuỗi xoắn α3 gần như là dài gấp đôi các chuỗi khác vì chiều dài đầu amino và cacboxyl khá lớn Những sợi ban đầu kết hợp bên trong tế bào theo hướng đối song với nhau, từng cặp chồng chéo lên nhau, sau đó sắp xếp bốn phần song song nhau Trong mạng lưới ngoại bào, chúng tập hợp thành những tổ hợp sợi và hình thành mạng lưới vi sợi độc lập trong hầu hết các mô liên kết, ngoại trừ trong xương

1.3.4 Collagen chuỗi ngắn

Collagen loại X là thành phần đặc trưng của sụn trong xương sườn, xương sống,…, nó được tạo thành từ 3 chuỗi xoắn α3 giống nhau, cấu trúc mạng lưới hình lục giác với đầu cacboxyl lớn và đầu amino ngắn Chức năng của collagen loại X vẫn chưa được tìm hiểu sâu, các nhà nghiên cứu vẫn đang thảo luận về vai trò của nó trong quá trình hóa xương sụn và vôi hóa

Collagen loại VIII có cấu trúc giống như collagen loại X nhưng có sự phân phối khác biệt nhau, vì thế mà chức năng của nó cũng khác Quá trình hình thành mạng lưới trong collagen này được thực hiện bằng các nội mô tế bào hình thành nên cấu trúc hình lục giác

1.4 TÍNH CHẤT CỦA COLLAGEN

Collagen là một protein cấu trúc Chính vì vậy collagen cũng có đầy đủ các tính chất hóa lý của một protein

1.4.1 Tác dụng với nước

 Collagen không hòa tan trong nước mà nó hút nước để nở ra, nguyên nhân là do tương tác giữa các mạch polypeptide làm cho phân tử có những vùng kỵ nước và vùng phân cực mang điện tích sẽ tạo nên khả năng háo nước làm trương nở collagen Cứ 100g collagen khô có thể hút được khoảng 200g nước Collagen kết hợp với nước nở ra trong nước, độ dày tăng lên chừng 25% nhưng độ dài tăng lên không đáng kể, tổng thể tích của phân tử collagen tăng lên 2 – 3 lần

 Do nước phân cực tác dụng lên liên kết hydro trong liên kết phối trí của collagen làm giảm tính vững chắc của sợi collagen từ 3 – 4 lần Khi nhiệt độ tăng lên cao, tính hoạt động của mạch polypeptide tăng mạnh, làm cho mạch bị yếu và bắt đầu đứt thành những mạch polypeptide tương đối nhỏ Khi nhiệt độ tăng lên trong khoảng 60 – 650C collagen hút nước bị phân giải Nhiệt độ phân giải của collagen trong nguyên liệu chưa xử lý tương đối cao Khi nguyên liệu đã khử hết chất khoáng, thì nhiệt độ phân giải của nguyên liệu sẽ giảm xuống

1.4.2 Tác dụng với acid và kiềm

Collagen có thể tác dụng với acid và kiềm, do trên mạch của collagen có gốccarboxyl và amin Hai gốc này quyết định hai tính chất của nó Trong điều kiện có acid tồn tại, ion của nó tác dụng với gốc amin, điện tích trên carboxyl bị ức chế (hình thành acid yếu có độ ion hóa thấp) Trái lại gốc amin bị ion hóa tạo NH3+

Môi trường H+

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 26

NH3 +

…Cl

NH3 +

…Cl-

NH3 +…Cl-

ra acid và kiềm có thể làm cho collagen biến đổi như sau:

 Cắt đứt mạch muối (liên kết giữa –NH3+…COO-) làm đứt mạch peptide trong mạch chính

 Làm đứt liên kết hydrogen giữa gốc –CO…NH– của mạch xung quanh nó

COONH3 + +H

 Làm acid amin bị phân hủy giải phóng amoniac.

