chọn tạo giống lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá bằng kết hợp phương pháp công nghệ sinh học (công nghệ đơn bội, chỉ thị phân tử...) với phương pháp truyền thống

Viện lúa quốc tế đã quy tụ được những gen kháng bệnh bạc lá khác nhau vào các giống từ IRBB1 đến IRBB 63 trong đó có giống có tới 3 hoặc 4 gen vì vậy việc sử dụng vật liệu quy tụ của IRR

TRUYỀN THỐNG

MỞ ĐẦU

Hiện nay, lúa lai đã trở nên không thể thiếu được trong cơ cấu giống cây trồng ở Việt Nam, lúa lai đã đóng góp không nhỏ vào gia tăng sản lượng lương thực Quốc gia bảo đảm an ninh lương thực Diện tích lúa lai trong những năm gần đây không tăng mà còn có phần giảm, nguyên nhân hạn chế chủ yếu là lúa lai hiện nay chưa kháng được bệnh bạc lá

Ở Việt Nam, bệnh bạc lá thật sự gây tác hại, nó làm giảm năng suất từ 60% [15], Trường Đại học NN1,[14] Viện Bảo vệ Thực vât, Viện DTNN, đã thu thập, phân lập được nhiều nòi bạc lá khác nhau từ nước ngoài và các nòi mới được phân lập trong nước Kết quả đánh giá thử nghiệm của các viện,

30-trường, cho thấy có 3 gen kháng được phần lớn các nòi miền Bắc Việt Nam là xa5, Xa7 và Xa21, tuy nhiên hiện nay một số gen như Xa21 vẫn kháng được

nhiều nòi bạc lá khác nhau nhưng mức độ kháng đã giảm đáng kể, vì vậy muốn tăng cường khả năng kháng bệnh bền vững cần phải quy tụ nhiều gen

kháng vào một giống lúa

Bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo, chỉ có thể có kết luận, cá thể này kháng bệnh bạc lá, cá thể khác không kháng hoặc kháng nhiều, kháng ít, khó

có thể biết được các thể nào mang 1 gen kháng, cá thể khác mang hai hay nhiều gen là những gen nào Nhờ chỉ thị phân tử, không những có thể xác định nhanh chóng, chính xác những cá thể mang một hay nhiều gen mà là những gen nào để định hướng chọn giống kháng bền với bệnh bạc lá

Viện lúa quốc tế đã quy tụ được những gen kháng bệnh bạc lá khác nhau vào các giống từ IRBB1 đến IRBB 63 trong đó có giống có tới 3 hoặc 4 gen vì vậy việc sử dụng vật liệu quy tụ của IRRI kết hợp với chỉ thị phân tử

để quy tụ vào các giống lúa [28] khác nhau là hoàn toàn có thể được trong

điều kiện Việt Nam Dòng IRBB 62 mang 3 gen trội Xa4, Xa7, Xa21 kháng

rất tốt với các nòi bạc lá của Việt Nam liên kết với các chỉ thị phân tử MP2, P3, pTA248 vì vậy việc sử dụng dòng này làm vật liệu để lai quy tụ vào các giống lúa khác nhau là rất tiện lợi

MP1-Các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng thành công MAS và phương

pháp nuôi cấy bao phấn lúa để quy tụ gen kháng bạc lá Xa21 và gen chịu úng SUB1 vào giống lúa KDML 105 (Khao Dak Mali)

Đối với lúa lai do sử dụng hiệu ứng trội và siêu trội là chính nên những vật liệu, dòng, giống có chứa gen trội rất có ý nghĩa trong công tác chọn tạo

giống lúa lai kháng bệnh bạc lá Nếu ta quy tụ được hai gen Xa7 và Xa21 vào

dòng mẹ TGMS và các dòng bố khác nhau sau đó sử dụng chúng trong sản xuất lúa lai thì có thể tạo được tổ hợp lai kháng được bệnh bạc lá[14]

Tuy vậy, các giống lúa lai chủ yếu vẫn nhập nội từ Trung Quốc và là lúa lai hệ ba dòng nên năng suất bị hạn chế Muốn có ưu thế lai cao cần các tổ

hợp giữa các phân loài phụ Indica/ Japonica, xong khi lai xa con lai thường bị

lép do không tương thích giữa dòng bố và mẹ Để có được lúa lai cao sản cần phải lai xa giữa các phân loài phụ và dòng bố hoặc mẹ phải có gen tương hợp

rộng S 5 n Dòng mẹ PA64S mang gen tương hợp rộng S 5 n liên kết với chỉ thị

phân tử RM225 và RM253 đồng thời mang gen bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ có thể sử dụng làm vật liệu cho chọn tạo dòng bố mẹ mang gen tương hợp rộng

Phương pháp nuôi cấy bao phấn là một phương pháp đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước tiên tiến trên thế giới và là một phương pháp rất tiện lợi

giúp nhanh chóng tạo dòng đơn bội kép Đặc biệt, sử dụng phương pháp này rút ngắn thời gian chọn dòng TGMS từ 5-6 năm ở điều kiện thường xuống chỉ còn 1-2 năm và không phải phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh Muốn

mở rộng diện tích lúa lai cần chọn tạo lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá và trước hết phải chọn tạo dòng bố, mẹ kháng bệnh bạc lá vì vậy chúng tôi chọn

hướng nghiên cứu “Chọn tạo lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá bằng CNSH (nuôi cấy đơn bội, chỉ thị phân tử) kết hợp với phương pháp thông thường” là

khoa học và có ý nghĩa thực tiễn cao

Mục tiêu của đề tài

- Làm chủ được công nghệ tạo dòng bố, mẹ mang gen tương hợp rộng và gen kháng bệnh bạc lá

- Tạo được 2-3 dòng bố, 1-2 dòng mẹ ngắn ngày mang gen tương hợp rộng và gen kháng bệnh bạc lá

- Chọn được 1-2 tổ hợp lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá có triển vọng

Đối tượng nghiên cứu

Kế thừa một số vật liệu của đề tài “nghiên cứu chọn tạo giống lúa thuần kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị phân tử” Đối tượng nghiên cứu là những dòng

bố, mẹ lúa lai hai dòng, gen kháng bệnh bạc lá Xa7, Xa21 và gen tương hợp rộng S 5 n

Phạm vi nghiên cứu

Đề tài tập trung nghiên cứu chọn tạo dòng bố, mẹ lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá, sử dụng những công nghệ nuôi cấy bao phấn, chỉ thị phân

tử kết hợp với phương pháp lai truyền thống nên rút ngắn được thời gian

Dòng bố, mẹ có gen kháng bệnh bạc lá trội Xa7, Xa21 sẽ dễ tạo được lúa lai

kháng bệnh bạc lá nên mang tính ứng dụng cao

Tính cấp thiết

Hiện nay, lúa lai nhiễm bệnh bạc lá nên khó mở rộng diện tích Lý do

chủ yếu là chưa tạo được dòng bố, mẹ mang gen trội Xa7, Xa21 kháng được

với các nòi gây bệnh bạc lá của Việt Nam Nếu chọn tạo được những dòng bố,

mẹ mang gen này sẽ tạo được các tổ hợp lúa lai kháng bệnh bạc lá có thể mở rộng được diện tích lúa lai ở vụ Mùa

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài đưa ra quy trình chọn tạo dòng bố, mẹ lúa lai hai dòng kháng bệnh bạc lá bằng CNSH (công nghệ đơn bội, chỉ thị phân tử) nên có ý nghĩa khoa học cao

Các dòng bố mẹ kháng bệnh bạc lá là cơ sở chọn tạo lúa lai kháng bệnh bạc lá, mang gen tương hợp rộng là cơ sở khai thác ưu thế lai xa nên có ý nghĩa thực tiễn cao

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA

ĐỀ TÀI

1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trong nước và trên thế giới

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trên thế giới

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng không chỉ đối với Việt

Nam mà cả trên thế giới, đặc biệt quan trọng hơn đối với những nơi mà dân nghèo sinh sống Vì vậy các quốc gia Châu Á hàng năm tiêu thụ tới 90% sản lượng lúa gạo của thế giới Để đảm bảo được nguồn lương thực, đáp ứng cho mức độ tăng dân số của thế giới, trong 30 năm tới sản lượng lúa gạo yêu cầu tăng từ 470 triệu tấn hiện nay, lên 740 triệu tấn Do diện tích cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng ngày một giảm, sản lượng lương thực buộc phải tăng mạnh hàng năm mới mong nuôi nổi lượng dân số trên thế giới đang ngày một tăng nhanh vì vậy cần phải chọn tạo giống lúa mới năng suất cao, chống chịu tốt Việc sử dụng ưu thế lai nhằm tăng năng suất lúa là rất cần thiết, Trung Quốc là nước đầu tiên trên thế giới thành công đưa ra sản xuất lúa lai trên thế giới, ngày nay diện tích lúa lai chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa của nước này và đã góp phần không nhỏ vào việc gia tăng sản lượng lương thực xoá đói của quốc gia đông dân nhất hành tinh này

