nghiên cứu sản xuất pilot sinh khối spirulina giàu selen hữu cơ để làm thuốc

Các thông số sinh hóa và chống oxy hóa của hai nhóm NTN sau khi dùng thuốc Selen-sa: 98 3.4.4- Sự tương quan của Selen trong máu với các thông số chống oxy hóa của hai nhóm NTN trước và

UBND TP HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu ngày 06 tháng 3 năm 2012)

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT PILOT SINH KHỐI SPIRULINA GIÀU SELEN HỮU

CƠ ĐỂ LÀM THUỐC

Chủ nhiệm đề tài: ThS DS LÊ VĂN LĂNG

TP HỒ CHÍ MINH, tháng 4 năm 2012

Bảng quyết toán (giám định giai đoạn 1 & 2) VI

Mục lục (nội dung nghiên cứu - tiếp trang sau)

MỤC LỤC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Chương II: Nội dung nghiên cứu

11

2.1.2.1- Nuôi Spirulina platensis thu sinh khối giàu selen hữu cơ theo

pp labo.2006

11

2.1.2.4- Xác định Selen gắn hữu cơ trong protein 14

2.3.2.3- Khảo sát ảnh hưởng của sk tảo Spirulina giàu selen trên sự sinh

platensis giàu se

33

3.1.4- Định lượng selen trong Selen-sa bằng quang phổ hấp thu nguyên

3.1.6- Các nc thăm dò để nuôi tạo thế hệ Spirulina Fx tích lũy selen

hữu cơ cao

45

3.2.1.2- Khảo sát thời gian trộn nguyên liệu 64

3.3.3- Khảo sát ảnh hưởng của thuốc Selen-sa trên chức năng sinh sản

chuột

89

3.3.3.4 Trọng lượng chuột con 93

3.4.2- Các thông số sinh hóa và chống oxy hóa của hai nhóm NTN trước

khi dùng thuốc Selen-sa

96

3.4.3 Các thông số sinh hóa và chống oxy hóa của hai nhóm NTN sau

khi dùng thuốc Selen-sa:

98

3.4.4- Sự tương quan của Selen trong máu với các thông số chống oxy

hóa của hai nhóm NTN trước và sau khi dùng thuốc Selen-sa

các peroxide hữu cơ và vô cơ

nghiệm ở mô hình có ki

Neut Neutrophile Bạch cầu trung tính

phần

Spirulina algae biomass

Sinh khối tảo Spirulina giàu selen hữu cơ

Superoxid oxidoreductase enz

Men xúc tác quá trình phân hủy superoxid

Tảo Spirulina /

Spirulina platensis

DANH SÁCH BẢNG

nang

18

Spirulina

33

-sa 1%

38

cường độ dòng đo trên máy quét phổ sóng vuông SQF

Bảng 3.15 Phân tích tỷ lệ selen trong protein của Selen-sa 58

quản ở điều kiện phòng thí nghiệm

61

Bảng 3.21 Độ phân tán (CV %) của hàm lượng Selen-sa trong quá

Bảng 3.27 Độ đồng đều hàm lượng của 3 lô thuốc nang Selen-sa 25

Bảng 3.32 Liều khảo sát cho thử nghiệm độc tính cấp của Spirulina

giàu selen pha trong nước cất trên chuột nhắt trắng dùng đường uống

78

Bảng 3.34 Các chỉ số hồng cầu của chuột đực lô chứng và lô thử sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

80

Bảng 3.35 Các chỉ số hồng cầu của chuột cái lô chứng và lô thử sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

80

Bảng 3.36 Các chỉ số bạch cầu lô chứng và thử của chuột đực sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

81

Bảng 3.37 Các chỉ số bạch cầu lô chứng và lô thử của chuột cái sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

81

Bảng 3.38 Các chỉ số tiểu cầu lô chứng và lô thử chuột đực sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

82

Bảng 3.39 Các chỉ số tiểu cầu lô chứng và lô thử của chuột cái sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

83

Bảng 3.40 Các chỉ số sinh hóa tế bào gan và gan mật trên chuột đực

trong 2 tháng thử độc tính bán trường diễn

84

Bảng 3.41 Các chỉ số sinh hóa tế bào gan và gan thận của chuột cái

trong 2 tháng thử độc tính bán trường diễn

84

Bảng 3.42 Nồng độ BUN và Creatinin huyết thanh của chuột đực sau

2 tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

86

Bảng 3.43 Nồng độ BUN và Creatinin huyết thanh của chuột cái sau 2

tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

86

Bảng 3.46 pH tinh dịch, tỷ lệ sống, hình dạng bình thường của tinh

trùng

89

Bảng 3.48 Tỷ lệ trọng lượng trung bình tinh hoàn (TLTBTH) trên

trọng lượng trung bình chuột đực (TLTBC)

91

Bảng 3.49 Tỷ lệ trọng lượng trung bình buồng trứng (TLTBBT) trên

trọng lượng trung bình chuột cái (TLTB)

91

Bảng 3.51 Số lượng chuột con trung bình trong mỗi lần sinh của chuột

mẹ

93

được nuôi trong 30 ngày

93

Bảng 3.53 Thông số xét nghiệm sinh hóa của nhóm người bình thường

và nhóm bệnh nhân ĐTĐ type 2 trước khi dùng Selen-sa

96

Bảng 3.54 Thông số xét nghiệm chất chống oxy hóa của nhóm người

bình thường và nhóm bệnh nhân ĐTĐ type 2 trước khi dùng Selen-sa

97

Bảng 3.55 Thông số sinh hóa của nhóm người bình thường trước và

sau khi dùng Selen-sa

98

Bảng 3.56 Thông số chất chống oxy hóa của nhóm người bình thường

trước và sau khi dùng Selen-sa

99

Bảng 3.57 Thông số sinh hóa của nhóm bệnh nhân đái tháo đường

typ2 trước và sau khi dùng Selen-sa

99

Bảng 3.58 Thông số chất chống oxy hóa của nhóm bệnh nhân ĐTĐ

typ2 trước và sau khi dùng Selen-sa

100

nhân ĐTĐ typ2 và nhóm người bình thường sau khi dùng Selen-sa

101

Bảng 3.60 Kết quả thông số chống oxy hóa của nhóm bệnh nhân ĐTĐ

typ2 và nhóm người bình thường sau khi dùng Selen-sa

102

Bảng 3.61 Sự tương quan giữa Selen máu và SOD, GPx, TAS của

nhóm người bình thường trước và sau khi dùng Selen-sa

104

Bảng 3.62 Sự tương quan giữa Selen máu và SOD, GPx, TAS của

nhóm bệnh nhân ĐTĐ typ2 trước và sau khi dùng Selen-sa

105

Selen-sa

hữu cơ trong sinh khối Selen-sa

50

chuột cái sau 2 tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

83

(B) sau 2 tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn

84

tiếp (I) của chuột đực và chuột cái sau 2 tháng thử nghiệm

thử chưa phát hiện sự bất thường sau 2 tháng

87

nhóm người bình thường trước và sau khi dùng Selen-sa

103

nhóm người bình thường trước và sau khi dùng Selen-sa

103

nhóm người bình thường trước và sau khi dùng Selen-sa

103

nhóm người bình thường trước và sau khi dùng Selen-sa

104

PHẦN MỞ đẦU

1- TÊN đỀ TÀI: Ộ Nghiên cứu sản xuất pilot sinh khối Spirulina giàu selen hữu cơ

ựể làm thuốc ỖỖ

Chủ nhiệm đT: ThS.DS Lê Văn Lăng

Cơ quan chủ trì: đại Học Y Dược TP HCM

Cơ quan quản lý: Sở Khoa học & Công nghệ TP HCM

- Thời gian ựăng ký: tháng 11 năm 2007 ựến tháng 10 năm 2010,(CNSH )

_Theo Hợp ựồng ngày 21 tháng 11 năm 2007 và Phụ lục hợp ựồng NCKH, số

357 / Hđ-SKHCN, ngày 19 tháng 10 năm 2009

2- MỤC TIÊU CỦA đỀ TÀI

Tiếp theo nghiên cứu labo năm 2006, ựề tài này có các mục tiêu chắnh sau :

a- Xây dựng quy trình sản xuất pilot sinh khối Spirulina platensis giàu selen hữu cơ (Selen-sa): triển khai kết quả nghiên cứu labo sang mức pilot ở hồ ximăng diện tắch

75 mcg / g khô, vượt mức 50 mcg /g - mức ựã ựạt ở nc labo., năm 2006 đánh giá sự tương ựồng hoặc khác biệt giữa 2 quy mô labo và pilot, ựề xuất quy trình áp dụng nuôi ựại trà

b- Nghiên cứu hàm lượng Selen hữu cơ và các chỉ tiêu liên quan của sinh khối

Selen-sa ựể xây dựng tiêu chuẩn chất lượng ựáp ứng yêu cầu nguyên liệu làm thuốc mới c- Bào chế thuốc mới: là nang thuốc với liều dự kiến tương ựương 25mcg selen toàn phần, với công thức, quy trình bào chế và ựộ ổn ựịnh ựạt yêu cầu

d- Thử nghiệm dược lý: gồm thực nghiệm trên ựộng vật ựể xác ựịnh ựộc tắnh, liều lượng, ựộ an toàn của thuốc mới

e- Thử lâm sàng : dùng thuốc trên người tình nguyện thiếu selen trong máu, ựể ựánh giá bước ựầu về liều lượng, giá trị sinh học phòng trị bệnh và tắnh an tòan của thuốc mới

3- NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ MỨC đỘ THỰC HIỆN:

TT Các nội dung, công việc

1 Xây dựng quy trình kỹ

thuật pilot nuôi

Spirulina cho sinh khối

- đăng ký: Quy trình nuôi ngoài trời, hồ

xi-măng, có khả năng triển khai nuôi công nghiệp, năng suất sinh khối quy ựổi ~

Báo cáo giám ựịnh giai

giàu selen hữu cơ, với

hồ nuôi 10m2 ( 3.500 lit)

2 Phân tắch tỷ lệ selen hữu

cơ trong sinh khối

- đăng ký: Sinh khối Spirulina có hàm

lượng selen hữu cơ ựạt 50 Ờ 75 mcg / gam khô

- Kết quả: ựạt > 100 mcg/g, cao hơn mức dự

kiến trên

,,

3 Xây dựng tiêu chuẩn

nguyên liệu Spirulina

giàu selen hữu cơ (

Selen-sa )

- đăng ký: Bản tiêu chuẩn nguyên liệu

Spirulina giàu selen hữu cơ ( TC cơ sở )

- Kết quả: TC cơ sở ựã ựược Viện kiểm nghiệm thuốc thẩm ựịnh và cấp phiếu KN

,,

4 Triển khai sản xuất

nguyên liệu ựủ cho

nghiên cứu giai ựoạn 2

Báo cáo giám ựịnh giai

ựoạn 1, tháng 10 năm

2008

- đăng ký: dự kiến ựạt ~ 30 kg nguyên liệu

Selen-sa ựạt tiêu chuẩn cơ sở

- Kết quả: ựủ nguyên liệu cho bào chế pilot

- đã báo cáo

,,

5 Nghiên cứu công thức,

quy trình bào chế thuốc

mới Selen-sa

- đăng ký: Mẫu nang Selen-sa 25 mcg và

Bản Tiêu chuẩn thuốc thành phẩm và phương pháp kiểm nghiệm

- Kết quả: TC cơ sở thuốc nang Selen-sa 25

mcg ựã ựược Viện kiểm nghiệm thuốc thẩm ựịnh và cấp phiếu KN

- NC thêm nang Selen-sa 50 mcg

,,

6 Bào chế thuốc mới:

- Bào chế thử nghiệm mẻ

thuốc mới ựầu tiên và 3

lô ở pilot 10.000 capsule

và khảo sát thông số của

quy trình công nghệ

- đăng ký: mẫu thuốc mới, khỏang 40.000

capsule, ựạt tiêu chuẩn cơ sở

- Báo cáo ựộ ổn ựịnh của thuốc

- Kết quả: ựã thực hiện ựầy ựủ 2 nội dung

trên và chuẩn bị ựủ thuốc cho thử lâm sàng

- Kết quả: ựã thực hiện ựủ 2 nội dung trên

- Còn NC thêm 3 nội dung: khảo sát ựộc tắnh bán trường diễn ; ựặc tắnh chống oxy hóa ống nghiệm của Selen-sa ; sự hấp thu selen vào máu và nồng ựộ men Glutathion-Px

,,

trong máu ựộng vật trước và sau khi uống thuốc Selen-sa

8 - Nghiên cứu tác dụng

của thuốc mới trên lâm

sàng:

- đăng ký: Lập Hồ sơ ựăng ký thử nghiệm

thuốc trên lâm sàng giai ựoạn 1 theo Quy ựịnh của Bộ y tế Thử nghiệm lâm sàng trên

20 Ờ 30 người tình nguyện khỏe mạnh, thiếu selen trong máu

- Kết quả:

đã viết báo cáo như một hồ sơ tiền lâm sàng cho thuốc mới Selen-sa và trình bày trước Hội ựồng KHKT của BV Thống Nhất TP.HCM

Bệnh viện Thống Nhất TP.HCM ựã thực hiện Thử nghiệm lâm sàng với ựề tài NCKH cấp cơ sở Tiến hành trên 27 người tình nguyện khỏe mạnh và 25 người ựái tháo ựường typ 2 thiếu selen trong máu

Kết quả: ựã nghiệm thu kết quả NC ựề tài nc cấp cơ sở tại BV Thống Nhất TP.HCM: ựạt yêu cầu

Viết báo cáo nghiệm thu

4- SẢN PHẨM CỦA đỀ TÀI:

1 Báo cáo tổng kết (toàn

văn và tóm tắt)

Khoa học và ựầy ựủ nội dung Tài liệu,

ựĩa CD

2 Xây dựng quy trình kỹ

thuật pilot nuôi

Spirulina cho sinh khối

giàu selen hữu cơ

(Selen-sa)

- Quy trình nuôi ngoài trời,với hồ nuôi bằng xi-măng, diện tắch 10m 2

(~3.500 lit), kiểu nuôi liên tục, công thức môi trường nuôi có natri selenit, có khả năng triển khai nuôi công nghiệp, năng suất sinh khối quy ựổi khoảng 0,85kg / m 2

/ năm

,,

1 quy trình

Sản phẩm của dề tài (tiếp theo)

3 Sinh khối Spirulina giàu

selen hữu cơ

- Sinh khối Spirulina giàu selen hữu cơ (Selen-sa) ựạt ~50 -75 mcg / g sk khô

~ 30 kg

4 Bảng tiêu chuẩn chất

lượng của sinh khối

Spirulina giàu selen hữu

- đảm bảo các quy ựịnh của Bộ y tế về tiêu chuẩn nguyên liệu dược dụng ( hàm lượng selen hữu cơ ựạt 50 Ờ 75 mcg / gam sk khô, protein > 55%, ựịnh

Bảng Tiêu chuẩn cơ sở

cơ ( Tiêu chuẩn cơ sở

nguyên liệu Selen-sa )

tắnh beta-caroten, ), giới hạn kim loại nặng (chì, arsenic, ), ựộc tắnh

( không hoặc rất ắt ựộc )

5 Nghiên cứu công thức,

quy trình bào chế thuốc

mới Selen-sa :

- Mẫu nang Selen-sa 25 mcg

- Bản Tiêu chuẩn cơ sở và phương pháp kiểm nghiệm thuốc mới

- Mẫu nang Selen-sa 50 mcg (NC thêm)

1 quy trình

6 Bào chế thuốc mới:

Nang thuốc Selen-sa 25

,,

đã tiến hành

8 Bài báo khoa học - đăng trên tạp chắ chuyên ngành hoặc

hội nghị khoa học chuyên ngành

1-2 bài (ựã ựăng 2 bài)

9 đào tạo cán bộ chuyên

ngành

- Không ựăng ký

- Thực tế: ựã hướng dẫn 3 sinh viên làm khóa luận tốt nghiệp ựại học ( 2 dược sỹ, 1 bác sỹ ) và 1 làm luận văn cao học (chuẩn bị báo cáo)

Phụ lục

( xem cuốn 2- Các phụ lục)

Hợp ựồng NCKH giữa Sở Khoa học & Công nghệ TP HCM và đại Học Y Dược

TP HCM

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1- ðẶT VẤN ðỀ

Tảo Spirulina hay tảo xoắn xanh là tên thường dùng của vi khuẩn lam Spirulina

Sinh khối Spirulina có tác dụng bổ dưỡng, tăng cường miễn dịch do hàm lượng protein cao trên 55 % với các acid amin thiết yếu, nhiều vitamin, polysaccharid và

chất khoáng có ích,…Nhiều chế phẩm thuốc, thực phẩm ñược bào chế từ Spirulina

ñể phòng trị bệnh suy dinh dưỡng; lợi sữa cho người mẹ kỳ nuôi con ; hỗ trợ trị bệnh

viêm sơ gan, nhiễm trùng, béo phì,

Mặt khác, selen là một siêu vi lượng thiết yếu cho cơ thể người, với vai trò tham gia sinh tổng hợp các enzyme chống oxy hoá, giải ñộc, tăng cường miễn dịch và phòng bệnh tim mạch, chống lão hoá,…Hàm lượng selen trong máu người trung bình ~

0,15 mcg / ml Nhu cầu selen của người khoảng 15 - 70 mcg selen / ngày chủ yếu từ

thực phẩm, nước uống hay thực phẩm chức năng Khi bị các bệnh liên quan tới thiếu

selen, cần ñiều trị bằng thuốc uống hoặc tiêm với liều thường là 25 -100 ñến 200 mcg / ngày

Selen có thể dùng ở dạng muối vô cơ, nhưng selen hữu cơ, nhất là từ nguồn thiên nhiên ñược ưa chuộng hơn vì tính an toàn, ổn ñịnh nên dễ bảo quản và sử dụng

Do vậy, nếu có công nghệ sản xuất ñược sinh khối Spirulina giàu selen hữu cơ ở hàm lượng thích hợp thì sản phẩm sẽ có giá trị mới so với Spirulina thường - không chứa selen Nguyên liệu này ñược dùng ñể sản xuất thuốc phòng chống bệnh xơ vữa ñộng mạch - cao huyết áp, ñái tháo ñường, chống lão hoá, ung thư, nhiễm virus,…là những chứng bệnh có xu hướng tăng lên trong xã hội hiện ñại

1.2- TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI

- Ở nước ta qua 2 nghiên cứu cho biết, ở Hải phòng và Hà nội, năm 1982, selen trong máu sản phụ thấp hơn người bình thường 25-50 % Năm 2006 tại TP Hồ Chí Minh, phân tích máu 161 người tình nguyện thấy có 34 % người khoẻ mạnh thiếu selen và

7 người bị bệnh tim mạch thì ñều có mức thiếu selen ở mức nhẹ ñến trầm trọng ( 0,12 - 0,02 mcg / ml máu )

- Y văn thế giới chỉ ra tới 40 chứng bệnh ở người có liên quan tới thiếu hụt selen,