Cùng với những biến đổi đó, điểm đẳng điện của collagen hạ xuống thấp, (vì những biến đổi đó mang tính chất thủy phân làm cho các nhóm gốc có tính hoạt động tăng lên nhiều)

Acid và kiềm đều có thể phân hủy collagen, nhưng sự phân hủy của collagen cho tới nay vẫn chưa có khái niệm chính xác Để biểu thị sự biến đổi chính xác của collagen dưới tác dụng của acid, kiềm nói chung đều dùng độ keo phân giải làm chỉ tiêu Độ keo phân giải là chỉ số keo sinh thành sản phẩm có thể tan trong nước (thường là trong điều kiện đun nóng), những sản phẩm này dưới nồng độ tương ứng tiến hành làm lạnh có thể biến thành keo

Theo kết quả nghiên cứu tác dụng của vôi đối với collagen có thể làm tăng độ phân giải của nó rất mạnh, trong điều kiện nhiệt độ thường thời gian dài có thể xúc tiến sự phân giải của collagen (tùy độ phân giải của nó rất thấp) lúc nhiệt độ tăng lên hoặc xử lý bằng kiềm thì độ phân giải tăng lên

Collagen phân giải biến thành gelatin, căn cứ vào giả thuyết của Hofmeister phản ứng sẽ tiến hành như sau:

( do độ điện ly của NaCl lớn hơn) Nhiều thực nghiệm cho thấy rằng tác dụng của trypsine đối với collagen đã xử lý ( như đun nóng, ngâm acid, kiềm , muối, tác dụng của pepsin, tác dụng cơ học, ) thì nó có tác dụng phân giải, với điều kiện thích hợp nhất là ở nhiệt độ 370C,

Sau khi bị biến tính Collagen thường có các tính chất sau :

 Độ hòa tan giảm do làm lộ các nhóm kỵ H2O vốn ở bên trong phân tử protein Tức là khi collagen chưa biến tính, các acidamin có các nhóm kỵ nước nằm bên trong phân tử collagen Khi bị biến tính, phân tử Collagen lúc này chỉ là trình tự sắp xếp các acidamin mạch thẳng, làm cho các nhóm kỵ nước lộ ra ngoài nên độ hòa tan cả collagen bị giảm đi

 Khả năng giữ nước giảm, cấu trúc bậc bốn giúp cho collagen có khả năng hydrat hóa tạo thành màng hydrat bao quanh Khi biến tính mất đi cấu trúc bậc bốn thì khả năng hydrat hóa không còn, vì thế nên collagengiữ õnước kém

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Hoạt tính sinh học ban đầu mất đi Điều này là hiển nhiên vì hoạt tính sinh học của một protein được quyết định bởi các cấu trúc bậc hai, bậc ba và bậc bốn Khi cấu trúc này mất đi, protein chỉ là các polypeptid, và không có hoạt tính sinh học

 Tăng độ nhạy đối với sự tấn công của enzyme protease do làm xuất hiện các liên kết peptide ứng với trung tâm hoạt động của protease

 Tăng độ nhớt hiện tại.

 Mất khả năng kết tinh, collagen có khả năng kết tinh trong các môi trường muối hoặc cồn Ở các điều kiện pH nhất định dung dịch collagen không bền và kết tinh gọi là pH đẳng điện Khi bị biến tính điểm đẳng điện của protein không còn và chúng khó có thể kết tinh

1.4.4 Tính kỵ nước

Do các gốc kỵ nước của acidamin trong chuỗi polypeptid của collagen hướng ra ngoài, các gốc này liên kết với nhau tạo liên kết kỵ H2O Độ kỵ nước có thể giải thích là do các acidamin có chứa gốc R-không phân cực nên nó không có khả năng tác dụng với nước Tính kỵ nước sẽ ảnh hưởng rất nhiều đến tính tan của collagen

1.4.5 Tính chất của dung dịch keo

Khi hòa tan protein thành dung dịch keo thì nó không đi qua màng bán thấm Hai yếu tố đảm bảo độ bền của dung dịch keo là :

 Sự tích điện cùng dấu của các protein

 Lớp vỏ hydrat bao quanh phân tử protein

Khi dung dịch keo không bền, sẽ có hai dạng kết tủa : kết tủa thuận nghịch và kết tủa không thuận nghịch

 Kết tủa thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein vẫn có thể trở lại trạng thái dung dịch keo bền như ban đầu

 kết tủa không thuận nghịch: sau khi chúng ta loại bỏ các yếu tố gây kết tủa thì protein không trở về trạng thái dung dịch keo bền vững như trước nữa