Hiện nay, ngoài Trung Quốc, lúa lai đã được nghiên cứu ở nhiều nước trên thế giới, Ấn Độ, Việt Nam là hai nước đã thu được những thành tựu nhất định trong nghiên cứu và sản xuất, lúa lai đã được mở rộng và khẳng định chỗ đứng không thể thiếu được trong sản xuất.[8]

Diện tích lúa lai ở các nước ngoài Trung Quốc như Bănglades 40 000 ha,

Ấn Độ 560 000 ha, Philippin gần 200 ngàn ha, Mỹ 43 000 ha, ngoài ra các nước khác như Srilanca, Ai Cập, Nhật bản cũng trồng lúa lai

Trong những năm cuối của thế kỷ trước, lúa lai trong sản xuất chủ yếu là lúa lai thuộc hệ ba dòng, sử dụng con lai dựa trên cơ sở của dòng mẹ là dòng

CMS, ngày nay trong sản xuất lúa lai hệ ba dòng vẫn còn giữ một vị trí quan trọng vì khá ổn định và không phụ thuộc vào nhiệt độ, xong lúa lai ba dòng còn một số hạn chế, khó duy trì và làm thuần dòng mẹ, phổ phục hồi thấp, giá thành hạt lai cao, khó sử dụng ưu thế lai xa vì vậy đã kịch trần về năng suất Trung quốc đã đưa vào sản xuất nhiều giống lúa lai hệ hai dòng trong đó

có tổ hợp Pêi ải 64S/ 9311 cho năng suất siêu cao sản 17,1T/ ha/ vụ.[5] Trong các năm gần đây, các công ty giống của Trung Quốc, Ấn Độ đang khảo nghiệm nhiều tổ hợp lúa lai hai dòng ở Việt Nam và đang có kết quả tốt.[13]

Để khắc phục những khó khăn của lúa lai hệ ba dòng, các nhà khoa học đã tìm ra hướng lúa lai hệ hai dòng và lúa lai 1 dòng Tuy vậy lúa lai hệ 1 dòng đang còn trong nghiên cứu về lý thuyết, vì vậy việc nghiên cứu và sử dụng lúa lai hệ hai dòng là kinh tế, thuận lợi và có giá trị thực tiễn hơn cả Lúa lai

hệ hai dòng dựa trên nền tảng sử dụng dòng bất dục đực mẫn cảm với ánh sáng ngày ngắn (PGMS), bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ (TGMS) được quan tâm và hiện thực hơn cả ngoài ra còn có dòng bất dục đực mẫn cảm với nhiệt độ ngược (Anti-TGMS)

Do sự ưu việt của lúa lai hai dòng hệ TGMS so với lúa lai ba dòng, đặc biệt đối với các nước nhiệt đới, biên độ chiếu sáng trong ngày chênh lệch ít trong đó sự chênh lệch nhiệt độ giữa các tháng trong năm khá lớn và tương đối ổn định rất thuận tiện cho nghiên cứu và phát triển lúa lai hệ hai dòng, sử dụng dòng bất dục đực nhân nhậy cảm với nhiệt độ (TGMS) Vì vậy nhiều nước trên thế giới đầu tư nghiên cứu, chọn tạo dòng bất dục đực TGMS đã tìm được nhiều dòng có nguồn gốc khác nhau, dòng 5460S của Trung Quốc

có gen tms1 nằm trên nhiễm sắc thể số 8, dòng đột biến từ Norin PL12 có gen tms2 nằm trên nhiễm sắc thể số 7, dòng đột biến từ IR32364 của IRRI có gen tms3 nằm trên nhiếm sắc thể số 6, dòng TGMS-VN-1 của Việt Nam,[23] đột

biến từ giống Chiêm Bầu có gen tms4 nằm trên nhiễm sắc thể số 2, dòng SA2 của Ấn Độ có gen tms5 nằm trên nhiễm sắc thể số 9, Dòng TGMS-VN-6 thu

được từ đột biến D84-1 của Việt Nam có gen tms6 nằm trên nhiễm sắc thể số

4, dòng Anti-TGMS có gen rtms1 nằm trên nhiễm sắc thể số 10 của lúa

Hàng năm Trung Quốc có hàng trăm tổ hợp lúa lai mới và đang xuất khẩu sang các nước khác mang lại nguồn ngoại tệ đáng kể và tạo them công việc nâng cao thu nhập cho nông dân

1.1.2 Tình hình nghiên cứu và phát triển lúa lai trong nước

Ở Việt Nam, sản lượng lúa chiếm gần 90% tổng sản lượng các cây lương thực Ngoài ra, trong khẩu phần dinh dưỡng của người Việt Nam, cơm cung cấp tới 68% lượng ca-lo cần thiết cho cơ thể Do diện tích cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng ngày một giảm, sản lượng lương thực buộc phải tăng mạnh hàng năm mới mong nuôi nổi lượng dân số trên thế giới đang ngày một tăng nhanh Riêng đối với Việt Nam, các nhà kinh tế nước ngoài cho rằng

từ nay cho đến năm 2020, sản lượng lúa cần phải tăng thêm 1,43% mỗi năm

thì mới đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ của người dân (Evenson, 1999)

Từ năm 1991, lúa lai đã được nhà nước ta quan tâm, đầu tư nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Đến nay, lúa lai đã được đưa vào cơ cấu giống chính thức của hầu hết các tỉnh và trở thành không thể thiếu được,[7] đặc biệt rất cần cho vùng trồng cây vụ Đông Năng suất lúa lai trong vụ Xuân tương đối

ổn định và đã góp phần không nhỏ vào việc gia tăng sản lượng lương thực ở nước ta Chất lượng lúa lai ngày được cải thiện, nhiều giống lúa lai hiện nay được người tiêu dùng đánh giá cao, giá thành gạo của nhiều giống lúa lai cao hơn một số giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc đang được trồng phổ biến ở Miền Bắc như Q5, Khang Dân 18

Diện tích lúa lai hàng năm khoảng 600 ngàn ha (tương đương 18.000 tấn hạt lai) và được trồng phổ biến ở Miền Bắc Các giống lúa lai mới ngắn ngày,

dễ chăm sóc, tỏ ra có sức chống chịu với một số điều kiện bất lợi với thời tiết

và điều kiện ngoại cảnh tốt hơn lúa thuần nên có đóng góp vào sự gia tăng sản lượng lương thực trong cả nước

Mặc dù chúng ta đã làm chủ được công nghệ sản xuất hạt lai F1,[8] nhưng giống lúa lai đang được trồng chủ yếu nhập khẩu từ Trung Quốc nên không chủ động trong sản xuất, nhiều khi bị ép giá đến 120-130 ngàn đồng/ kg Tuy một số tổ hợp lúa lai của Trung Quốc có thể sản xuất được ở Việt Nam nhưng các dòng CMS chúng ta vẫn chưa làm thuần đủ số lượng và chất lượng để đáp ứng nhu cầu của sản xuất Đây là một việc khó mà đến nay nhiều đơn vị

nghiên cứu, sản xuất lúa lai trong nước phải chấp nhận

Qua nhiều năm thử nghiệm, đến nay các nhà khoa học Việt Nam đã khẳng định, lúa lai hai dòng hệ TGMS rất tiện lợi cho việc chọn và nhân dòng mẹ, sản xuất hạt lai ở nước ta.[3] Nhiều dòng bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt

độ TGMS đã được tạo ra ở Việt Nam, dòng TGMS-VN1 đột biến từ giống lúa

Chiêm Bầu của Việt Nam, mang gen tms4 nằm trên nhiễm sắc thể số 2 của lúa, TGMS-VN-6 có gen tms6 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 của lúa

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội là nơi có đội ngũ nghiên cứu lúa lai rất mạnh đã tạo được các dòng T1S-96, 103S, T4S, T7S đang được đưa ra sản xuất đại trà Các dòng TGMS của Việt Nam [23] đã có đủ những đặc tính tốt của dòng mẹ, thấp cây, ngắn ngày, tỷ lệ thò vòi nhuỵ ra ngoài sau khi nở hoa cao, khả năng nhận hạt phấn từ bên ngoài tốt, độ bất dục đực ở nhiệt độ cao ổn định có khả năng kêt hợp cao.[3], [7] Một số tổ hợp lúa lai của Việt Nam ngắn ngày, năng suất cao, nhiều tổ hợp có chất lượng tốt như VL 20, VL