ñiển hình là bệnh như xơ vữa ñộng mạch gây cao huyết áp, viêm khớp, hoặc dễ

nhiễm khuẩn, thiếu máu, chậm phát triển ở trẻ em hoặc lão hoá nhanh ở người trung niên,…Những chứng bệnh trên có xu hướng tăng cao trong xã hội phát triển do vậy nhu cầu về chế phẩm loại này ở nước ta cũng tăng lên trong tương lai, vì Việt nam chắc không là ngoại lệ ðặc biệt, nếu ngành y tế tiến hành các chương trình giáo dục cộng ñồng về phòng ngừa các bệnh tim mạch, ung thư,…như nhiều nước phát triển thì nhu cầu của nhân dân về thuốc chứa selen sẽ phổ biến hơn

- Về công nghệ, nước ta chưa có công trình nghiên cứu hòan chỉnh ñể sản xuất nguyên liệu chứa selen và bào chế thuốc hoặc thực phẩm chức năng ñể phòng trị các bệnh do thiếu selen, mà vẫn phải nhập khẩu

Vì vậy, nghiên cứu hoàn chỉnh ñề tài ñể thuốc mới chứa Selen hữu cơ trong sinh khối tảo lam Spirulina có thể ñăng ký sản xuất, lưu hành theo quy ñịnh của ngành y

tế là cần thiết

- Sau khi hòan thành nghiên cứu, nếu kết quả tốt, nguyên liệu và thuốc mới sẽ ñược sản xuất công nghiệp, thì ñây có thể là công trình hòan chỉnh ñầu tiên của nước ta về nhóm thuốc Selen hữu cơ, gồm công nghệ sản xuất nguyên liệu và công nghệ bào chế thuốc thành phẩm, phục vụ nhu cầu trong nước, góp phần thay thế thuốc ngoại nhập

và có tiềm năng xuất khẩu

1.3- TỔNG QUAN :

1.3.1- Vai trò chính của selen trong y học:

Selen là siêu vi lượng thiết yếu ñối với con người, nên cần ñược cung cấp ñầy ñủ hằng ngày từ lương thực, thực phẩm, nước uống Selen trong cơ thể sống chủ yếu ñể tổng hợp enzyme glutathion peroxydase (GSH-Px), nên thiếu Selen dẫn ñến thiếu hụt GSH-Px, làm suy yếu hệ miễn dịch, giảm khả năng chống các gốc oxy hoá và ñộc tố,…Ở người bình thường, nồng ñộ selen trong máu khoảng 0,15 - 0,50 mcg / ml, tuỳ lứa tuổi và trạng thái sức khỏe

Có tới 40 chứng bệnh ở người liên quan tới thiếu hụt selen, ñiển hình như thiếu máu, chậm phát triển ở trẻ em ; xơ vữa ñộng mạch gây cao huyết áp, viêm khớp, hoặc chứng Alzheimer-suy giảm trí nhớ, rụng tóc, ung thư, lão hoá nhanh ở người trung niên,…

Trên thế giới, nhiều nước có khoa nghiên cứu y học cộng ñồng, giám sát sinh học cho nhân dân ( Citizen’s biomonitoring ) Qua ñó, biết ñược hàm lượng của nhiều vi chất, trong ñó có selen trong máu dân chúng từng vùng ở mức nào - thiếu, ñủ hoặc

dư thừa mà khuyến cáo người dân sử dụng chế phẩm selen một cách khoa học nhất

ñể phòng trị bệnh

Hiện thời thuốc chứa Selen còn dùng bổ sung trong phác ñồ trị bệnh nhiễm khuẩn, virus, ung thư và HIV-AIDS Selen còn ñược dùng ngoài da, trên tóc, trên kính áp tròng, do tác dụng kháng khuẩn chống viêm , trị gàu

*Các dạng selen dùng làm thuốc, thực phẩm dùng cho người:

nấm da, tóc,…

- Dạng selen hữu cơ thiên nhiên: gồm nguồn tự nhiên hoặc do nuôi trồng ñịnh hướng Hàm lượng selen trong lương thực, thực phẩm thường ở mức vết trong rau cải, khoai tây, lúa gạo, lúa mì, thịt, cá,…ñến khá cao: nấm bào ngư 0,18 mcg/g, tỏi 0,77 mcg/g,… Selen trong sinh vật sống có nhiều dạng: vô cơ, phức chất proteinat, polysaccharid và hơn 20 hợp chất trong cấu trúc của protein với nhiều chất có họat tính chữa bệnh như l-seleno-cystein , l-seleno-methionin, methyl seleno-cystein, Nguồn nuôi trồng: bổ sung muối selen vào môi trường dinh dưỡng khi trồng cây gia

vị - hành, tỏi…; cây thuốc - nhân sâm, nấm linh chi,…và nuôi vi sinh vật: men bia Saccharomyces, tảo Chlorella, Spirulina,

- Các hợp chất selen hữu cơ nhân tạo: Bán tổng hợp bằng các quy trình thích hợp ñể gắn ion selen vào cơ chất hữu cơ, tạo ra các phân tử họat tính kháng viêm, chống oxy

hóa như: ebselen, l-Seleno methionin, benzisoselenazolones, hoặc tạo các phức chất

chelat gắn vào protein, …hoặc tổng hợp hữu cơ : seleno-semicarbazon, selenouracil,…Các dạng Selen hữu cơ trên ñược ưa chuộng hơn selen vô cơ vì tính

propyl-2-an tòpropyl-2-an, dễ bảo quản, sử dụng

- Chế phẩm chứa selen và liều lượng: Gồm các dạng Viên nang, Viên nén, Viên nang

mềm, Thuốc nước, dùng theo ñường uống hoặc Thuốc tiêm với các hàm lượng 0,5 -

25-50 và 100mcg selen

*Liều lượng -Theo Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa kỳ (FDA), 2005:

- Liều hàng ngày - ( DRIs-Dietary Reference Intakes ): khoảng 15-70 mcg selen /

người / ngày Trong ñó, DRIs cho trẻ dưới 12 tháng tuổi là 15-20 mcg, từ 1-8 tuổi là 20-30 mcg, từ 9 -13 tuổi là 40 mcg, từ 14 tuổi ñến trưởng thành là 55 mcg và phụ nữ

có thai và cho con bú 60-70 mcg

- Liều bổ sung: tuỳ theo lượng selen có trong thực phẩm, nước uống từng vùng và

lứa tuổi,… mà xác ñịnh lượng selen bị thiếu hụt so với nhu cầu DRIs, ñể ñịnh liều selen cần bổ sung

- Liều trị bệnh: khi bị các bệnh liên quan do thiếu selen, cần ñiều trị với liều 25- 100

ñến 200 mcg selen / ngày, ở dạng thuốc uống hoặc tiêm

- Liều ñộc: liều vượt quá ngưỡng nhu cầu hàng ngày, kéo dài hoặc liều cao trên 400

ñến 900 mcg selen / người / ngày Ngộ ñộc cấp tính gây rối loạn vận ñộng, giảm thị

lực, tăng xuất tiết và chảy nước dãi, liệt cơ, nếu nặng có thể truỵ hô hấp, ngưng tim

và tử vong Ngộ ñộc mãn tính gây máu nhiễm kiềm, rụng lông, tóc, hơi thở có mùi tỏi, dị dạng móng tay, chân; giảm cân, mệt mỏi và có thể gây viêm gan Ngộ ñộc mãn tính hay xảy ra với người và ñộng vật ở những vùng có ñất cát, và rau quả, giàu selen nhât là nguồn nước uống chứa từ 0,5mcg/lit trở lên, hoặc công nhân khai mỏ

Mặt khác, selen cũng giúp cơ thể tăng khả năng giải ñộc, khử ñộc ñối với các ion có hại nhiễm từ môi trường không khí hoặc qua ăn uống như chì, thuỷ ngân, chất phóng xạ,…và bảo vệ da chống tia cực tím, làm ñẹp da

Về công nghệ sản xuất nguyên liệu:

Nhiều quốc gia sản xuất nguyên liệu natri selenit, natri selenat, seleno-methionin hoặc men Lactobacillus, men bia Saccharomyces giàu Selen, .như ở ðức, Hàn quốc, Nhật bản, Bungari, Nga, Pháp, Trung quốc,

- Hiện nay vẫn có nhiều công trình ựang tiến hành nhằm tìm kiếm họat chất mới cho nhóm organo-selen ựể sản xuất thuốc mới theo con ựường tổng hợp hóa học hoặc

sinh học Trong ựó nhiều nhất vẫn là các công trình nghiên cứu Spirulina platensis

giàu selen Chỉ riêng từ ựầu năm 2002 ựến nay ựã có trên 30 nghiên cứu sản xuất Spirulina giàu selen ựược công bố, cho thấy sự quan tâm rộng rãi của ngành công nghệ sinh học trên thế giới tới ựề tài này

Sản phẩm Selen trong sinh khối Spirulina (Selen-sa) thu ựược có 2 mức: mức sinh khối Spi chứa selen thấp và mức sinh khối Spirulina giàu selen, gấp hàng trăm lần

so với loại trên

Mức sinh khối Spi-selen thấp: ựã thương mại hóa ở một số nơi: Cyanotech ( USA ),

ựạt 0,4 mcg / g và Dainippon DIC ( Nhật ) ựạt 0,14 mcg / g

Mức sinh khối Spi giàu selen: nghiên cứu triển khai ở Mỹ ( 1999 ) ựạt 30 mcg / g, Trung quốc, đức ( Haung z., Zheng W., 2003 ), ựạt 267 mcg / g, ở Nga ( Gradova N.B., Shukhia E A., 2001-2003 ) ựạt 390 mcg / g,Ầ

- Chế phẩm: nang thuốc 400 mg Spirulina và 12,5 mcg Selen, Viên Spirulina-Selen

30 mcg Se, Viên nén Se-proteinat 25 - 50 và 100 mcg, nang mềm Selen-Vitamin E, vit.C,