Dung dịch collagen có độ nhớt cao trong khoảng pH = 2 -5 , trong đó pH = 2 cho độ nhớt cao nhất, điều này giúp cho việc nghiên cứu, tách chiết collagen

1.4.6 Tính chất Hydrat hóa của collagen

Trong quá trình hydrat hóa, protein tương tác với nước qua các nối peptid hoặc các gốc R ở mạch bên nhờ liên kết hydro Nồng độ protein, pH, nhiệt độ, thời gian, lực ion, sự có

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 30

mặt của các thành phần khác là những yếu tố ảnh hưởng đến các phản ứng protein – protein và protein – nước Khi nồng độ protein tăng thì lượng nước hấp thụ tống số tăng, pH thay đổi dẫn đến thay đổi mức độ ion hóa và sự tích điện trên bề mặt phân tử Collagen, làm thay đổi lực hút và lực đẩy giữa các phân tử này và khả năng liên kết với nước

Khi nhiệt độ tăng thì khả năng giữ nước của Collagen giảm do làm giảm các liên kết hydro Ngoài ra, bản chất và nồng độ các ion gây ảnh hưởng đến lực ion trong môi trường và sự phân bố điện tích trên bề mặt phân tử Collagen nên cũng ảnh hưởng đến khả năng hydrat hóa Người ta nhận thấy có sự cạnh tranh của phản ứng giữa nước, muối và các nhóm ngoại của acid amin Khi nồng độ muối thấp, tính hydrat hóa của protein có thể tăng do sự đính thêm các ion giúp mở rộng mạng lưới protein Tuy nhiên khi nồng độ muối cao, các phản ứng muối – nước trở nên nổi trội hơn, làm giảm liên kết protein – nước và protein bị

“sấy khô”

1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ VÀ PHÂN TÍCH COLLAGEN

Có nhiều phương pháp đánh giá và phân tích collagen : phân tích độ nhớt, độ ẩm, hàm lượng tro, xác định khối lượng phân tử, vi sinh, phân tích thành phần protein trong collagen (Xác định tổng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl), phân tích thành phần axit amin

1.5.1 Phương pháp điện di trên gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) để xác định trọng lượng phân tử collagen

Điện di theo phương pháp SDS- PAGE của phương pháp của Kittiphattanabawon, Benjakul, Visessanguan, Nagai, Tanaka, (2005), sử dụng Buffer System là máy điện di đứng, loại mini- PROTEAN Tetra cell của hãng BIORAD

Mẫu collagen được hòa tan trong dung dịch acid acetic 0,5M đến nồng độ 2,5 mg/ml Chỉnh pH của dung dịch collagen bằng sodium phosphate 0,2 M đến giá trị pH 4,4 Sau đó, hòa dung dịch mẫu này vào hổn hợp chứa 1% SDS (sodium dodecyl sunfate) và urea 3,5M (pH 7,2), khuấy trộn liên tục ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp được ly tâm để loại bỏ tạp

chất không tan Dung dịch này được trộn theo tỉ lệ 1/1(v/v) với dung dịch đệm (0,5M tris-HCl,

Dung dịch collagen 0,03 % trong acetic acid 0,1N, được khuấy đều cho tan hết Tiến hành đo độ nhớt trong một bể điều nhiệt Nhiệt độ được gia tăng rất chậm khoảng

1oC/ph Bắt đầu đo ở 33oC và kết thúc ở 50oC Một phút lấy giá trị một lần

Độ nhớt của dung dịch collagen được xác định tương ứng ở các mức nhiệt độ Độ nhớt tương đối được tính như sau:

Trong đó:

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 32

ht: độ nhớt đo được tại mỗi mức nhiệt độ

hmax: độ nhớt lớn nhất

hmin: độ nhớt nhỏ nhất

Đường cong biến tính nhiệt được xây dựng bằng cách vẽ đồ thị độ nhớt tương đối theo nhiệt độ Nhiệt độ biến tính chính là nhiệt độ mà tại đó độ nhớt tương đối giảm đi một nửa