24, TH3-1, TH3-3, TH3-4, TH5-1, TH5-4, TH7-2 đã được sản xuất chấp nhận và ngày càng chiếm được niềm tin cuả nông dân, các đơn vị sản xuất và cung ứng giống lúa lai trong nước (Sơ kết sản xuất lúa lai vụ Đông-Xuân 2007-2008 và vụ Mùa 2008 và vụ Đông-Xuân 2008-2009 các tỉnh Phía Bắc của cục Trồng trọt ngày 9-7-2008)

Trung tâm Nghiên cứu Lúa lai- Viện CLT và CTP đã tạo được nhiều dòng TGMS khác nhau như AMS30S, AMS31S, AMS32S, AMS33S…và nhiều tổ hợp lúa lai HYT83, HYT100, HYT 103, HYT 106, HYT 107… Công nghệ sản xuất hạt lai đã được nhà nước ta quan tâm từ năm 1991, đến nay không những nhà khoa học mà cả nông dân cũng có thể sản xuất được hạt lúa lai, đây là một kết quả rất đáng trân trọng trong đó phải kể đến

hệ thống Khuyến nông Quốc gia Năng suất hạt lai đã đạt được khá cao từ 3-4 tấn/ ha, như vậy việc sản xuất lúa lai trong nước đã trở thành một nghề nông mang lại hiệu quả thu nhập cao và còn đóng góp lớn vào sự nghiệp phát triển lúa lai nước nhà Hiện nay, nhiều công ty giống cây trồng trong nước đã đầu

tư khá lớn vào nghiên cứu và sản xuất hạt lai F1 mang lại hiệu quả kinh tế và góp phần vào phát triển lúa lai ở nước ta Tuy chúng ta đã làm chủ được hầu hết các khâu trong quá trình nghiên cứu và sản xuất lúa lai, xong tổng số hạt giống lúa lai sản xuất được trong nước mỗi năm mới đáp ứng khoảng 25-30% diện tích lúa lai trong cả nước

Các giống lúa lai đang được trồng phổ biến nhập nội và sản xuất trong nước hiện vẫn bị nhiễm bệnh bạc lá nên khó mở rộng diện tích ở vụ Mùa Theo kế hoạch của Bộ NN & PTNT đặt ra là đến năm 2010 số lượng hạt giống lúa lai sản xuất được trong nước cần phải đáp ứng được 70% diện tích

trồng lúa lai Diện tích lúa lai trong những năm gần đây không tăng mà còn có phần giảm, nguyên nhân hạn chế chủ yếu là lúa lai hiện nay chưa kháng được bệnh bạc lá, số lượng các tổ hợp lúa lai của Việt Nam còn ít, số dòng mẹ TGMS chọn ra từ trong nước còn ít và chưa thật ổn định, chưa có các gen trội

kháng bạc lá như Xa7, Xa21 để có thể tạo ra lúa lai kháng bệnh bạc lá Một số

dòng mẹ nhập nội từ Trung Quốc như Pêi ải 64S có dạng cây đẹp, có gen tương hợp rộng xong vòi nhuỵ nhỏ, tỷ lệ vòi nhuỵ thò ra ngoài thấp dẫn đến khả năng nhận phấn từ bên ngoài thấp, năng suất hạt lai thấp Các dòng bất dục đực thu thập từ IRRI cũng vậy, mặc dù khả năng kháng sâu, bệnh và chất lượng gạo khá hơn nhưng tỷ lệ thò vòi nhuỵ kém, khó sản xuất hạt lai

1.2 Bệnh bạc lá và những nghiên cứu bệnh bạc lá

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1884 –

1885, sau đó Takasi (1908) và Bokusa (1911) đã nghiên cứu và phân lập thành công vi khuẩn, rồi tiến hành lây nhiễm bệnh nhân tạo bằng vi khuẩn vừa phân lập được Tiếp sau Nhật Bản, một loạt các nước đã thông báo về bệnh bạc lá lúa ở nước mình Năm 1970, bệnh xuất hiện ở hầu hết ở các nước Châu Á (trừ Tây Á), ở các nước Châu ÂU vào năm 1973 và ở Châu Mỹ La Tinh vào năm 1975 Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (vi khuẩn bạc lá lúa) được nhiều nhà khoa học nghiên cứu, phân lập nên nó được gọi với nhiều tên khác nhau như: năm 1927, theo khái niệm đặt tên của EF Smit vi khuẩn này được gọi là Bacterium Oride (Uyed et ishitama) Nakata, sau đó được đặt tên là Xanthomonas Oryzae (Uyed et ishitama) Dowson, đến năm 1982, vi khuẩn

này được đặt tên là X Campestri pv Oryzea (Uyed et ishitama) Dowson

1.2.1 Đặc điểm, triệu chứng bệnh bạc lá lúa

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas Campestris p.v.oryzae Dowson gây ra, bệnh này phổ biến ở các nước trồng lúa trên thế giới Tác hại

chủ yếu của bệnh là làm cho lá lúa đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh chóng

bị khô, chết, bộ lá khô ảnh hưởng tới khả năng quang hợp và tạo ra các chất sống cho hạt Từ đó, những ruộng lúa bị bạc lá có tỉ lệ lép rất cao, làm năng suất giảm lớn

Bệnh bạc lá lúa gây hại trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển của cây lúa, vết bệnh điển hình thời kỳ cấy trên đồng ruộng, sau đó khi đẻ nhánh - trỗ - chín sữa, trường hợp nghiêm trọng bệnh xuất hiện ngay giai đoạn mạ

- Trên mạ: Triệu chứng không biểu hiện đặc trưng như trên cây lúa, do

đó nếu ta không quan sát kĩ thì rất dễ nhầm lẫn sang bệnh khô đầu lá lúa sinh

lý, vi khuẩn gây bệnh gây ra các triệu chứng ở mép lá, múp lá với những vết dài ngắn khác nhau, có màu xanh vàng, nâu bạc, rồi khô xác và chết

- Trên lúa: Triệu chứng vết bệnh thể hiện rõ hơn, tuy nhiên nó có thể thay đổi ít hay nhiều tùy thuộc vào từng giống và điều kiện ngoại cảnh Vết bệnh từ mép lá, phiến lá rồi lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo gân chính, nhưng cũng có khi xuất hiện từ gân lá rồi lan rộng ra Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng, vết bệnh có màu vàng, mô bệnh tái xanh, vàng lục, lá màu bạc khô xác Thông thường ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe phân biệt nhau rất dễ dàng có giới hạn theo đường gợn sóng màu vàng hoặc khô vàng có khi chia lá thành những đường viền màu nâu đứt quãng hoặc không đứt quãng Trong điều kiện độ ẩm cao trên bề mặt ngọn khoảng vài phân, vết bệnh được phát triển dọc phiến lá cả về chiều dài và chiều rộng Quanh vết bệnh thường có những viền gợn sóng để phân biệt phần bị bệnh và phần không bị bệnh Trên những cây bị nhiễm bệnh, lá bệnh thường bị héo tàn có màu bạc trắng rồi chết Trên mô bệnh còn tươi vào buổi sáng ta quan sát thấy những giọt dịch vi khuẩn có hình tròn nhỏ, có màu vàng đục, khi keo đặc có màu nâu hổ phách Giọt dịch này chuyển sang màu vàng rơm đọng lại thành hình cầu nhỏ li ti trên lá

- Trên hạt: Quan sát thấy hạt bị bệnh có những vết bệnh không màu, xung quanh cso viền nước Các vết bệnh được thấy rõ khi hạt thóc còn non và xanh, khi hạt chín vết bệnh màu vàng tím hoặc màu nâu nhạt

Hình 1.2 Ruộng lúa bị cháy do bệnh bạc lá

1.2.2 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá

Vi khuẩn bạc lá lúa trước đây có tên là Pseudomonas oryzae, hoặc

Phytomonas oryzase, về sau Dowson đặt tên Xanthomonas Campestris p.v.oryzae Dowson xâm nhập vào cây có tính chất thụ động Nó có thể xâm

nhiễm qua thủy khổng, qua các lỗ khí trên mút lá, mép lá, đặc biệt là qua vết thương xây xát trên lá Khi tiếp xúc với bề mặt lá có màng nước, vi khuẩn dễ dàng di động, xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thương Sau đó sinh sản và nhân lên nhanh chóng về mặt số lượng, theo các bó mạch dẫn lan rộng đến các xị trí khác của lá Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt lá tiết ra các giọt dịch vi khuẩn Thông qua sự va chạm giữa các lá lúa, nhờ gió, mưa truyền bệnh sang các lá khác để tiến hành xâm nhiễm nhiều lặp lại lần trong thời kỳ sinh trưởng của cây lúa, cho nên bệnh bạc lá tuy có phạm vi lan truyền rộng nhưng còn phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện thời tiết như mưa, bão