Hai dẫn liệu trên cho thấy ở nước ta nhiều bệnh nhân cần ựiều trị hoặc bổ sung thuốc chứa selen ựể phòng trị một số chứng bệnh liên quan

Về nghiên cứu sản xuất:

- Năm 1965 nghiên cứu về selen trong thuốc đông Y và năm 1983, đàm Trung Bảo,

đặng Hồng Thuý ựã nghiên cứu tìm nguồn selen từ cây cỏ ựể làm thuốc và là tác giả ựầu tiên coi trọng việc sử dụng selen trong y học

- Từ 1992, đặng Hồng Thuý và đỗ Thu Huyền nghiên cứu tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng ựồng hóa selen

- Liên tiếp các năm 1992-96, 2001-03 và 2003-2006 các tác giả tại đH Dược khoa

Hà nội và Viện Công nghệ sinh học (Hà nội) ựã thực hiện ựề tài nuôi men bia Saccharomyces chứa selen Kết quả ựã thu ựược sinh khối chứa selen từ 400-1000mcg/g, tuy nhiên chưa thấy sử dụng làm thuốc như ựã có ở nước ngoài

- Trong văn bản hướng dẫn, ựịnh hướng các ựề tài nghiên cứu y dược năm

2003-2005, Bộ Y tế cũng có khuyến khắch các nghiên cứu sản xuất dược liệu giàu selen

- Tháng 8.2006, Sở Nông nghiệp & PTNT TPHCM phối hợp với Tập ựòan nông nghiệp Yoon Joong, Hàn Quốc hội thảo và thử nghiệm Quy trình nuôi cấy selen vào nấm linh chi

- Dược liệu chứa selen: tỏi, quả nhàu, nấm linh chi,Ầựược dùng làm trà thuốc, thực phẩm , Tuy nhiên, hàm lượng selen trong chúng rất nhỏ và không ựồng ựều, hoặc nếu chiết xuất selen thì giá thành ựắt do ựó không ựược coi là nguồn selen ựể làm thuốc Vậy, chỉ có thể giải quyết vấn ựề này bằng giải pháp, nhất là bằng công nghệ sinh học, sử dụng tiềm năng tổng hợp selen hữu cơ của vi sinh vật

- Thực tế, cho ựến nay nước ta vẫn chưa sản xuất ựược nguyên liệu selen vô cơ hoặc hữu cơ ựể làm thuốc mà vẫn còn nhập khẩu Các thuốc chứa Selen nhập vào nước ta như Saylom, Selchro (Hàn quốc), Selgapan (Nga), Belaf (đức), Nutrex (Hoa kỳ), Một số ựơn vị ựã nhập nguyên liệu selen ựể bào chế thuốc như C.Ty Dược đô Thành, CTy Dược Phú Yên

- Riêng các chế phẩm chứa Tảo / vi khuẩn lam Spirulina ựã ựược dùng ở nước ta khá phổ biến với công dụng bổ dưỡng cho người bệnh viêm gan, suy dinh dưỡng, và

ựược ca ngợi với nhiều mỹ từ như Ộchất bổ dưỡng của thế kỷ 21Ợ Việc nghiên cứu

sản xuất Spirulina giàu selen ựể tăng giá trị phòng trị bệnh của dược liệu này hiện

ựược tiến hành ở nhiều nước

Trên thực tế ựó, ựề tài ỘNghiên cứu nuôi vi khuẩn lam Spirulina giàu selen sinh

họcỖỖ do Sở KH & CN TPHCM cấp kinh phắ, ựược chúng tôi tiến hành trong 12

tháng, ựã nghiệm thu tháng 9 / 2006 Kết quả chủ yếu gồm:

- Xây dựng Quy trình kỹ thuật nuôi Spirulina platensis giàu selen hữu cơ (Selen-sa ):

Ở phòng thắ nghiệm, với môi trường chứa 50 ppm selen (50 mg selen / lit hay 109,45

thường

Mặt khác, với dòng S platensis qua nhiều thế hệ thắch nghi với môi trường selenit,

có thể thu ựược sinh khối Spirulina tắch luỹ selen từ 80 mcg / g ựến gần 450 mcg / gam Tuy nhiên những mẫu này thu ựược chưa ổn ựịnh và năng suất sinh khối thấp Kết quả này có thể so sánh với các nc ở Hoa kỳ, Nga, Brasil, Trung quốc,Ầ gần

ựây thu ựược sinh khối Spirulina giàu selen 267 Ờ 650 mcg / g và mở hướng mới ựể

chúng tôi nghiên cứu pilot nhằm thu sinh khối tắch lũy selen hữu cơ cao hơn nữa

- Nghiên cứu thành phần hoá học và xây dựng tiêu chuẩn chất lượng: sinh khối Spirulina giàu Selen hữu cơ ở mức 50 mcg / g, protein trên 55 % và một số chỉ tiêu khác ựã ựược ựề xuất, ựáp ứng yêu cầu của nguyên liệu làm thuốc

- Thử nghiệm ựộc tắnh và sinh khả dụng của sinh khối Spirulina giàu selen:

độc tắnh: cho thấy không có ựộc tắnh bất thường trong 48 giờ và bán cấp xảy ra khi

cho chuột nhắt trắng uống Selen-sa liều 50mcg selen / kg trong 21 ngày đặc biệt không phát hiện thấy ựộc tắnh ảnh hưởng tới công thức máu của ựộng vật thử

Sinh khả dụng: với liều uống 1 mcg selen / kg trọng lượng ựến 50 mcg selen / kg , ựã

nâng nồng ñộ selen trong máu chuột nhắt thiếu selen ( 0,03 - 0,08 mcg / ml máu ) lên 0,15 - 0,32 mcg / ml, bằng hoặc cao hơn mức bình thường theo chuẩn quốc tế là 0,15 mcg / ml

ðiều này chứng tỏ selen trong Spirulina giàu selen hữu cơ (Selen-sa) ñược ñộng vật

dung nạp tốt hay sản phẩm có sinh khả dụng khá mạnh, selen ñược hấp thu vào máu nhanh

Các kết quả trên là cơ sở tốt cho việc tiếp tục các nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất nguyên liệu từ pilot ñến công nghiệp và bào chế thuốc mới ðể thuốc mới

ñược ñăng ký, theo quy ñịnh của Bộ y tế, ñề tài cần phải hoàn thành nghiên cứu

dược lý thực nghiệm trên ñộng vật (tiền lâm sàng) ñể xác ñịnh liều lượng và ñộc tính, ñộ an toàn của chế phẩm trên ñộng vật và thử nghiệm lâm sàng thuốc mới trên người tình nguyện

CHƯƠNG II: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.1- Nội dung 1: Nghiên cứu quy trình pilot nuôi vi khuẩn lam Spirulina

platensis giàu selen hữu cơ

2.1.1 Mô tả nội dung:

kắnh, với môi trường nuôi bổ sung selen có nồng ựộ tăng cao hơn 50 mg/lit (109,45mg Na Selenit/l) và nuôi liên tục Nuôi liên tục bằng cách khi thu họach sinh khối không thu tòan bộ như nuôi từng mẻ trong labo., mà ựể lại một lượng vk lam Spirulina ựang ở giai ựọan non, (lọt qua rây 0,075 Ờ 0,125mm) ựể làm giống nuôi tiếp cho lô / mẻ sau Qua một số thế hệ, khả năng thắch nghi và tắch lũy selen sẽ tăng lên Giống thắch nghi này ựược giữ ựể nuôi từng mẻ với môi trường selen xác ựịnh

Dự kiến qua từ 2-5 thế hệ, sinh khối Spirulina có thể ựạt 75mcg/g khô với năng suất, giá thành chấp nhận ựược

- Phối hợp với Cơ sở nuôi trồng và phát triển sản phẩm tảo Spirulina / CTy sản phẩm sinh học tảo Việt, TP.HCM ựể ựược hỗ trợ nghiên cứu

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu

2.1.2.1- Nuôi Spirulina platensis thu sinh khối giàu selen hữu cơ theo pp

labo.2006 :



 Nuôi thu sinh khối theo kiểu hở:

Gồm các khâu chắnh : Cấy giống tảo non Spirulina vào hồ nuôi với môi trường nuôi chưa có selenit ở mật ựộ 300 mg / lit, hàng ngày bổ sung Natri bicarbonat ựể giữ pH

~ 8,5-9,5 và khuấy sục khắ Sau khoảng 3 Ờ 4 ngày khi tảo trưởng thành, bổ sung selenit ở mức 50 mg / lit Nuôi tiếp ựến ngày thứ 7 Ờ 8 , thu sinh khối khi mật ựộ khoảng 900 - 1400 mg / lit Lọc và rửa sinh khối với acid hydrocloric 0,1% ựến pH 6,0 ựể loại selen thừa, sau rửa bằng nước sạch, không chứa selenit, kiềm hóa với

dưới 7 %,Ầ Xay thành bột kắch thước ~ 0,71 mm đóng gói, bảo quản

- Theo dõi mức ựộ rửa sạch selenit bằng phản ứng so màu và ựối chiếu với pp ựo phổ sóng vuông SQF



 Phân lập tảo non Spirulina :

Chọn chủng tảo mẹ Spirulina platensis ựang kỳ phát triển, ở mật ựộ 500 -900 mg /

lit, khuấy ựều, lọc thu giữ tế bào tảo non ở cỡ lưới 0,105 - 0,125 mm



 Nhân, chọn giống Spirulina Fx thắch nghi cao với selenit :

selen hữu cơ ở mức không dưới 75 mcg /g khô và năng suất có thể chấp nhận ựược,

đây là giải pháp nghiên cứu bổ sung, hay nghiên cứu ban ựầu trước khi nghiên cứu

pilot Mặt khác, khả năng thắch nghi hay ngưỡng chịu ựựng selenit của chủng

Spirulina platensis ựang khảo nghiệm là ổn ựịnh, do vậy nghiên cứu này không mở

hướng tăng nồng ựộ selenit lên trên 50 mg/ lit trong môi trường nuôi pilot



 đánh giá, so sánh sự tương quan và khác biệt giữa 2 quy trình: nuôi

Spirulina giàu selen hữu cơ ở phòng thắ nghiệm và pilot có sự khác biệt về dụng cụ,