Hình 1.11 Đường cong biến tính nhiệt của 2 loại collagen thu được từ da cá và da lợn

trong axit axetic 0,1N và nồng độ collagen là 0,03%

1.5.3 Phân tích hàm lượng hydroxyproline

Hydroxyproline là một acid amin đặc trưng của collagen Chúng không có trong bất kỳ một loại protein nào khác, ngoại trừ một lượng nhỏ trong elastin Do đó, có thể định lượng collagen thông qua định lượng hydroxyproline và nhân với hệ số chuyển đổi 14,7 (Sadowska, Kolodziejska, & Niecikowska, 2003)

Quy trình xác định hydroxyproline được thực hiện theo phương pháp của Ignat’eva, Danilov, Averkiev, Obrezkova, Lunin, Sobol, 2005

Cấu trúc của hydroxyproline có chứa vòng pyrrolidine, nó có thể bị oxy hóa để hình thành vòng pyrrole Vòng pyrrole này tác dụng với tác chất Ehrlich, 4–(N,N– dimethylamino) benzaldehyde tạo thành hợp chất quinoid có màu (màu sắc phụ thuộc vào nhóm thế và thay đổi từ màu cam đến màu hoa cà) Thực hiện phương pháp so màu để tính hàm lượng hydroxyproline

1.5.4 Đo phổ hồng ngoại infrared (IR) spectroscopy.

Phổ hồng ngoại IR là một trong những kỹ thuật phổ được sử dụng rộng rãi nhất, là phương pháp đo độ hấp thụ của mẫu thử ở các bước sóng khác nhau của tia hồng ngoại Mục đích chính của việc phân tích phổ IR là xác định các nhóm chức hóa học có trong mẫu thử Những nhóm chức khác nhau sẽ hấp thụ những bước sóng riêng biệt Với nhiều thiết bị phụ tùng, máy phổ hồng ngoại có thể làm việc với nhiều dạng mẫu từ khí, lỏng đến rắn Phân tích phổ IR là một công cụ phổ biến và quan trọng để làm sáng tỏ cấu trúc và xác định các hợp chất

Hình 1.12 Phổ hồng ngoại collagen trong dung dịch axit

Collagen trên phổ hồng ngoại có thể thấy trên hình Nhóm amide A phát

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 34

hiện ở peak có cường độ 3330 cm-1, nhóm amide B được thấy ở peak có cường độ 3080 cm-1 Trên quang phổ còn thấy xuất hiện sự dao động của amide bậc I ở 1650 cm-1, amide bậc II ở

1545 cm-1 và amit bậc III ở 1237 cm-1 Cấu trúc của protein và amide bậc III chứng minh sự tồn tại của kết cấu có hình xoắn ốc (Surewicz và Mantsch, 1988, Muyonga, 2004)

CHƯƠNG 2: CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT COLLAGEN

Trong các công trình nghiên cứu, qui trình thu nhận collagen gồm 3 giai đoạn chính :

 Giai đoạn phá vỡ tế bào:

- Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, vì vậy cần phá vỡ cấu trúc tế bào để chuyển collagen vào dung dịch Các biện pháp được sử dụng có thể là các biện pháp cơ học như tiến hành ngiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, sau đó tiến hành đồng hóa (homogenizator) Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào nằm giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá vỡ

- Sử dụng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone kết hợp với các chất tẩy rửa Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào

 Giai đoạn tách chiết collagen:

- Sau khi phá vỡ cấu trúc tế bào, việc tách chiết collagen được tiến hành dễ dàng hơn, collagen có thể được chiết tách bằng acid hoặc bằng enzyme, quá trình tách chiết collagen được thực hiện trong các reactor ở nhiệt độ lạnh và trong điều kiện vô trùng, kết hợp khuấy trộn liên tục để đảm bảo collagen thu được có chất lượng tốt

 Giai đoạn tinh sạch collagen:

- Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại các thành phần này cần sử dụng các biện pháp khác nhau

- Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích Thẩm tích là sự khuyếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride ) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, ) Để loại các protein tạp có thể tiến hành kết tủa phân đoạn

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 36

bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ hay dùng các phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel,…

2.1 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

2.1.1 Qui trình chiết tách collagen từ da heo [6]

Da heo

Ngâm Cạo lông

Rửa

Loại béo

Nước

Ly tâm

Trích ly Kết tủa

Kết tủa lại

ĐAMH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS PHAN NGỌC HÒA

 Thuyết minh qui trình công nghệ :