1.2.3 Thành phần nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá

Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI đã khẳng định tính chuyên hóa kí sinh của vi khuẩn gây bệnh trên bộ giống chỉ thị nòi Người ta chỉ ra rằng phản ứng khác biệt giữa các giống chỉ thị với các nòi vi khuẩn đã chứng minh một cách đúng đắn về sự tồn tại của các nòi vi khuẩn bạc lá lúa Các nhà khoa

học đã dựa vào sự khác nhau về khả năng lây nhiễm của vi khuẩn và khả năng chống nhiễm của các bộ chỉ thị nòi với các nòi vi khuẩn để chia vi khuẩn thành các nòi sinh lý Ở Nhật Bản nghiên cứu nòi được tiến hành từ năm 1957 khi phát hiện thấy giống Aisacase chống bệnh trở nên nhiễm bệnh, họ đã xác định được ở Nhật Bản có 5 nhóm nòi, Philippin đã xác định có 4 nòi và ở Indonesia có 9 nhóm nòi

Ở nước ta trong những năm gần đây vấn đề này mới được nghiên cứu Theo tác gia Lê Lương Tề thì ở đồng bằng sông hồng có ít nhất là 3 nòi bạc

lá Tác giả Tạ Minh Sơn sử dụng tổng hợp bộ giống chỉ thị nòi của Nhật Bản

và IRRI đã xác định ở Việt Nam có 10 nhóm nòi vi khuẩn đặt tên từ 1 – 10, tác giả còn cho biết các nhóm nòi vi khuẩn ở Việt Nam có đặc tính khác hẳn ở Nhật Bản và Philippin

Viện bảo vệ thực vật có nhận xét: “Vi khuẩn bạc lá phân lập từ các giống chống bệnh có sức gây bệnh cao hơn hẳn các vi khuẩn phân lập từ các giống nhiễm bệnh”

1.3 Những thành công và hạn chế của chọn giống lúa bằng phương pháp lai cổ điển

Chọn giống lúa bằng phương pháp cổ điển được áp dụng từ rất sớm, bao gồm các phương pháp chính như: nhập nội, gây đột biến, lai chuyển gen kháng bệnh bạc lá rồi cho phân ly và chọn lọc

Lai tạo là một phương pháp tạo giống truyền thống, nhờ lai tạo ta có thể quy tụ được nguồn gen ở các giống khác nhau Nếu đột biến tạo ra nguồn nguyên liệu sơ cấp thì lai tạo tạo ra nguồn nguyên liệu thứ cấp cung cấp nguồn vật liệu cho chọn lọc Nhiều dòng, giống mới mang những đặc điểm phù hợp mục đích của con người được tạo ra nhờ lai tạo kết hợp nguồn gen quý từ dòng bố và dòng mẹ Ngày nay người ta thường áp dụng phương pháp lây nhiễm bệnh nhân tạo để chọn các dòng kháng bệnh ngay từ đầu xong khó

phát hiện dòng có 2 hay nhiều gen kháng bạc lá khi sử dụng nhiều gen khó biết là gen nào

1.4 Những nghiên cứu sinh học phân tử về gen kháng bạc lá lúa

Cho đến nay, có 35 gen điều khiển tính trạng kháng bệnh bạc lá lúa đã được tìm ra từ các giống lúa hoang dại, [31] lúa trồng hoặc được tạo ra từ sự thay đổi di truyền Các gen kháng bệnh bạc lá đã được xác định nằm trên 8/12

nhiễm sắc thể của lúa và được kí hiệu theo thứ tự lần lượt từ Xa1 đến Xa31,[27] xa32,[45], xa33, Xa35 [31] 22 gen trội (dominant) (Xa), 13 trong

số đó là gen lặn bao gồm: xa5, xa5 (t), xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24, xa28, xa31 và xa32, ba gen khác là xa15, xa19, xa20 được tạo ra bởi sự thay đổi di truyền Các gen kháng bạc lá có thể bị kiểm tra một gen đơn trội (Xa1, Xa2, Xa3, Xa7,…), một gen đơn lặn (xa5, xa8, xa13,…) hoặc do hai gen liên kết với nhau như Xa1/Xa4, Xa1/Xa7, Xa1/Xa10… Vì vậy mức độ chống bệnh

theo đó cũng khác nhau Một số gen kháng bệnh có cấu trúc protein tương đối giống nhau, các nhà khoa học kết luận là do chúng liên kết chặt chẽ hoặc do

chúng allen với nhau như Xa26 có protein giống Xa21, Xa22(t), Xa23 [41],

[43], [ 44], [45]

Một số gen kháng bạc lá và các chỉ thị phân tử liên kết gần với các gen này đã được định vị trên bản đồ nhờ sử dụng phương pháp RFLP, RAPD, STS, SSR [41] Các gen này nằm trên các nhiễm sắc thể (NST) khác nhau

như: gen Xa29t, xa32 nằm trên NST 1[45]; xa24 nằm trên tay dài của NST số

2 [43]; gen Xa1, Xa2, Xa12, Xa14, xa31 cùng nằm trên NST số 4 [27] ; gen Xa7, Xa27 (t) nằm trên NST số 6[30], chỉ thị phân tử liên kết gần với gen Xa7

là L263, R276, G329, R11; gen xa8 trên NST số 7, gen lặn xa13 liên kết với marker RG136 trên NST số 8[33]; gen Xa3, Xa4, Xa21, Xa22t, Xa23, Xa26t, xa32t định vị trên NST 11,[45], gen Xa21 liên kết với marker RG 103 (Ronal

và ctv, 1992) Gen Xa25t, xa32 định vị trên NST số 12 [31] Hiện nay trên

NST 3, 9, 10 chưa phát hiện gen kháng bạc lá

Theo IRRI 2007, gen kháng bạc lá được phát hiện trên các giống lúa và

vị trí của chúng trên NST như bảng sau:

Bảng 1.1: Nguồn gốc một số gen kháng bệnh bạc lá ở lúa

Các gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 được các chuyên gia lưu tâm nhất do các

gen này khi tổ hợp cùng với nhau có phổ kháng rộng Ấn Độ đã tạo ra các

dòng mang nhiều gen kháng làm nguồn vật liệu để chuyên tổ hợp các gen này

vào các giống lúa thương mại làm tăng khả năng kháng bạc lá của các giống

lúa

Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu (2002) sử dụng phương pháp RAPD,

với hai mồi PB 7, PB 8 liên kết với gen Xa21, STS marker Npb181 liên kết

với gen Xa4, RFLP marker RG556 liên kết với gen xa5, các gen này đã được

xác định ở quần thể F2 của lúa mùa địa phương lai với giống lúa cải tiến

Dùng kỹ thuật PCR phát hiện có 8/120 giống lúa địa phương thu từ các tỉnh

vùng núi phía Bắc chứa gen Xa7

Trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá, ta đã sử dụng nhiều gen

kháng bệnh bạc lá như Xa4, xa5, Xa7, Xa13, Xa21, Xa23,… và một số trình

tự mồi kháng bệnh bạc lá liên kết với các gen đã được công bố

1.5 Thành tựu khoa học trong việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa (Maker Assisted Selection)

Cho đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị bệnh bạc lá lúa vì vậy việc tạo ra giống lúa mang gen kháng bệnh là việc cần thiết và hữu hiệu nhất để phòng trừ và giảm bớt thiệt hại do bệnh này gây ra [28]

Trên thế giới nhiều nước đã sử dụng phương pháp MAS (marker RFLP)

để tạo ra nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá Sự kết hợp của phương pháp lai tạo quy tụ gen kháng bạc lá và MAS đưa đến những thành công lớn cho ngành sản xuất lúa Những nghhieen cứu cho thấy nếu quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào cùng một giống lúa thì khả năng kháng sẽ cao và phổ sẽ rộng hơn [33],[46]

Ở Philippin, các nhà khoa học đã quy tụ thành công 3 gen kháng trội vào dòng mẹ bất dục đực phản ứng với nhiệt độ TGMS [38]