ựiều kiện môi trường, nguồn nước, hóa chất,Ầ nên cần có sự ựánh giá lại trên cơ sở

kết quả thực nghiệm, ựặc biệt khâu quản lý môi trường nuôi selen, tái sử dụng hoặc

xả vào môi trường xung quanh

2.1.2.2- định lượng sinh khối :

Có 3 pp ựược áp dụng : So màu , AAS và ựo phổ sóng vuông tuỳ theo ựiều kiện thiết

bị tại chỗ và ựối tượng cần nc

PP So màu : Dược ựiển Mỹ USP 28-NF 23, 2005,p 2837

Nguyên tắc: trong môi trường acid nitric, muối kali iodid khử selenit ( Se IV ) về

Selen nguyên tố hòa tan, cho màu ựặc trưng, thay ựổi theo nồng ựộ selen :

Áp dụng ựể ựịnh lượng nhanh Selen trong môi trường nuôi hoặc ựịnh tắnh selenit

Tiến hành: mẫu sinh khối Selen-saựã ựược vô cơ hoá hoặc muối selenenit ựược hoà

tan trong nước tinh khiết thành dung dịch thử Lấy chắnh xác một lượng mẫu thử khoảng 0.1 g Selenit vào bình ựịnh mức 100 ml, thêm 20 ml acid nitric ựậm ựặc, ựể

-SeO + 4 I - + 4 H + = Se + 2 I 2+ 4 H2O

Phương trình phản ứng :

1 2

yên 5 phút, ñun trên bếp cách thủy ở nhiệt ñộ 60°C trong 10 phút, thêm 30 mg urê,

ñun sôi, ñể nguội Thêm 4 ml dung dịch KI 10 % và thêm nước cất vừa ñủ Tùy hàm

lượng selen sẽ xuất hiện màu vàng nâu (30 ppm) ñến vàng cam và vàng rất nhạt (10 ppm) So màu của mẫu thử với gam màu của dung dịch selenit chuẩn trên máy ño quang phổ UV-Vis

PP quang phổ hấp thu nguyên tử - AAS :Dược ñiển Mỹ USP 28-NF 23, 2005,p

1763

Nguyên tắc: mẫu sinh khối Selen-sa ñược vô cơ hóa và hòa tan trong dung môi

thành dung dịch nồng ñộ Dịch mẫu ñược bơm vào bộ hóa hơi của máy (dùng ngọn lửa), selen hóa hơi ở dạng nguyên tử, hấp thu bức xạ ánh sáng ở bước sóng ñặc trưng ðo ñộ hấp thu bức xạ và tính nồng ñộ selen của mẫu

Selen trong sinh khối Selen-sa gồm Selen hòa tan là selen vô cơ và Selen không hòa tan là Selen hữu cơ

Selen hòa tan: là hỗn hỗn hợp các chất chứa selen hòa tan ñược trong nước, gồm

selen vô cơ và phức chất không xác ñịnh Chúng hấp phụ trên bề mặt tế bào sinh

thương khi thu hoạch nhả ra Selen vô cơ có thể rửa sạch hoặc ñến giới hạn cho

phép trong quy trình thu hoạch sk

Selen hữu cơ : là selen không hòa tan trong ñiều kiện thử nghiệm hay selen trong

cấu tạo tế bào Spirulina, thường gắn ở phần protein dưới dạng Se-proteinat hoặc Seleno-amin Một phần phân bố trong polysaccharid và phần còn lại khó xác ñịnh Selen hữu cơ hình thành theo con ñường sinh tổng hợp, không phải là muối selen

vô cơ trộn vào bột nguyên liệu

Tiến hành: theo 3 bước A, B và C ñể xác ñịnh Selen tổng số, Selen hòa tan và tính

ñược selen hữu cơ

- A - ðịnh lượng selen tổng số hay toàn phần : Nghiền mịn mẫu, cân chính xác

một lượng mẫu, vô cơ hóa với acid nitric / acid percloric, ở nhiệt ñộ sôi nhẹ,… Lọc thu dịch lọc vào bình ñịnh mức và ñiền ñủ nước cất trao ñổi ion

ðịnh lượng selen bằng AAS , tính lượng selen selen tổng số hay toàn phần dựa trên

mẫu selen chuẩn trong cùng ñiều kiện

- B- ðịnh lượng Selen hòa tan: Cân lượng chính xác sinh khối Selen-sa ( khô ),

hòa với nước cất trong bình ñịnh mức thành dung dịch 1- 5 %, ngâm chiết dịch hòa tan theo thời gian Lọc thu dịch ðịnh lượng selen trên máy

Nếu mẫu có hàm lượng selen quá nhỏ, phải kết hợp AAS với bộ hóa hơi hydride (AAS-HG) ñặt ngoài máy ñể tăng khả năng phân tích

- C- Selen hữu cơ: hiệu số giữa ( A ) và ( B ) hay C = A - B

- Tỷ lệ Selen hữu cơ ( % ): tỷ số giữa selen hữu cơ và selen tổng số

PP phân tích phổ sóng vuông Analyser SQF:

Mục ñích: là pp tham chiếu ñể xác ñịnh nhanh selen hoà tan trong nước nuôi tảo

và xác ñịnh vết selenit còn lại trong quá trình rửa loại selenit thừa khi thu hoạch sinh khối hay theo dõi ñộ sạch selenit hấp phụ

Nguyên tắc: ựo dòng ựiện hóa của ion selenit trên máy cực phổ sóng vuông SQF Tiến hành: ựặt ựiện cực vào dung dịch ựo, quét phổ ở ựiện thế 658 mV và ựọc

cường ựộ dòng ựiện hóa và suy ra lượng selenit hoà tan Dung dịch ựo là mẫu Selenit chuẩn và các mẫu nghiên cứu

đây là vấn ựề mới, chưa thấy có tài liệu nghiên cứu ở nước ta, nên kết quả ở nc này

gián tiếp ựánh giá bản chất của mẫu Selen-sa

2.1.2.4- Xác ựịnh Selen gắn hữu cơ trong protein:

Cân sinh khối Selen-sa, loại selenit hòa tan Phá vỡ tế bào trong bể siêu âm Lọc thu dịch lọc Thêm vào dịch lượng bão hòa amoni clorid, ựể lạnh, ly tâm, thu tủa Sấy

- Ngoài ra còn sử dụng một số phương pháp khác ựể phân tắch các chỉ tiêu liên quan

ựể xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho Selen-sa : phương pháp Kjeldahn ựịnh lượng

protein toàn phần, chiết xuất siêu âm protein ựể xác ựịnh tỷ lệ selen gắn giữ ở

protein, kỹ thuật Sohxlet, sắc ký lớp mỏng ựể xác ựịnh beta- carotenoids

2.1.2.5- đánh giá ựộ ổn ựịnh của nguyên liệu mới Selen-sa:

Tiêu chắ ựánh giá ựộ ổn ựịnh gồm: hàm lượng selen tòan phần, selen hữu cơ, ựộ ẩm

và cảm quan độ ổn ựịnh ựược ựánh giá theo 2 phương pháp:

- Thử nghiệm lão hóa cấp tốc: Selen-sa ựược ựược ựóng gói trong bao bì kắn, ựặt ở

ựiều kiện 50 ổ 2 0

tháng Kết quả ựược xử lý, dự ựoán tuổi thọ của sản phẩm

- Thử nghiệm dài hạn : Selen-sa ựược ựược ựóng gói trong bao bì kắn, bảo quản

lượng trong các thời ựiểm 0 - 6 -12 và 24 tháng Kết quả ựược dùng ựể dự ựoán hạn dùng của thuốc

- Các thử nghiệm kết thúc khi 1 trong các tiêu chắ không ựạt hoặc hàm lượng họat chất giảm còn dưới 90% theo quy ựịnh

2.1.3 Các chỉ tiêu theo dõi

Các nội dung n/c theo dõi gồm: khảo sát chế ựộ bổ sung selenit theo từng giai ựọan pháp triển của sinh khối, mức ựộ tắch lũy selen và năng suất sinh khối thu ựược Nồng ựộ selen (dự kiến) trong môi trường nuôi từ mức 50mg natri selenit/l ựến khỏang 65mg natri selenit/l, tùy theo mức thắch nghi

- Các thông số khác ựược n/c sáng tỏ gồm: diện tắch, chiều cao môi trường hồ nuôi, chế ựộ chiếu sáng, tốc ựộ khuấy trộn, cơ chất dinh dưỡng ựạm, carbonat, khả năng

lượng sinh khối ựủ cho nghiên cứu

- Thông số lý hoá, vi sinh, kim loại năng và ựộ ổn ựịnh của nguyên liệu Selen-sa

2.1.4 Sản phẩm nội dung cần ựạt

kiểu nuôi liên tục, công thức môi trường nuôi có natri selenit, có khả năng triển khai

- Triển khai nuôi pilot ñể thu ñược lượng sinh khối ñủ cho nghiên cứu khoảng 30kg

và xây dựng Tiêu chuẩn cho nguyên liệu mới Selen-sa Sản phẩm mới cần ñảm bảo

các quy ñịnh của Bộ y tế về tiêu chuẩn nguyên liệu dược dụng (hàm lượng selen

hữu cơ ñạt 50 – 75 mcg / gam sk khô, protein > 55%, ñịnh tính beta-caroten) , giới

hạn kim loại nặng (chì, arsenic, ), ñộc tính (không hoặc rất ít ñộc)

