Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam

Bộ y tế viện dợc liệu Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ sử dụng chỉ thị phân tử adn kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam Chủ nhiệm đề tài: ts . nguyễn văn tập 6913 01/7/2008 hà nội - 2007 Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Thông tin chung về đề tài 1. Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam 2. Chủ nhiệm đề tài : TS. Nguyễn Văn Tập 3. Phó chủ nhiệm đề tài : ThS. Phạm Thanh Huyền 4. Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dợc Liệu (Bộ Y tế) 5. Kinh phí thực hiện : 220.000. 000 đồng (Hai trăm hai mơi triệu đồng) 6. Danh sách những ngời thực hiện chính: - TS. Nguyễn Văn Tập: Viện Dợc liệu - Chủ nhiệm đề tài - ThS. Phạm Thanh Huyền: Viện Dợc liệu - Phó chủ nhiệm đề tài - TS. Đinh Đoàn Long: Khoa Sinh học, trờng Đại học KHTN Hà Nội - CN. Ngô Văn Trại: Viện Dợc liệu - ThS. Lê Thanh Sơn: Viện Dợc liệu - ThS. Ngô Đức Phơng: Viện Dợc liệu - KTV. Cù Hải Long: Viện Dợc liệu - ThS. Hoàng Thị Hòa: Khoa Sinh học, trờng Đại học KHTN Hà Nội 7. Thời gian thực hiện: từ tháng 10 năm 2005 đến tháng 10 năm 2007 Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt ADN Axit deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài các phân đoạn khuếch đại) BK Ba kích DĐVN Dợc điển Việt Nam ĐDSH Đa dạng sinh học FAO The Food and Agriculture Orgnization of the United Nation (Tổ chức lơng thực và nông nghiệp Liên hiệp quốc) NGBG Ngũ gia bì gai NGBGL Ngũ gia bì gai lông NGBH Ngũ gia bì hơng HN Bảo tàng thực vật (thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học Việt Nam) HNPM Bảo tàng Dợc liệu (thuộc Khoa Tài nguyên dợc liệu, Viện Dợc liệu) HNU Bảo tàng thực vật (thuộc Khoa Sinh học, Trờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) HPLC High perfomance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp) IUCN The International Union for Conservation of Nature and Natural Resouses (Tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế) KHKT Khoa học kỹ thuật NXB Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN) RAPD- PCR Random Amplified Polymorphic DNA(Đa hình các phân đoạn ADN khuếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restricted Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài các đoạn giới hạn) SKLM Sắc ký lớp mỏng SSR Simple Sequence Repeats (Đa hình các trình tự lặp lại đơn giản SSR) SVD Sâm vũ diệp SNL Sâm ngọc linh T o / t o Nhiệt độ TB Trung bình TG Trung gian TTH Tam thất hoang WWF The World Wildlife Fund (Quĩ quốc tế bảo vệ động vật hoang dã) Mục lục Trang đặt vấn đề 1 Chơng 1. Tổng quan 3 1.1.Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam của các đối tợng nghiên cứu 3 1.1.1. Về thực vật học 3 1.1.1.1. Ngũ gia bì hơng, Ngũ gia bì gai 3 1.1.1.2. Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh 5 1.1.1.3. Ba kích 7 1.1.2. Về giá trị sử dụng 8 1.1.2.1 Ngũ gia bì hơng, Ngũ gia bì gai 8 1.1.2.2. Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh 10 1.1.2.3. Ba kích 13 1.1.3. Vài nét về vấn đề bảo tồn 14 1.2.Tổng quan về các loại chỉ thị và dấu chuẩn trong nghiên cứu thảo dợc trên thế giới và ở Việt Nam 16 1.2.1. Chỉ thị (kỹ thuật) RAPD-PCR 17 1.2.2. ứng dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị phân tử ADN ở Việt Nam 20 Chơng 2. Đối tợng, nội dung và phơng pháp Nghiên cứu 22 2.1. Đối tợng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu 22 2.2. Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1. Điều tra thu thập mẫu 22 2.2.2. Xác định tên khoa học và mô tả hình thái các loài 23 2.2.3. Phân tích chỉ thị phân tử ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu 23 2.2.4. Đánh giá về sự kết hợp giữa việc sử dụng chỉ thị ADN với các dấu chuẩn hình thái trong nghiên cứu phân loại phục vụ công tác bảo tồn và phát triển các loài cây thuốc 24 2.3. Phơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Điều tra thu thập mẫu 23 2.3.2. Xác định tên khoa học 24 2.3.3. Phân tích ADN 24 2.3.4. Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.02 25 2.4. Địa điểm nghiên cứu 26 2.5. Trang thiết bị, dung môi hóa chất 26 Chơng 3. kết quả nghiên cứu và bàn luận 27 3.1. Điều tra, thu thập mẫu 27 3.1.1. Thu mẫu tiêu bản thực vật 27 3.1.2. Thu thập mẫu nghiên cứu ADN 28 3.1.3. Thu mẫu dợc liệu chuẩn 29 3.2. Xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của các loài Ngũ gia bì hơng, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích 30 3.3. Kết quả nghiên cứu chỉ thị ADN 39 3.3.1. Nghiên cứu tách chiết ADN 39 3.3.2. Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) để đánh giá sự đa dạng di truyền 49 3.3.3. Bớc đầu xác định một số chỉ thị RAPD-PCR đặc trng của Ngũ gia bì hơng, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích góp phần trong việc xác định loài 73 3.4. Đánh giá về việc sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ chị ADN (RAPD- PCR) trong nghiên cứu 82 3.4.1. áp dụng phơng pháp phân loại hình thái so sánh trong việc xác định các loài NGBH, NGBG, SVD, TTH, SNL và BK và một số vấn đề đòi hỏi phải nghiên cứu 82 3.4.2. Xác định mối tơng đồng giữa chỉ thị hình thái với chỉ thị ADN trong việc xác định các loài NGBH, NGBG, SNL, SVD, TTH và BK 85 Kết luận 88 đề nghị 90 Tài liệu tham khảo 91 Danh Mục các bảng Trang Bảng 3.1. Địa điểm và số lợng các mẫu nghiên cứu ADN của các loài Ngũ gia bì gai (NGBG), Ngũ gia bì hơng (NGBH), Sâm vũ diệp (SVD), Tam thất hoang (TTH), Sâm Việt Nam (SVN) và Ba kích (BK) phục vụ nghiên cứu 28 Bảng 3.2. Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của hai loài Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc sử dụng trong nghiên cứu phân tích ADN 39 Bảng 3.3. Kết quả đo quang phổ hấp thụ của dịch chiết ADN tổng số của các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) 41 Bảng 3.4. Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của ba loài Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian Sâm vũ diệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) 42 Bảng 3.5. Kết quả đo mật độ quang phổ của các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và Tam thất hoang (T) 45 Bảng 3.6. Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của Ba kích (B) 46 Bảng 3.7. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc hai loài Ngũ gia bì hơng và Ngũ gia bì gai phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên 49 Bảng 3.8 Số kiểu di truyền biểu hiện khi sử dụng các mồi RAPD-PCR khác nhau từ kết quả phân tích các mẫu Ngũ gia bì hơng thu thập đợc trong nghiên cứu 52 Bảng 3.9. Số băng RAPD đa hình thu đợc từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai thu ở Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn tính theo từng mồi 52 Bảng 3.10. Hệ số tơng đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) 56 Bảng 3.11. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc ba loài Sâm Ngọc linh (SNL), Sâm Vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên 58 Bảng 3.12. Bảng hệ số tơng đồng di truyền của các mẫu quần thể ba loài Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian (VT) 63 Bảng 3.13. Thống kê số băng ADN thu đợc của 25 mẫu Ba kích (B) nghiên cứu với 12 mồi 66 Bảng 3.14. Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc loài Ba kích với 12 mồi ngẫu nhiên 67 Bảng 3.15. Hệ số tơng đồng di truyền của 25 mẫu thuộc loài Ba kích (B) 69 Bảng 3.16. Các chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp phần phân biệt hai loài Ngũ gia bì hơng và Ngũ gia bì gai 73 Bảng 3.17. Các chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp 78 phần phân biệt ba loài Sâm ngọc linh (SNL), Sâm vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) Bảng 3.18. Các chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp phần phân biệt các dạng hình thái của loài Ba kích (B) 82 Danh Mục các hình vẽ, đồ thị Trang Hình 3.1. Ngũ gia bì hơng (Cành mang nụ hoa) 31 Hình 3.2. Ngũ gia bì gai lông 33 Hình 3.3. Ngũ gia bì gai (Cành mang hoa) 33 Hình 3.4a. Sâm vũ diệp (Cây có quả chín) 34 Hình 3.4b. Sâm vũ diệp lá xẻ nông 34 Hình 3.5. Tam thất hoang (Cây có quả chín) 35 Hình 3.6. Dạng Panax có lá xẻ nông (dạng trung gian của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang) 36 Hình 3.7. Sâm Việt Nam (cây có quả chín) 37 Hình 3.8. Ba kích có quả tụ 38 Hình 3.9. Ba kích có quả rời 38 Hình 3.10. ảnh điện di ADN tổng số các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) 42 Hình 3.11. ảnh điện di ADNts của các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V) , Tam thất hoang (T) và dạng trung gian (VT) 44 Hình 3.12. Kết quả điện di ADN tổng số của các mẫu Ba kích sau khi điện di trên gel agarose 48 Hình 3.13. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gai bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPC9 51 Hình 3.14. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA5 51 Hình 3.15. Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) 57 Hình 3.16. Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V) và Tam thất hoang (T) tơng ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7 cùng biểu đồ chi tiết số băng đa hình (màu ghi) và đồng hình (màu đen) của mỗi loài với từng mồi cụ thể. 59 Hình 3.17. Sơ đồ cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của các loài Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) 64 Hình 3.18. Cây quan hệ di truyền của các mẫu thuộc loài Ba kích (B) 70 Hình 3.19. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA10 74 Hình 3.20. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA15 74 Hình 3.21. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA12 75 Hình 3.22. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA1 75 Hình 3.23. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hơng (H) và Ngũ gia bì gai (G) đợc khuếch đại bằng mồi OPA4 76 Hình 3.24. ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vĩ diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm vũ diệp - Tam thất hoang (VT) đợc khuếch đại bằng mồi OPA14 và OPA16 77 Hình 3.25. Kết quả điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1 79 Hình 3.26. Kết quả điện di các mẫu ba kích với mồi OPC3 80 Hình 3.27. Hình ảnh một số băng đồng hình từ kết quả điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA17 81 Hình 3.28. Hình ảnh một số băng đồng hình từ kết quả điện di các mẫu ba kích với mồi OPA15 81 [...]... hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam" , với các mục tiêu sau đây: Mục tiêu chung: Tiếp cận đợc với một phơng pháp mới trong việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với phơng pháp phân loại hình thái cổ điển, nhằm xác định chính xác tên khoa học của các loài cây thuốc, góp phần định hớng cho công tác bảo tồn, cũng nh góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm định dợc liệu ở Việt Nam. .. 