Ở Ấn Độ các nhà khoa học đã quy tụ kết hợp 2 gen Xa4, Xa21 vào cùng

một giống lúa (Davierwala et al, 2001) Sing et al (2001), đã sử dụng MAS để

quy tụ 3 gen kháng xa5, xa13, Xa21 vào giống lúa trồng PR106

Ở Trung Quốc phương pháp MAS cũng được các nhà khoa học sử dụng trong chọn tạo giống lúa Họ đã quy tụ được một số gen kháng chủ yếu như

xa5, xa7, Xa21… vào cùng một giống lúa Dòng phục hồi Shuhui207 được quy tụ 2 gen trội kháng bạc lá Xa4, Xa21, qua kiểm tra thấy khả năng kháng

cao hơn và có phổ kháng rộng hơn so với dòng chưa được quy tụ gen kháng

ban đầu Minghui725 [46] Chuyển gen Xa21 vào dòng phục hồi Minghui63, tạo thành dòng Minghui (Xa21) khi lai với Zhenshan97A tạo con Shanyou63

kháng bạc lá Xa21 và gen chịu úng (SUB trên NST số 9) vào giống lúa

KDML 105 (Khoa Dok Mali) MAS cũng được sử dụng kết hợp với nuôi cấy bao phấn để quy tụ gen kháng bạc lá ở giống lúa chất lượng cao Jao Hom Nin

và gen chịu hạn ở giống lúa DN15 bằng cách lai giữa giống lúa JHN Và DN15 và đưa 6 dòng BC1F3 mang cả 2 gen trên vào nuôi cấy bao phấn Kết quả thu 154 dòng nhị bội mang cả gen bạc lá và gen chịu hạn

Ở Việt Nam, nghiên cứu tìm hiểu các gen kháng bệnh bạc lá các nhà

khoa học đã kết luận: các gen Xa4, Xa7, xa5 và Xa21 chống được hầu hết các

nòi bạc lá ở Miền Bắc Việt Nam Hiện nay, tổ hợp 2-3 gen trong số các gen

xa5, Xa7, Xa21 có thể chống được hầu hết các nòi bạc lá ở đồng bằng Bắc

Bộ.[ thủy] Năm 2005, TS Phan Hữu Tôn và cộng sự đã ứng dụng kĩ thuật PCR phát hiện 4 gen kháng bạc lá từ 500 giống lúa địa phương, thu được kết

quả: 56 giống chứa gen Xa4, 36 giống chứa gen xa5, 16 giống chứa gen Xa7, không có giống nào chứa gen Xa21

Nguyễn Thị Lang và cộng sự tìm ra marker liên kết với gen Xa4, xa5 trên giống lúa cao sản, marker RM144 (Xa4) là giống OM2517, OM3428 và marker RM122 (xa5) là các giống OM2492, OMCS2000 Đồng thời tìm ra gen kháng với quần thể trên giống lúa mùa đối với gen xa13 thông qua STS

marker (RG136) trên quần thể IR24/NangSom Ứng dụng marker phân tử để

hỗ trợ chọn lọc các quần thể trong lai Backcross để chuyển gen kháng bạc lá [2], [8]

Tác giả Dương Thanh Tài và các cộng sự tại Công ty Giống cây trồng Miền Nam đã chọn tạo thành công giống lúa lai Bắc Ưu 903 kháng bệnh bạc

lá Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương pháp hồi giao kết hợp thanh lọc

bệnh nhân tạo để chuyển gen Xa21 vào giống bố Quế 99, từ đó tạo ra Bắc Ưu

903KBL (có kết hợp dòng bất dục BoA) Giống lúa lai Bắc Ưu 903KBL gần như giữ nguyên đặc tính di truyền của giống Bắc Ưu 903 đồng thời kháng bệnh bạc lá rất tốt Bắc Ưu 903KBL đã chính thức được Bộ NN – PTNN công nhận giống mới [1]

Viện Nghiên cứu Lúa, trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội đã thành công trong việc chuyển gen kháng bệnh bạc lá vào giống lúa Bắc thơm 7 và giống lúa lai Bắc Ưu 253 Tác giả Nguyễn Văn Hoan và cộng sự đã chuyển giao thành công công nghệ sản xuất hạt giống cho tỉnh Hải Dương Các mô hình sản xuất của hai giống lúa trên ở Hải Dương đã cho năng suất cao, an toàn trong sản xuất do đã kháng được bệnh bạc lá, nhất là khi canh tác trên các vùng đất trũng, có nguồn bệnh bạc lá [7]

Tuy đã có nhiều nghiên cứu về bệnh bạc lá và cũng có nhiều giống lúa kháng bệnh bạc lá được chọn tạo ở Việt Nam nhưng các giống lúa này chủ yếu chỉ mang gen đơn nên tồn tại trong sản xuất không lâu vì tính kháng bệnh không bền vững và nhanh chóng bị phá vỡ trong vài năm Chính vì vậy chọn tạo giống lúa mang từ 2 gen kháng bệnh hữu hiệu trở lên là cần thiết hiện nay

1.6 Thành công của phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong phần lớn các chương trình chọn giống, việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp

tử Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các

di truyền lặn của một khối đơn gen Kiểu gen japonica dường như hình thành cullus tốt hơn so với các bố mẹ khác.[32]

Trong nuôi cấy bao phấn, tuỳ theo mỗi loại cây trồng mà thu được tỷ lệ

số cây đơn bội khác nhau, có thể thu được các cây có mức độ bội thể cao Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các cây của quần thể F1 nhằm tạo ra sự đa dạng di truyền tối đa trong quần thể các cây đơn bội được tạo thành Nhiễm sắc thể của cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn, sau khi được lưỡng bội hoá, sẽ trở thành cây lưỡng bội thuần nòi, từ các cây này sẽ tạo thành quần thể các dòng thuần, qua đánh giá chọn lọc và tạo ra giống mới Kiểu gen được cho là nguyên nhân chính và là yếu tố quyết định ảnh hưởng đến sự hình thành callus và tái sinh cây xanh khi nuôi cấy bao phấn lúa Niizeki (1983) và Heberle-Boss (1985) đã chỉ ra tác động có ý nghĩa của kiểu gen và mối tương tác giữa kiểu gen và môi trường có ảnh hưởng đến sự hình thành callus và tái sinh cây xanh

Nuôi cấy bao phấn chính là một phương pháp để tạo ra các dòng đồng hợp tử trong quá trình chỉ vài tháng so với yêu cầu nhiều thế hệ khi sử dụng phương pháp truyền thống Cây đơn bội kép là sản phẩm cuối cùng của quá

trình nuôi cấy bao phấn Chúng có đặc điểm là đồng hợp tử rất cao và được coi là nguồn vật liệu đa dạng, phong phú cho chọn giống [9], [12]

Đối với chọn giống lúa lai, nuôi cấy bao phấn nhằm:

Tinh lọc và chọn nhanh dòng bố, mẹ trong lúa lai hai dòng:

- Rút ngắn quá trình chọn tạo dòng bố

- Rút ngắn quy trình chọn tạo dòng mẹ TGMS

- Tách ra được những dòng thuần có năng suất cao từ cây lai dị hợp tử

Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường được lấy từ các cây lúa của quần thể F1 hoặc F2 nhằm tạo ra sự di truyền tối đa trong quần thể [5], [8], [10] Nhiều nước trên thế giới đã sử dụng rất thành công phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa trong chọn tạo giống mới Ở Trung Quốc, một lượng lớn các giống lúa mới được tạo ra nhờ kỹ thuật nuôi cấy bao phấn lúa và được trồng trên diện tích hàng nghìn ha (Chen 1986) Năm 2002, Zeng và công sự đã nuôi cấy 2600 bao phấn của dòng phục hồi Minghui 81 đã được chuyển gen cry1Ac trên môi trường SK3 Các tác giả đã thu được 83 cây xanh tái sinh, trong đó có 43 cây đơn bội kép và 40 cây đơn bội Kết quả chạy PCR cho thấy có 55/83 dòng mang gen chuyển cry1Ac (tỷ lệ 2:1) Các tác giả đã khẳng định: Nuôi cấy bao phấn lúa có giá trị rất lớn trong chọn giống lúa phân tử [24], [25]

Ở Hàn Quốc, chọn giống nhờ công nghệ đơn bội được đưa vào chương trình chọn giống quốc gia năm 1977, chỉ trong 7 năm 4 giống lúa đã được tạo

ra (Chung 1992) [43] Các nhà khoa học Philippin đã sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn để cải tạo và tạo ra rất nhiều giống lúa cho năng suất cao, chất lượng gạo tốt và mang các gen kháng như: Kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu [38] Victoria và cộng sự đã nuôi cấy bao phấn tổ hợp lai F1-506 (con lai giữa C4044-2B-2-2 và IR13540-56-3-2-1, tác giả đã thu được 10 dòng đơn bội kép

Hiện nay, sử dụng chỉ thị phân tử (MAS) trong chọn giống lúa đã có hiệu quả cao, tuy vậy chọn giống nhờ MAS vẫn phải tuân theo quy luật hỗn gen (dị hợp tử) Nuôi cấy bao phấn có thể khắc phục điều đó chỉ trong một năm.[24], [25], [32]