- Báo cáo ñộ ổn ñịnh của nguyên liệu Selen-sa và thẩm ñịnh tiêu chuẩn nguyên liệu của Viện kiểm nghiệm thuốc

2.2- Nội dung 2: Nghiên cứu bào chế thuốc Selen-sa 25 mcg

2.2.1 Mô tả nội dung:

- Nghiên cứu công thức, quy trình bào chế và tiêu chuẩn thuốc mới: Dự kiến bào chế nang thuốc, hàm lượng tương ñương 25 mcg selen toàn phần với công thức, các chất phụ, quy trình bào chế, tiêu chuẩn thành phẩm, bao bì thích hợp và ñánh giá ñộ ổn

ñịnh của chế phẩm

- Phối hợp với Cty Dược Phẩm Fitopharma và Viện kiểm nghiệm thuốc TPHCM trong nghiên cứu triển khai 2 nội dung trên

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2.1- PP bào chế nang thuốc Selen-sa 25 mcg

Nang thuốc Selen-sa 25 mcg ñã ñược triển khai nghiên cứu các lô pilot tại nhà máy của Cty dược phẩm Fitopharma, Bình Dương, với 3 lô 10.000 nang, lô số 01.06.09

ngày 23/6 / 2009, số 02.09.09 ngày 23/9/2009 và số 03.10.09 ngày 26/10/2009 Nguyên tắc chung:

Hoạt chất ñược phối hợp với lượng vừa ñủ các tá dược chức năng cần thiết như bảo quản, tạo ñộ trơn chảy dễ dàng khi ñóng thuốc và chất ñộn ñể khi ñóng vào nang, thể thích của liều thuốc vừa với thể tích của vỏ nang ñã chọn Thuốc phải ñược nghiên cứu công thức và quy trình bào chế sao cho hoạt chất ổn ñịnh trong thời gian quy

ñịnh, ở khoảng 2 ñến 5 năm

Chuẩn bị các hoạt chất tá dược và vỏ nang:

- Các thành phần phải ñạt chỉ tiêu dược ñiển hoặc tiêu chuẩn cơ sở, gồm: tính chất cảm quan, ñộ ẩm, ñộ mịn, ñịnh tính, ñịnh lượng

- Vỏ nang: chọn vỏ nang số 0, thể tích chứa thuốc = 0,67 ml, nhà sx Capsulgel (Thái lan), hiện ñang sử dụng tại Fitopharma Thuốc nang ñược ñóng trong vỉ nhôm nhựa

Các bước tiến hành:

- Chọn cỡ hạt của nguyên liệu :

Sử dụng máy xay tạo hạt hoạt chất Selen-sa và tảo Spirulina ở khoảng 0,71-1 mm, mức này là kích cỡ thực tế của tảo Spi trong viên nang Spirulina 450 mg ñang sản xuất tại nhà máy Fitopharma

Các tá dược còn lại nghiền mịn ñể tạo ñộ trơn chảy tốt cho hạt nguyên liệu trên

- Khảo sát tỷ trọng biểu kiến của thuốc:

Với liều lượng mỗi viên chứa nguyên liệu Selen-sa tương ñương 25 mcg selen toàn

phần, sau khi xác ñịnh ñược tỷ trọng biểu kiến sẽ tính ñược thể tích chiếm chỗ của hoạt chất trong vỏ nang Phần nang rỗng còn lại sẽ ñược lấp ñầy bằng tá dược ñộn, ở

ñây dùng bột tảo Spirulina (không chứa selen) và các tá dược chức năng khác, sao

cho ñáp ứng công thức và thể tích vỏ nang dự kiến ở trên

Ở nghiên cứu tìm ñược lượng tảo Spirulina ñể ñộn phần nang rỗng, các tá dược khác

chiếm chỗ không ñáng kể

- Chọn tá dược trơn chảy và bảo quản:

ðộ trơn chảy của khối bột là yếu tố quan trọng nhất ñể ñảm bảo sự ñồng nhất về khối

lượng thuốc khi ñóng thuốc trên máy ðộ trơn chảy ñược khảo nghiệm thông qua tốc

ñộ chảy hoặc vài cách khác Tốc ñộ chảy là khối lượng bột/hạt thuốc trong 1 phút

chảy qua một phễu trong ñiều kiện tiêu chuẩn

Tốc ñộ chảy = Khối lượng hạt thuốc / Thời gian chảy hết khối hạt (gam / phút)

Tá dược trơn: ñể ñiều hòa sự chảy, ñảm bảo sự ñồng nhất về khối lượng và hàm lượng, một số tá dược dùng ñể khảo nghiệm, lựa chọn là: magnesi stearat, talc, gel silic Aerosil,…

Chất bảo quản: dùng chất bảo quản chống nấm mốc là natri benzoat và chất ổn ñịnh chống oxy hoá là Natri bisulsulfit, bảo vê beta-Caroten, các acid béo chưa bão hoà trong tảo Spirulina ñược ổn ñịnh Hai chất này dùng theo kinh nghiệm sản xuất viên nang Spirulina và cố ñịnh tỷ lệ ~ 0,8 % so với tổng khối lượng thuốc

- Công thức dự kiến, cho 1 viên nang: xem bảng 2.1

Bảng 2 1: Công thức dự kiến, cho 1 viên nang

1 Selen-sa Hoạt chất 25 mcg selen toàn phần

2 Tảo Spirulina Tá dược ñộn Vừa ñủ

3 Talc Tá dược trơn chảy Vừa ñủ

4 Magiesi stearat Tá dược trơn chảy Vừa ñủ

5 Natri benzoat Chất bảo quản chống vi

khuẩn, nấm mốc

~ 0,8 % so với khối lượng thuốc

6 Natri bisulsulfit Chất bảo quản ổn ñịnh ~ 0,8 % …………nt…………

7 Vỏ nang số 0 Vỏ chứa thuốc 1

- Thời gian trộn ñều khối thuốc

* Xác ñịnh thời gian trộn ñều khối thuốc: trộn nguyên liệu Selen-sa và bột Spirulina trong máy trộn hành tinh kiểu Erweka Kiểm tra ñộ ñồng nhất của hoạt chất trong

khối thuốc trong quá trình trộn, ở các thời ựiểm thắch hợp 5 - 15 phút

Khối lượng mẫu cần lấy: 2 g / lần

Số lượng mẫu: 3 mẫu / thời ựiểm

Vị trắ lấy mẫu: theo sơ ựồ bênẦ

* định lượng: Cân một lượng bột thuốc chứa lượng tương ựương 200 mcg selen toàn phần, cho vào bình nón dung tắch 150 ml và tiến hành ựịnh lượng với pp so màu trên máy ựo UV-Vis

Kết quả: tắnh tỷ lệ % hoạt chất trong khối bột ựể xác ựịnh thời ựiểm ựạt ựược ựộ phân tán thấp nhất Nồng ựộ hoạt chất trong khối thuốc khi trộn ựồng nhất là selen toàn phần / gam thuốc

- đóng nang:

* Nguyên tắc: ựóng thuốc vào vỏ nang theo cách ựong ựầy Ờ gạt bằng 1 thể tắch thuốc vừa ựủ ựã thiết kết sẵn cho mỗi vỏ nang rỗng Khối lượng thuốc ựóng vào nang ựược kiểm soát bởi lườn chỉnh cao thấp của mâm nén và tốc ựộ quay của mâm mang nang

- Máy ựóng nang: dụng cụ nghiên cứu - ựóng nang thủ công Mp 300 (300 viên/mâm)

và các lô pilot trên máy ựóng nang bán tự ựộng New Diamond, (360 viên/mâm) tại nhà máy Fitopharma

- Tiến hành: cân từng mẻ thuốc với khối lượng tắnh theo số lượng nang cho mỗi mâm Tiếp vỏ nang vào mâm và tách vỏ đóng vào thuốc vào vỏ nang, gạt bằng nén nhẹ, ép nắp nang Tách nang thuốc khỏi máy Chọn, loại những nang bị xước vỏ hoặc móp méo và lau sạch vỏ nang đóng thuốc vào vỉ 10 nang Kiểm soát ựộ kắn và hình thức vỉ thuốc Dán nhãn lên mặt vỉ đóng hộp, thùng, nhập kho theo quy ựịnh

- Kiểm nghiệm bán thành phẩm:

Kiểm tra khối lượng thuốc trong nang: lấy mẫu 3 lần ở ựầu lô, giữa và cuối mỗi lô

- Kiểm nghiệm thành phẩm:

Kiểm nghiệm thành phẩm theo TCCS: tắnh chất cảm quan, ựộ rã, ựộ ẩm: dưới 7 %,

ựịnh tắnh hoạt chất, hàm lượng và ựộ ựồng ựều hàm lượng thuốc

2.2.2.2- đánh giá ựộ ổn ựịnh của thuốc nang Selen-sa:

Thuốc nang Selen-sa 25 mcg ựã ựược bào chế ở quy mô pilot, xây dựng tiêu chuẩn

và phương pháp kiểm nghiệm Tiêu chắ ựánh giá ựộ ổn ựịnh gồm: hàm lượng selen tòan phần, selen hữu cơ, ựộ ẩm và cảm quan độ ổn ựịnh ựược ựánh giá theo 2 phương pháp:

- Thử nghiệm lão hóa cấp tốc: Selen-sa ựược ựược ựóng gói trong bao bì kắn, ựặt ở