2007 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD-PCR nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền và góp phần phân loại một số kiểu hình thái của cây Ba Kích (Morinda officinalis How) ở Việt Nam (2) Họ và tên sinh viên: Nguyễn Minh Hờng Năm tốt nghiệp: 2007 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong đánh giá đa dạng di truyền và góp phần phân loại một số loài cây thuốc quý thuộc chi Panax L ở Việt Nam (3) Họ và... thế đáng kể so với các chỉ thị cảm quan hoặc hoá học vì nó hầu nh không bị ảnh hởng bởi các yếu tố môi trờng, ngoại cảnh, tuổi cây hay tình trạng sinh lý khi thu hái Đồng thời, sử dụng các chỉ thị ADN còn có thể đánh giá đợc mức độ đa dạng di truyền trong các loài cây thuốc. Nh vậy, sử dụng các chỉ thị ADN trớc hết sẽ giúp cho việc phân tích chính xác các loài cây thuốc hay giữa các loại dợc liệu gây... (var.) của chi Panax L ở Trung Quốc trở lại với bậc phân loại loài hoàn chỉnh [79, 80, 81] Hoặc áp dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị ADN, Park Sy, et al (2004) còn đánh giá đợc về mối quan hệ di truyền giữa một số loài trong chi Acanthopanax [63] 1.2.2 ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu chỉ thị phân tử ADN ở Việt Nam Khoảng hơn chục năm trở lại đây, với những thành tựu của... Huyền Kết quả: Đạt giải Nhì toàn trờng * Công bố đợc 2 bài báo khoa học trong Báo cáo Hội nghị Dợc liệu toàn quốc và Tạp chí khoa học của Đại học Quốc gia Hà Nội Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2007 Chủ nhiệm đề tài TS Nguyễn Văn Tập danh sách tác giả của đề tài KH & CN cấp Bộ 1 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam. .. áp dụng và kết quả mang lại thờng khả quan trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền, góp phần phân loại các loài thực vật nói chung và cây thuốc nói riêng một cách chính xác Đặc biệt là những taxon có quan hệ gần gũi về mặt di truyền và có các đặc điểm hình thái tơng tự nhau Xuất phát từ tình hình thực tế nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài "Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình. ..bản tự đánh giá Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH & CN cấp Bộ 1 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam 2 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tập 3 Phó chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thanh Huyền 4 Cơ quan chủ trì... các tài liệu đã công bố, Ba kích phân 7 bố ở một số tỉnh phía Nam của Trung Quốc (tỉnh Quảng Tây, Vân Nam ), Lào và Việt Nam [3, 5, 6, 13, 14, 31, 92] ở Việt Nam, Ba kích là một cây thuốc quan trọng, nên đã đợc đề cập tới trong tất cả các tài liệu về hệ thực vật cũng nh về cây thuốc ở Việt Nam [3, 5, 6, 13, 14, 31] Theo các tài liệu đã công bố, Ba kích phân bố ở một số tỉnh thuộc vùng núi thấp và trung... biệt di truyền rõ nét hơn so với đặc điểm có quả tụ hay quả rời Tuy nhiên, về thứ Ngũ gia bì lông (A trifoliatus var setosus) - Với kết quả nghiên cứu chỉ thị ADN hiện có, cha thật đầy đủ các dẫn liệu để khẳng định sự khác biệt với loài gốc của nó - Bớc đầu đã đa ra đợc sự phân tích về sự kết hợp giữa phơng pháp nghiên cứu phân loại hình thái với phơng pháp sử dụng chỉ thị ADN trong việc xác định chính... xác định chính xác các loài cây thuốc hoặc dợc liệu, phục vụ cho yêu cầu bảo tồn và phát triển, nhằm cung cấp đợc các nguyên liệu làm thuốc có chất lợng cao Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử, ADN, cũng nh chỉ thị hoá học , nh một công cụ bổ sung cho công tác 1 kiểm định cây thuốc và dợc liệu Trong các phơng pháp về chỉ thị ADN cần kể đến các chỉ thị RAPD-PCR Đây . liệu Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ sử dụng chỉ thị phân tử adn kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam Chủ nhiệm đề tài:. kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ Thông tin chung về đề tài 1. Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở. tài KH & CN cấp Bộ 1. Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam 2. Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Văn