Các nhà khoa học Thái Lan đã sử dụng kết hợp thành công MAS và

phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa để quy tụ gen kháng bạc lá (Xa21) và gen

chịu úng SUB vào giống lúa chất lượng KDML 105 (Khoa Dok Mali) [24] Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học phương pháp nuôi cấy bao phấn giúp công tác chọn tạo giống lúa đã trở nên thuận lợi hơn, đặc biệt

là đối với các dòng TGMS Nếu không sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, muốn chọn tạo được một dòng TGMS phải mất rất nhiều thời gian (ít nhất phải mất 6-7 năm), công sức ngoài đồng ruộng và phải phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh Sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn, các nhà chọn giống lúa lai có thể tiết kiệm thời gian chọn tạo dòng TGMS từ 2-3 năm trong điều kiện thường [14], kỹ thuật nuôi cấy bao phấn thực sự đã trở thành công cụ đắc lực của các nhà chọn giống lúa lai [10], [11], [17], [20], [24], [25], [32], [43]

1.6.2 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phương pháp nuôi cấy bao

phấn ở Việt Nam

Ở Việt Nam, nuôi cấy bao phấn cho kết quả rất tốt Năm 1976, tại Viện Công nghệ sinh học Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy bao phấn và thu được kết quả ban đầu Kỹ thuật này cũng được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở những cơ quan như: Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện cây Lương thực, Viện Lúa Đồng bằng Sông Cửu Long [5], [8], [9], [10], [12] Năm 1997, các nhà nghiên cứu Viện Di truyền Nông nghiệp cải tiến quy trình nuôi cấy bao phấn mới Quy trình này cho phép nâng cao tỷ lệ tạo mô sẹo và khả năng tái sinh cây xanh lưỡng bội [5]

Tác giả Đào Hải Lý và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm nuôi cấy bao phấn 3 tổ hợp lai F1 5B, 6B, 7B, xử lý lạnh 2, 4, 6 ngày Tác giả nhận xét thấy bao phấn được sử lý lạnh 2-4 ngày cho phản ứng tốt hơn với môi trường nuôi cấy Tác giả cũng đưa ra kết luận rằng: Nguồn gen khác nhau sẽ cho phản ứng khac nhau với môi trường nuôi cấy bao phấn [10]

Từ năm 1994 đến nay, nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy bao phấn lúa để chọn tạo giống lúa mới Bằng phương pháp lai tích luỹ kết hợp với nuôi cấy bao phấn người ta đã có thể cùng một lúc chọn được nhiều tính trạng khác nhau như: dòng chất lượng cao, chịu mặn, chịu hạn, chịu rét [8] để tạo nguồn vật liệu mới sử dụng trong chọn tạo giống

Tác giả Nguyễn Thị Lang và cộng sự tại Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long đã tiến hành nuôi cấy 3 tổ hợp lai: C53/Pokkali, C53/đốc Phụng, C53/C51 trên môi trường N6 Tác giả thu được 72 dòng lúa đơn bội kép Qua đánh giá khả năng chịu mặn và đánh giá bằng chỉ thị phân tử SSR (RM 223), tác giả đã chọn được 11 dòng triển vọng cho năng suất cá thể cao và có đặc tính nông sinh học tốt đặc biệt là có khả năng chịu mặn [8]

Năm 2004, Trần Đình Giỏi và Vương Đình Tuấn đã lai giống lúa IR64 với các giống lúa mới (new plant type), IR69146-15, IR69146-25, IR68530, IR70441 Tổ hợp lai IR64/IR69146-25 cho tỷ lệ callus cao nhất (8,85%) Tác giả khẳng định môi trường N6 có bổ xung 2mg/l BAP + 0,5mg/l NAA cho tỷ

lệ cây tái sinh cao nhất (5,29%)

Các dòng TGMS đơn bội kép được tạo ra có độ di truyền rất ổn định như dòng TGMS-NC1, TGMS-NC3 [17] Bằng phương pháp nuôi cấy bao phấn các tổ hợp lai F1, các nhà khoa học Việt Nam đã tạo ra nhiều dòng đơn bội kép cho năng suất cao, chất lượng tốt như giống lúa: OM 3007-16-37, OM 3007-42-94, giống lúa AC5 (Viện cây lương thực), Giống lúa SL12 (Viện Di truyền Nông nghiệp), giống lúa VH1, VH2 của viện Công nghệ sinh học) [9], [10]

Năm 2003, Nguyễn Thị Kim Tiến và cộng sự, đã sử dụng 2 môi trường N6 và MS để nuôi cấy bao phấn 8 tổ hợp lai F1, bố, mẹ là các giống lúa bản địa chất lượng cao như DS20, IR68144, Kloong Luang 1, Suphan Buri Tác giả đã chọn được 300 dòng lúa đơn bội kép trong đó có một số dòng rất triển vọng, hơn hẳn bố mẹ về năng suất mà chất lượng gạo ngon Các tác giả kết luận: Sử dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống lúa chất lượng rất có hiệu quả

Năm 2005, Các nhà khoa học Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm đã kết hợp lai hữu tính và nuôi cấy bao phấn, chọn tạo thành công giống lúa NC2, PĐ211 [11]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Vật liệu gồn 9 dòng mẹ ngắn ngày, có đặc tính nông sinh học tốt và 35 dòng bố trong đó có dòng Japonica và các dòng NILS Một số dòng sử dụng chính trong thí nghiệm được tập hợp vào bảng 2.1

Bảng 2.1: Xuất sứ của một số dòng vật liệu chính sử dụng trong nghiên cứu

8 R25 Trung tâm KKN GCT &PBQG Chưa rõ

11 TGMS-VN1 Viện Di truyền Nông nghiệp Chưa rõ

18 TGMS-H20 Viện CLT và CTP Chưa rõ

- Các nòi vi khuẩn bạc lá: Nòi 3 - (HAU01043), Nòi 9 - (HAU02009-2), Nòi 19 - (HAU02034-6),

- Các cặp mồi SSR liên kết với gen kháng bạc lá Xa4, Xa7, Xa21: MP1-MP2,

P3, pTA248,

- Các cặp mồi liên kết với gen S 5 n: RM225, RM253

- Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR

được trình bày trong bảng sau:

Bảng 2.2: Trình tự các cặp mồi liên kết với các gen chính sử dụng trong PCR

nghiên cứu chọn tạo

KH mồi Gen Trình tự mồi

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Thu thập và đánh giá vật liệu bằng phương pháp thông thường

và bằng chỉ thị phân tử, sàng lọc chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng bạc lá và gen tương hợp rộng

Nội dung 2: Chọn tạo dòng bố, mẹ (TGMS) lúa lai hai dòng mang gen kháng

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá các đặc tính nông sinh học của các dòng lúa.Theo phương pháp của IRRI (1996)[7]

Phương pháp bố trí thí nghiệm đánh giá khảo nghiệm

- Thời vụ: Vụ Xuân gieo ngày 25 tháng 1 đến 5 tháng 2, vụ Mùa gieo từ

5-15 tháng 6

- Thí nghiệm được bố trí bố trí kiểu khối ngẫu nhiên hoàn toàn (RCBD), nhắc lại 3 lần, giống đối chứng BTST

- Diện tích ô thí nghiệm 10 m2, mật độ cấy 45 khóm/ m2

+ Bón phân: Lượng phân tổng số bón cho 1 ha: Phân vi sinh, 120 N, 85

P2O5, 110 K2O

Các tính trạng theo dõi:

- Thời gian sinh trưởng: Tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các khóm

- Chiều cao cây: Đo từ mặt đất đến đỉnh bông cao nhất không kể râu

- Chiều dài bông

- Chiều dài cổ bông

- Chiều dài lá đòng

- Dảnh hữu hiệu: Đếm tất cả các bông trong một khóm

- Tỷ lệ hạt chắc, hạt lép trên bông

- Chiều dài, chiều rộng hạt

- Khối lượng 1000 hạt(g): Phơi khô hạt đạt độ ẩm 13%

Số liệu thô của các đặc tính nông sinh học trên được xử lí bằng phần mềm

- Màu lá, cách sắp xếp lá

- Khả năng kháng bệnh bạc lá

- Năng suất lý thuyết = Mật độ × Số bông hữu hiệu/khóm × Số hạt chắc/bông

× khối lượng 1000 hạt (g) × 1/100

- Năng suất thực thu: Gặt các ô thí nghiệm (không tính các khóm đã lấy mẫu), tuốt hạt và phơi đến khi độ ẩm của hạt đạt tới 13% thì quạt sạch và cân khối lượng, rồi quy ra tạ/ha

2.3.2 Phương pháp đánh giá mức độ kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo (Theo phương pháp của Furuya, N et al (2003)

* 4 nòi vi khuẩn phổ biến ở Bắc Việt Nam được sử dụng trong thí nghiệm này Danh sách các nòi được sử dụng để lây nhiễm nhân tạo như sau:

Bảng 2.3 Một số nòi vi khuẩn bạc lá sử dụng trong lây nhiễm nhân tạo

TT Nòi Kí hiệu Nòi Phân lập từ

giống

Địa điểm thu thập mẫu bệnh

Năm thu mẫu

1 Nòi 3 HAU01043 TN – 14 Gia Lâm – Hà nội 2001

2 Nòi 9 HAU02009-2 Tạp giao 1 Diễn Châu –

là thích hợp cho lây nhiễm

- Trồng cây ngoài đồng ruộng thí nghiệm, khi cây làm ở giai đoạn làm đòng tiến hành lây nhiễm nhân tạo bằng cách:

+ Đeo thẻ đánh dấu vào cây ứng với 4 nòi vi khuẩn

+ Sử dụng kéo đã khử trùng bằng cồn nhúng vào ống đựng dung dịch vi khuẩn, sau đó cắt đoạn đầu lá từ 2 – 5cm tương ứng với cây đã đánh dấu Cứ cắt 3 – 5 lá lại phải nhúng kéo vào dung dịch vi khuẩn một lần Chú ý, vuốt đầu ngọn lá của một cây rồi cắt để tránh cắt nhầm sang lá của cây bên cạnh

- Giữ ẩm ruộng lúa thường xuyên

- Sau 18 -20 ngày lây nhiễm tiến hành đo chiều dài vết bệnh Đo toàn bộ các lá đã lây nhiễm, đo từ đầu vết cắt xuống phía dưới đến hết vết bệnh, tính trung bình

* Thang điểm đánh giá

Đánh giá theo phương pháp đo chiều dài vết bệnh của Satoru Taura (Nhật Bản)

Bảng 2.4: Thang điểm đánh giá mức độ kháng bệnh

Chiều dài vết bệnh sau 18 – 20

ngày lây nhiễm (cm)

>18 Nhiễm cao – high susceptible (HS)

2.3.3 Phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen kháng bệnh bạc

lá và gen tương hợp rộng

* Phương pháp tách chiết ADN:

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp "NaOH extraction" của Wang (1992) Quy trình tách chiết ADN bao gồm các bước:

* Kỹ thuật PCR:

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Veriti 96well Thermal cycler Tổng dung dịch phản ứng là 15 µl bao gồm 5µl ADN, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa Điều kiện phản ứng PCR như sau: 950C - 7 phút; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giây, 550C - 30 giây, 720C - 1 phút; 720C - 5 phút; giữ mẫu ở 40C Sản phẩm PCR được phân giải trên gel agarose 3%

* Phương pháp điện di trên gel agarose

Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Texas, Mỹ (2002) có cải tiến

Chuẩn bị gel agarose:

- Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ 3,0%

- Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng

- Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml

- Chuẩn bị khay gel và lược

- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút

- Tra sản phẩm PCR

- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di

- Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh

* Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide

Theo phương pháp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học tổng hợp Texas, Mỹ (2004) có cải tiến

Chuẩn bị gel polyacrylamide

1 Lau kính 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng ethanol 95% với giấy mềm

2 Chuẩn bị dung dịch đổ gel

3 Lắp ráp kính và cài phần răng lược vào tấm kính để đổ gel

4 Để gel đông tự nhiên ít nhất 2 giờ

Bảng 2.5: Thành phần hóa chất của gel Polyacrylamide

- Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide

1 Rút lược ra khỏi gel Lau sạch gel dính phía trên khuôn gel bằng nước cất

2 Dựng gel lên giá chạy Đổ 1 lít TBE 1X (10,8g Tris base: 0,92g EDTA: 5,52g Boric acid trong 1 lit dung dịch) vào phía trên và dưới của bể điện di

3 Chuẩn bị mẫu: Thêm Dye 3X với tỷ lệ thể tích là 5µlDye/15µl mẫu

4 Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel Tra 15µl của từng mẫu vào giếng

- Đặt bản gel trong máy soi UV, chụp ảnh

- Tách chiết và tinh sạch ADN

- Nhân nhanh số lượng ADN bằng kỹ thuật PCR

- Kiểm tra phản ứng trên gel agarose

- Điện di sản phẩm PCR biến tính trên gel polyacrylamide

- Nhuộm bản gel thu được bằng dung dịch AgNO3

2.3.4 Phương pháp lai và đánh giá ưu thế lai

Sử dụng các phép lai đơn, lai kép, lai quy tụ theo phương pháp thông thường

Đánh giá ưu thế lai theo phương pháp của Trung tâm nghiên cứu và Phát triển Lúa lai Hồ Nam, Trung Quốc Yuan LP (1996)[47]

§¸nh gi¸ −u thÕ lai b»ng c«ng thøc:

F1 – ĐC

Ưu thế lai thực: ƯTLT = x 100 %   

      ĐC

- F1 là chỉ số của con lai

- ĐC là chỉ số của giống lúa đang được trồng phổ biến làm đối chứng

2.3.5 Phương pháp nuôi cấy bao phấn lúa

Môi trường nuôi cấy: Sử dụng 2 loại môi trường cơ bản là N6 (Chu et

al 1978) và MS (Murashige ADN Skoog 1962)

Một số điều kiện nuôi cấy:

* Tạo mô sẹo trong tối

* Tái sinh cây xanh ở điều kiện chiếu sáng: 4000 - 5000 lux

* Thời gian chiếu sáng 13 - 14 giờ/ngày

* Nhiệt độ phòng chiếu sáng 22 - 240C

* Độ ẩm phòng 50 - 70%

a Phương pháp lẫy mẫu nghiên cứu

Mỗi tổ hợp lúa lấy khoảng 20 đòng ở giai đoạn phù hợp, chọn những đòng chính đạt tiêu chuẩn ở các khóm lúa khác nhau, cho vào túi nilông sạch, đeo thẻ ghi tên, ghi ngày lấy đòng

b Phương pháp xử lý mẫu trước khi cấy

Khi mẫu được lấy ở ngoài đồng về, đòng được cắt bớt lá cho gọn, dùng bông thấm nước tẩm cồn 900 lau sạch để khử trùng sơ bộ, cho đòng vào túi nilông sạch, buộc chặt miệng túi rồi đưa vào xử lý lạnh 8 - 100C sau ít nhất 3 ngày có thể sử dụng để nuôi cấy

c Phương pháp khử trùng môi trường trước khi nuôi cấy

Môi trường được đổ vào ống nghiệm sạch, mỗi ống nghiệm chứa 10 -

15 ml môi trường, khử trùng với áp suất 1,1 atm trong 20 phút Khử trùng xong để môi trường vào các giá sau ít nhất một ngày mới mang đi nuôi cấy

d Phương pháp lấy bao phấn đưa vào môi trường nuôi cấy

Sau khi đã khử trùng lần cuối trong tủ cấy và bằng cồn 700, tiến hành bóc bẹ lá bao bên ngoài đòng, cắt hoa lúa vào đĩa petri rồi đậy kín lại Dùng panh gắp hoa lúa trong đĩa petri lên, lấy kéo cắt bỏ phía dưới của vỏ trấu, sau

đó dùng kéo gõ nhẹ bên trên miệng ống nghiệm, để bao phấn rơi trên mặt môi trường Mỗi ống nghiệm cấy khoảng 40 bao phấn

e Phương pháp cấy chuyển callus sang môi trường tái sinh cây

Khi callus được hình thành từ bao phấn (4 - 6 tuần sau khi cấy) có đường kính 1 - 2 mm trở lên được chuyển sang môi trường tái sinh cây xanh Mỗi ống nghiệm chỉ cấy 1 callus

2.3.6 Phương pháp xử lí số liệu

Xử lý số liệu theo chương trình Excel 5.0 trên máy vi tính

∑ mô sẹo tạo thành Tần suất hình thành mô sẹo = ───────────── x 100 %

∑ mẫu

∑ mô tạo chồi Tần suất tái sinh cây = ────────── x 100 %

∑ mô thí nghiệm ∑ Xi

n là tổng số mẫu

x là giá trị trung bình Các mẫu được xử lý thống kê với mức có ý nghĩa α = 0,05

SƠ ĐỒ CHỌN TẠO DÒNG BỐ, MẸ BẰNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

(nuôi cấy đơn bội, chỉ thị phân tử) kết hợp với phương pháp thông thường.

Bước 1: TGMS-VN-1 X IRBB62 Pêi ải 64S X IRBB62

Lai tạo con lai kháng bạc lá

Bước 2: Lai qui tụ Pêi ải 64S X F1 X F1 X TGMS-VN-1

Con lai qui tụ F1-2

Bước 3: Chọn lọc con lai qui tụ

gen kháng bạc lá bằng chỉ thị phân tử.