ựiều kiện 50 ổ 2 0

tháng Kết quả ựược xử lý, dự ựoán tuổi thọ của sản phẩm

- Thử nghiệm dài hạn : Selen-sa ựược ựược ựóng gói trong bao bì kắn, bảo quản

trong điều kiện của phịng thí nghiệm ( nhiệt độ 30 ± 2 0C và độ ẩm 75± 5% ) ðịnh lượng trong các thời điểm 0 - 6 -12 và 24 tháng Kết quả được dùng để dự đốn hạn dùng của thuốc

- Các thử nghiệm kết thúc khi 1 trong các tiêu chí khơng đạt hoặc hàm lượng họat chất giảm cịn dưới 90% theo quy định

2.2.3 Các chỉ tiêu theo dõi

- Hàm lượng thuốc trong quy trình bào chế và tiêu chuẩn liên quan trong Tiêu chuẩn

cơ sở của nang thuốc

- ðộ ổn định của nang thuốc trong nghiên cứu cấp tốc và điều kiện thực

2.2.4 Sản phẩm nội dung cần đạt

- Cơng thức và mẫu thuốc nang Selen-sa 25 mcg

- Quy trình bào chế: 3 lơ ở pilot 10.000 capsule Khảo sát thơng số của quy trình: độ

đồng đều khi trộn thuốc, đồng đều khối lượng và hàm lượng thuốc thành phẩm

- Bản Tiêu chuẩn và phương pháp kiểm nghiệm thuốc mới

- Báo cáo độ ổn định của thuốc và thẩm định tiêu chuẩn chất lượng thuốc

- Chuẩn bị thuốc cho thử lâm sàng

2.2.5- Nguyên liệu, hĩa chất, thiết bị:

Bảng 2.2: Danh sách các nguyên liệu sử dụng trong điều chế viên nang

điển Việt nam

IV-2009

Fitopharma, Bình dương 4- Magiesi stearat

5- Natri benzoat

6- Natri bisulsulfit

Danh sách các hĩa chất, thiết bị kiểm nghiệm ( như phần 2.5- phụ lục )

Bảng 2.3: Danh sách các thiết bị bào chế thuốc

Bảng : Danh sách các thiết bị bào chế thuốc ( tiếp theo)

6-Máy ñóng nang bằng tay,

7-Máy ñóng nang bán tự

2.3- Nội dung 3: Nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc trên ñộng vật 2.3.1 Mô tả nội dung

Các nc ñể ñánh giá ñộ an tòan, ñáp ứng quy ñịnh về n/c tiền lâm sàng của thuốc mới

- Thử nghiệm ñộc tính bán trường diễn

- Thử nghiệm ñộc tính trên sự sinh sản và phát triển của ñộng vật thử qua 2 thế hệ

mẹ con

Ngoài ra còn nc thêm 2 nội dung không nêu trong ñề cương, ñể làm rõ hơn bản chất

lý hoá và tác dụng dược lý của thuốc, xem Phụ lục:

- Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa trong ống nghiệm của sinh khối tảo Spirulina giàu selen hữu cơ

- Nghiên cứu sự hấp thu selen và hàm lượng enzyme glutathion trong máu chuột nhắt trắng sau khi cho uống chế phẩm Selen-sa

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu

2.3.2.1- Khảo sát ñộc tính cấp

Nguyên tắc:

ðể xác ñịnh ñộc tính cấp của thuốc người ta thường dựa vào liều gây chết 50% súc

vật thử nghiệm

Thử nghiệm sơ khởi

Dựa vào liều dùng trên người là 200 mcg Se/ngày/50 kg và hàm lượng Selen có

trong sinh khối là 135 mcg Se/g, chúng tôi tiến hành khảo sát ñộc tính của Selen ở

Thử nghiệm khảo sát ñộc tính cấp

Các chuột nhắt trắng ñủ ñiều kiện thử nghiệm ñược chia ngẫu nhiên thành 2 lô:

- Lô chứng: 10 con, cho uống nước cất

- Lô thử : 10 con, uống bột tảo giàu Selenium pha trong nước cất

ðiều kiện thử nghiệm: Nhiệt ñộ phòng 290C – 300C

ðường dùng thuốc: ðường uống (PO) Sử dụng kim thẳng ñưa thuốc vào dạ dày

chuột

Thể tích dùng thuốc: 0,2 ml/10g thể trọng

Số lần dùng thuốc: 1 lần trong ngày, vào buổi sáng

Liều sử dụng: 0,06g/0,2ml/10g chuột

Quan sát theo dõi chuột sau khi cho uống 72 giờ về hoạt ñộng, hành vi bất thường,

số lượng chuột chết.Tiếp tục theo dõi hành vi, hoạt ñộng và trọng lượng chuột trong

14 ngày Chuột ngay sau khi chết hoặc sau 14 ngày thử nghiệm ñược hy sinh, mổ ñể quan sát ñại thể xem sự bất thường có thể xày ra ở gan, thận, tim và phổi

2.3.2.2- Khảo sát ñộc tính bán trường diễn

Thử nghiệm ñộc tính bán trường diễn nhằm mục ñích phát hiện những ñộc tính mà thử nghiệm ñộc tính cấp chưa bộc lộ trong thời gian sử dụng ngắn hạn

Thăm dò ñộc tính bán trường diễn bằng cách theo dõi các chỉ số huyết học, sinh hóa,

sự thay ñổi ñại thể, vi thể của một số phủ tạng (gan, thận) của các chuột lô chứng và

lô thử sau khi cho dùng một liều nhất ñịnh mỗi ngày trong thời gian dài 2 tháng Thử nghiệm khảo sát ñộc tính bán trường diễn: Khảo sát trên cả 2 phái tính Mỗi phái tính ñều có lô chứng và lô thử, ñều ñược khảo sát cùng 1 quy trình như sau: Các chuột nhắt trắng ñủ ñiều kiện thử nghiệm ñươc chia thành 2 lô:

- Lô chứng: 20 con, cho uống nước cất

- Lô thử: 30 con, cho uống bột tảo giàu Selenium pha trong nước cất

ñịnh ñược LD100 thì liều khảo sát sẽ chọn là liều bằng 1/20 - 1/10 liều cao nhất thú vật có thể sử dụng ñược

ðường dùng thuốc: ðường uống (PO) bằng kim thẳng, ñầu tà

Số lần dùng thuốc: 1 lần duy nhất trong ngày, buổi sáng, trong 60 ngày

Chỉ tiêu ñánh giá và so sánh giữa lô chứng và lô thử:

- Sự thay ñổi thể trọng

- Chỉ số huyết học

- Chỉ số sinh hóa

- Giải phẫu ñại thể, vi thể gan thận

cùng kết thúc thử nghiệm

Các mẫu máu xét nghiệm huyết học: máu ñược lấy trực tiếp từ tâm nhĩ phải và ñược chống ñông bằng EDTA Các mẫu xét nghiệm sinh hóa: không dùng chất chống

ñông, máu toàn phần ñược ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút trong 5 phút và lấy

phần huyết thanh Các mẫu gan thận ñược bảo quản trong dung dịch formol 10% trong ñệm Phosphat do BM Giải Phẫu Bệnh - Khoa Y- ðại học Y Dược cung cấp Các xét nghiệm huyết học, sinh hóa ñược ño tại Phòng Sinh Hóa Và Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy Các xét nghiệm ñại thể, vi thể mẫu sinh thiết gan thận ñược thực hiện tại Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, khoa Y

2.3.2.3- Khảo sát ảnh hưởng của sk tảo Spirulina giàu selen trên sinh sản

Các chỉ tiêu ñể ñánh giá ảnh hưởng của thuốc trên sinh sản

Với chuột ñực:

- Sự thay ñổi thể trọng trong thời gian ghép cặp

- Tinh trùng ñồ: pH tinh dịch, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng bình thường, phân loại tinh trùng dựa trên tốc ñộ di ñộng

- Khối lượng tinh hoàn

- Giải phẫu ñại thể, vi thể tinh hoàn xem cấu trúc ống sinh tinh, có tinh nguyên bào, tiền tinh trùng, tinh trùng trưởng thành

Với chuột cái:

- Sự thay ñổi thể trọng trong thời gian ghép cặp và mang thai

- Thời gian mang thai

- Giải phẫu ñại thể, vi thể buồng trứng tìm nang trứng nguyên thủy, nang trứng sơ cấp, thứ cấp, trưởng thành, nang hoàng thể, các loại u; tử cung xem nội mạc tử cung,

mô ñệm tử cung có phản ứng màng rụng, các loại u xơ

Với chuột con:

- Số lượng chuột con

- Sự thay ñổi trọng lượng chuột con 30 ngày từ lúc mới sinh cho ñ61nn lúc tách bầy Liều sử dụng: Liều xác ñịnh không gây ñộc cho thú vật trong thử nghiệm ñộc tính bán trường diễn

Thử nghiệm khảo sát ảnh hưởng của Selen-sa trên sự sinh sản chuột nhắt trắng

Gồm 3 giai ñoạn:

Giai ñoạn 1: nuôi chuột ñến trưởng thành

Thời gian thử nghiệm: 6 tháng

Chuột nhắt ñủ ñiều kiện thí nghiệm ñược chia thành 2 lô:

Chuột ñực: Lô chứng: 30 con và Lô thử :40 con

Chuột cái : Lô chứng: 30 con và Lô thử: 50 con

Lô chứng: Cho uống nước cất, 0,1 ml/ 10 g trọng lượng chuột

Lô thử : Cho uống liều 6 mg/0,1 ml/10 g trọng lượng chuột

Giai ñoạn 2: Ghép ñôi và mang thai: 3 tháng

Chuột cho uống thuốc 2 tháng sẽ cho ghép ñôi với tỷ lệ “1 ñực : 2 cái”