Da heo sau khi thu nhận sẽ qua quá trình xử lý ngâm với dung dịch Na2SO4, sau đó tiến hành cạo lông rồi cho qua quá trình rửa với nước theo tỉ lệ H20 : da = 6 : 1(w/w) Tiến hành rửa lần 1 trong vòng 30 phút, sau đó rửa tiếp lần 2 và 3, mỗi lần được thực hiện trong vòng 20 phút, nhiệt độ 300C Quá trình rửa giúp loại bớt các tạp chất như phần thịt dư, máu, mỡ thừa, nhầy nhớt,… để chuẩn bị cho các quá trình tiếp theo

Sau khi tiến hành rửa với nước, da heo sẽ được loại béo bằng dung dịch isopropyl kết hợp với bổ sung chất hoạt động bề mặt không ion Tiến hành bổ sung chất hoạt động bề mặt 2 lần vào dung dịch chứa da heo và ngâm trong vòng 6h, trường hợp loại béo bằng dung dịch isopropyl ta tiến hành trong vòng 10h

Da heo sau khi được loại chất béo sẽ được trích ly bằng dung dịch NaOH 3% (w/v) và monomethylamine 1,9%(v/v) để tách chiết collagen, quá trình được tiến hành ở nhiệt độ

200C trong vòng 1 tuần để đảm bảo collagen có chất lượng tốt

Để kết tủa collagen vừa được trích ly ta dùng dung dịch acid HCl 5M Đến đây collagen thô đã được kết tủa, pH lúc này bằng 4,6 – 4,7 Để thu được collagen sạch ta tiến hành ly tâm lấy phần tủa hòa tan lại trong dung dịch dịch acid acetic 0.1M, quá trình được thực hiện ở 40C trong vòng 72h, tiến hành ly tâm lần nữa ta thu được collagen thành phẩm

 Những kết quả phân tích collagen trên da heo :

Kết quả cho thấy collagen được thu nhận từ da heo có cấu trúc chủ yếu gồm hai chuỗi α1 và α2 Ứng với mỗi chuỗi có 8 peptide khác nhau và những peptide này được phân tích giữa sự kết hợp trao đổi ion và sắc ký lọc gel để xác định thành phần các acid amin có trong mỗi chuỗi Kết quả cũng cho thấy chuỗi collagen được đặc trưng bởi vị trí và trọng lượng phân tử của các acid amin

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 38

Bằng các phương pháp xác định cho thấy collagen từ da heo có nhiệt độ biến tính ở

370C, nhiệt độ biến tính của collagen có liên quan đến các thành phần acid amin, đặc biệt là các thành phần proline, hydroxyproline, glycine Nhiệt độ biến tính này còn phụ thuộc vào điều kiện nhiệt độ môi trường sống động vật

2.1.2 Qui trinh chiết tách collagen từ gân chân gà [7]

Collagen thành phẩm

ĐAMH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: TS PHAN NGỌC HÒA

 Thuyết minh qui trình công nghệ :

Nguyên liệu là gân chân gà sau khi được cắt nhỏ được ngâm với dung dịch

CH3COONa để loại đi các protein hòa tan và các carbonhydrat trong thời gian 3 ngày Dung dịch thu được ta tiến hành trích ly để thu được collagen bằng cách bổ sung dung dịch đệm citrat 0,15M

Dung dịch sau khi trích ly được đem đi lọc để loại đi các tạp chất rắn khác, sau đó tiến hành thẩm tích dung dịch vừa thu được để loại đi các muối ra khỏi hỗn hợp để tinh sạch collagen

Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan ( protein, một số polysaccaride ) nhưng thấm đối với các dung dịch tinh thể ( các muối của hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp, ) Các tinh thể có thể khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo Trong khi đó, các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn

Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì dung dịch protein được cho vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm, thường là dùng các túi cellophan Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn, H20 hay lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng

Ở đây tác giả dùng dung dịch Na2HPO4 0,02M Vì màng cellophan là màng bán thấm có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua các dung dịch đệm loãng Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào dung dịch đệm loãng ( di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn dung dịch đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi

SVTH: VÕ THỊ HỒNG LINH Trang 40