Con lai quy tụ gen kháng bạc lá.

Bước 4: Nuôi cấy bao phấn con lai

đã quy tụ gen tạo dòng đơn bội kép.

Dòng đơn bội kép

Bước 5: Đánh giá dòng đơn bội kép

bằng lây nhiễm nhân tạo

Dòng bố, mẹ có đặc tính tốt, kháng bệnh bạc lá.

Bước 6: Kiểm tra dòng bố, mẹ

kháng bạc lá bằng chỉ thị phân tử

Dòng bố, mẹ mang gen kháng bạc lá.

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thu thập và đánh giá vật liệu

3.1.1 Thu thập vật liệu

Những dòng bố, mẹ tạo ra từ trong nước và nước ngoài được thu thập từ một số đơn vị nghiên cứu lúa thuần, lúa lai trong nước Viện CLT và CTP, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Trung tâm KKN giống, SPCT và PBQG, Viện DTNN

Các dòng NILs kháng bệnh bạc lá được thu thập từ Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI

Bảng 3.1: Một số vật liệu chính sử dụng trong nghiên cứu

Gen kháng

7 TGMS-VN1 Viện Di truyền Nông nghiệp Chưa rõ

13 TGMS-H20*** TT NC & PTLT Viện CLT&CTP Chưa rõ

Ngoài những vật liệu chính trong bảng 3.1 còn sử dụng 37 dòng lúa thuần khác nhau làm dòng bố cho phấn để tạo con lai F1, 5 dòng có nguồn gốc Japonica để đánh giá khả năng kết hợp của các dòng mẹ thu thập và tạo ra

3.1.2 Đánh giá một số chỉ tiêu nông sinh học của vật liệu

Vật liệu thu thập được trồng để đánh giá vụ Xuân và vụ Mùa 2009 tại Hoàng Đông, Duy tiên, Hà Nam Số liệu được tập hợp ở bảng 3.2 và 3.3

Bảng 3.2: Một số đặc tính nông sinh học của các dòng mẹ vụ Xuân năm 2009

tại Hoàng Đông, Duy Tiên, Hà Nam

TGST (ngày)

C.cao cây (cm)

Số lá trên thân chính

Số hoa/

bông

Tỷ lệ thò vòi nhụy (%)

KL

1000 hạt (g)

** Giống từ TT Khảo kiểm nghiệm Giống cây trồng và Phân bón Quốc gia

*** Giống của TT Nghiên cứu và Phát triển lúa thuần, Viện CLT và CTP

**** Giống của trường ĐHNN Hà Nội

Số liệu của bảng 3.2 cho thấy các dòng mẹ thu thập được đều có tỷ lệ thò vòi nhụy sau khi nở hoa cao trên 60% trong đó dòng PA64S là dòng có tỷ

lệ thò vòi nhụy ra ngoài thấp nhất 60,5%, không những thế kích thước của vòi nhụy nhỏ nên năng suất hạt lai khi sử dụng dòng này làm mẹ không cao Các dòng 103S, TGMS-H20, TGMS-VN1 có tỷ lệ thò vòi nhụy trên 70%, dòng BoS và DBoS có tỷ lệ thò vòi nhụy ra ngoài sau khi nở hoa trên 80% và kích thước vòi nhụy lớn hơn, muốn tạo ra được dòng mẹ có tỷ lệ thò vòi nhụy cao hơn với vòi nhụy to hơn cần lai với các dòng mẹ này

Bảng 3.3: Một số đặc tính nông sinh học của các dòng bố vụ Xuân năm 2009

tại Hoàng Đông, Duy Tiên, Hà Nam

STT Dòng bố TGST

(ngày)

C cao cây (cm)

Số hạt/

bông

Tỷ lệ lép (%)

KL

1000 hạt (g)

NSLT (tạ/ ha)

NSTT (tạ/ ha)

Chú thích:

* Giống lấy từ dự án DA 15

** Giống từ TT Khảo kiểm nghiệm Giống cây trồng và Phân bón Quốc gia

*** Giống của TT Nghiên cứu và Phát triển lúa thuần, Viện CLT và CTP

Các dòng IRBB là các dòng mang gen kháng bệnh bạc lá của viện lúa IRRI

3.1.3 Đánh giá mức độ nhiễm bệnh bạc lá của vật liệu bằng lây nhiễm nhân tạo

Các dòng bố, mẹ lúc bắt đầu có đòng bắt đầu lây nhiễm nhân tạo bằng

8 nòi bạc lá khác nhau, tuy vậy chỉ có 3 nòi 3, 9, 19, sau 18 ngày sau khi lây nhiễm nhân tạo, cho kết quả khác biệt rõ rệt giữa dòng kháng chuẩn với đối chứng nhiễm chuẩn Vì vậy, các thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo sau này chỉ sử dụng 3 nòi này để đánh giá tập đoàn vật liệu, con lai và các dòng đơn bội kép Kết quả lây nhiễm nhân tạo của các dòng bố, mẹ sau 18 ngày lây nhiễm nhân tạo chiều dài vết bệnh của dòng mẹ được tập hợp vào bảng 3.4 và dòng bố vào bảng 3.5

Bảng 3.4: Mức độ nhiễm bệnh bạc lá của dòng mẹ bằng lây nhiễm nhân tạo

vụ Xuân 2009 tại Hoàng Đông Duy Tiên, Hà Nam

Chiều dài vết bệnh (cm) Mức độ nhiễm bệnh

Chú thích:

* Giống của dự án DA15

** Giống từ TT Khảo kiểm nghiệm Giống cây trồng và Phân bón Quốc gia

*** Giống của TT Nghiên cứu và Phát triển lúa thuần, Viện CLT và CTP

**** Giống của Trường ĐH NN Hà Nội

Vết bệnh <4cm: HR; 4-8cm: R; 8-12cm: MR; 12-18cm: S; >18cm: HS

Kết quả bảng 3.4 cho thấy dòng BoS và DBoS nhiễm và nhiễm mạnh với 3 nòi bạc lá, dòng TGMS1 kháng nhẹ với cả 3 nòi, dòng TGMS2 nhiễm nhẹ với nòi 3 và 9, kháng với nòi 19 Các dòng khác nhiễm hoặc kháng nhẹ với các nòi

Bảng 3.5: Mức độ nhiễm bệnh bạc lá của dòng bố bằng lây nhiễm nhân tạo

vụ Xuân 2009 tại Hoàng Đông Duy Tiên, Hà Nam

Chiều dài vết bệnh (cm)

Mức độ kháng bệnh

Xa4 ít có giá trị sử dụng để tạo vật liệu trong nghiên cứu chọn tạo giống

kháng bệnh bạc lá Dòng IRBB5 kháng với nòi 3,9 và kháng cao với nòi 19 trong khi đó dòng IRBB7 kháng cao với nòi 3 và nòi 19 nhưng kháng với nòi

9 Dòng IRBB21 kháng với nòi 3 và kháng cao với nòi 9 và 19 như vậy các

dòng mang đơn gen Xa5, Xa7, Xa21 vẫn còn khả năng kháng bệnh bạc lá

Dòng đa gen IRBB57, IRBB60, IRBB61, IRBB62 kháng rất tốt với các nòi

bạc lá trong đó dòng IRBB62 mang 3 gen trội Xa4, Xa7, Xa21 Các dòng đơn gen Xa7, Xa21 vẫn kháng được bệnh bạc lá vì vậy sử dụng dòng IRBB62 đã

quy tụ được các gen trên làm nguồn vật liệu chính trong lai tạo thì xác suất thu nhận được dòng kháng bệnh bạc lá rất cao, vì vậy những nghiên cứu lai tạo sau này chỉ tập trung nghiên cứu và sử dụng dòng này

3.1.4 Đánh giá khả năng kết hợp rộng của các dòng mẹ sử dụng làm vật liệu lai tạo

Sử dụng 5 dòng lúa thuộc phân loài phụ Japonica làm dòng bố lai với các dòng mẹ, kết quả đánh giá một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất của con lai ở vụ Mùa 2009 tại Hoàng Đông, Duy Tiên, Hà Nam được tập hợp vào bảng 3.6

Bảng 3.6: Một số chỉ tiêu nông sinh học và các yếu tố cấu thành năng suất của con lai ở vụ Mùa 2009 tại Hoàng Đông, Duy Tiên, Hà Nam

Tên tổ hợp lai

TGST (ngày)

C cao cây (cm)

Số hạt/

bông

Tỷ lệ lép (%)

KL

1000 hạt (g)

NSLT (tạ/ ha)

NSTT (tạ/ ha) TGMS-VN1/Jap1 112 110,5 172,6 42,6 25,5 88,42 61,90 TGMS-VN1/Jap2 98 115,6 142,7 35,7 24,5 78,68 55,08