Chuột trong thời gian ghép cặp và mang thai vẫn tiếp tục cho dùng thuốc

Liều dùng: 6 mg/0,1 ml/10 g chuột

Giai ñoạn 3 : Sau khi sinh con: 1 tháng

Chuột ñực và chuột cái sau khi sinh vẫn cho uống thuốc

Liều dùng: 6 mg/0,1 ml/10 g trọng lượng chuột

Chuột con sinh ra ñược cân và nuôi ñể theo dõi trọng lượng mỗi ngày trong thời gian

30 ngày

Chuột ñực và chuột cái ñạt yêu cầu ghép ñôi thành công (mang thai và sinh con)

ñược gây mê và giải phẫu: Chuột ñực ñược lấy mẫu tinh hoàn (giải phẫu ñại thể, vi

thể), mào tinh, ống dẫn tinh, túi tinh (lấy tinh dịch làm xét nghiệm tinh trùng ñồ) và chuột cái ñược lấy mẫu buồng trứng, tử cung (giải phẫu ñại thể, vi thể) ñể khảo sát

Các mẫu xét nghiệm tinh hồn, buồng trứng, tử cung được thực hiện tại Bộ mơn Giải Phẫu Bệnh- khoa Y- ðại học Y Dược

Các mẫu mào tinh, ống dẫn tinh, túi tinh cho vào dung dịch nuơi cấy tinh trùng được xét nghiệm tại Khoa Hiếm Muộn, Bệnh viện Từ Dũ

Phân tích thống kê kết quả:

Các số liệu được trình bày dưới dạng Số trung bình ± Sai số chuẩn của số trung bình

Sự khác biệt giữa lơ uống thuốc và uống nước cất được xác định bằng phép kiểm Ttest hoặc test Mann-Whitney U với phần mềm thống kê Minitab 14.0 Các biểu đồ

được vẽ bằng phần mềm Sigma Plot 10.0

2.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi

- Liều gây độc LD50 của thuốc mới

- Các chỉ tiêu đánh giá và so sánh giữa lơ chứng và lơ thử: sự thay đổi thể trọng, chỉ

số huyết học, chỉ số sinh hĩa, giải phẫu đại thể, vi thể gan thận

- Chuột đực và chuột cái đạt yêu cầu ghép đơi thành cơng : mang thai và sinh con và

đặc điểm sức khoẻ chuột con sinh ra

- Hoạt tính chống oxy hĩa của Selen-sa trong ống nghiệm của Selen-sa

- Sự hấp thu selen vào máu hay sinh khả dụng của thuốc và hàm lượng enzyme glutathion trong máu chuột nhắt trắng sau khi cho uống chế phẩm Selen-sa

2.3.4 Sản phẩm nội dung cần đạt

- Lập hồ sơ về độ an tồn của thuốc mới theo quy định, trong đĩ xác định độc tính cấp và độc tính trên chức năng sinh sản và dự đốn liều cĩ thể sử dụng trên người

2.4- Nội dung 4: Thử nghiệm thuốc Selen-sa trên người tình nguyện

2.4.1 Mơ tả nội dung

Nghiên cứu này là thử nghiệm lâm sàng ban đầu để đánh giá tác dụng sinh học cĩ lợi

cho người bệnh dùng thuốc Selen-sa 25 mcg và Selen-sa 50 mcg Nghiên cứu là đề tài NCKH cấp cơ sở của Bệnh viện Thống Nhất TP.HCM, với 3 nội dung chính:

- Lập hồ sơ Báo cáo nghiên cứu tiền lâm sàng của thuốc mới, để trình Hội đồng Khoa học và đạo đức của Bệnh viện Thống nhất TP.HCM xem xét

- Lập đề cương nghiên cứu lâm sàng: xác định mơ hình thử nghiệm, phương pháp nc., số người tình nguyện tham gia,

- Tiến hành thử thuốc trên người tình nguyện : đánh giá tác dụng của thuốc qua theo dõi lâm sàng và số liệu cận lâm sàng, báo nghiệm thu đề tài

ðề tài này ngồi người khoẻ mạnh, cịn mở rộng so với đề cương ở nhĩm người tình nguyện bị bệnh đái tháo đường typ 2 và thiếu selen trong máu

2.4.2 ðối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.4.2.1- ðối tượng nghiên cứu:

Chọn được 100 người tình nguyện tham gia đợt khám sức khoẻ đầu tiên Gồm 74 người sức khỏe bình thường qua kiểm tra sức khỏe định kỳ và 26 bệnh nhân đái tháo

ựường typ 2 Sau khi xét nghiệm Selen máu, phát hiện ựược 51 người thiếu Selen

trong máu với nồng ựộ selen trong máu < 0.15 mcg/ml và ựược ựưa vào diện nc:

- 27 người sức khỏe bình thường

- 25 bệnh nhân ựái tháo ựường

Nhóm người bình thường:

Nhóm này gồm 27 nhân viên tình nguyện có sức khỏe bình thường qua kiểm tra sức khỏe ựịnh kỳ của Bệnh viện Thống nhất TP.HCM và Bệnh viện Tâm thần TW2, Biên Hòa với các tiêu chuẩn chọn lựa sau:

ựiều kiện sau:

* đã ựược chẩn ựoán xác ựịnh bệnh đTđ typ 2 theo tiêu chuẩn chẩn ựoán của Tổ chức y tế thế giới (1997), với 1 trong 3 tình huống sau:

- Có ựường huyết tương ≥ 11.1 mmol / l ở một thời ựiểm bất kỳ kết hợp với các triệu chứng lâm sàng (tiểu nhiều, uống nhiều hay gầy sút cân không thể giải thắch

ựược) đường huyết tương lúc ựói (sau 8 giờ không ăn) ≥ 7 mmol / l đường máu 2

giờ sau khi uống 75g glucose ≥ 11.1 mmol / l

- Hiện ựang ựiều trị bằng thuốc viên hạ ựường máu, không có sự thiếu trầm trọng insulin (nồng ựộ insulin máu > 3 ộU / ml).Glucose máu ở mức trung bình 7 - 10 mmol/l Nồng ựộ selen máu < 0,15 mcg /ml

* Các ựối tượng phải ựồng ý tham gia nghiên cứu

Tiêu chuẩn loại trừ :

- Không thỏa mãn tiêu chuẩn nhận vào nhóm nghiên cứu

- Uống các loại thuốc chống oxy hóa trong vòng 03 tháng trước khi tham gia nghiên cứu

- Ngoài bệnh ựái tháo ựường còn mắc phải một số bệnh cấp tắnh và mãn tắnh kèm theo như suy thận, viêm gan,Ầ

2.4.2.2- Vật liệu nghiên cứu

- Thuốc Selen-sa do nhóm nc của khoa Dược, đại học Y Dược cung cấp kèm theo

Hồ sơ nghiên cứu tiền lâm sàng của thuốc

Dạng trình bày: Nang thuốc Selen-sa 25 mcg và 50 mcg tắnh theo selen toàn phần

- Máu tĩnh mạch ựược lấy vào buổi sáng, khoảng cách từ bữa ăn trước ựến lúc lấy máu tối thiểu là 10 giờ

- Chống ựông bằng NaF ựể xét nghiệm glucose

- Tách huyết tương dùng cho xét nghiệm TAS và các thông số sinh hóa máu

2.4.2.3- Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp: nghiên cứu dọc, tiền cứu

Các chỉ số nghiên cứu:

- Hoạt ñộ enzym SOD, GPx hồng cầu và nồng ñộ TAS huyết tương ñể ñánh giá khả năng chống oxy hóa

- Nồng ñộ selen máu: phương pháp AAS- xem phần nghiên cứu thuốc Selen-sa

- Các thông số sinh hóa máu: Creatinin, AST, ALT, GGT, uric acid, protein, albumin, cholesterol, HDL-C, LDL-C, triglycerid, công thức máu ñể ñánh giá chức năng gan, thận, rối loạn chuyển hóa,…

Các thông số trên ñược xác ñịnh ở 2 thời ñiểm trước và sau 21 ngày uống thuốc

- Các ñối tượng nghiên cứu (gồm 27 người bình thường và 25 bệnh nhân ðTð có thiếu Selen) ñược hướng dẫn uống 4 viên Selen–Sa (200 mcg) /1 ngày chia làm 2 lần trước mỗi bữa ăn chính 30 phút Trong suốt quá trình uống thuốc 21 ngày người tham gia nghiên cứu vẫn duy trì ăn uống như bình thường bệnh nhân ðTð vẫn dùng thuốc trị ðTð như ñã ñiều trị trước ñây

Các kỹ thuật ñược sử dụng trong nghiên cứu :

- Kỹ thuật ñịnh lượng glucose

ðịnh lượng glucose bằng kỹ thuật ñộng học enzym dựa trên nguyên tắc :

Hexokinase

Glucose + ATP Glucose-6-phosphat + ADP

G6P- DH

Nồng ñộ glucose ñược ño bằng sự tăng ñộ hấp thu của NADH ñược hình thành ở bước sóng 340 nm

ðịnh lượng Hemoglobin glycosyl (HbA1c) bằng phương pháp miễn dịch ñộ ñục trên máy phân tích hóa sinh tự ñộng Olympus AU 640 của Nhật

Nguyên tắc : HbA1c phản ứng với kháng thể kháng HbA1c tạo thành một phức hợp miễn dịch có thể hòa tan ñược Sau ñó những polyhapten (bán kháng nguyên) từ thuốc thử R2 sẽ gắn với những kháng thể dư thừa Phức hợp kết dính có ñộ ñục tạo

tự ñộng tính dựa trên ñường biểu diễn Logarit- log của ñộ hấp phụ của bốn nồng ñộ

ðịnh lượng Hemoglobin (Hb) bằng kỹ thuật ño quang ở bước sóng 570 nm

HbA1c (g/l) 100

Hb (g/l)