Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam

Bộ y tế viện d−ợc liệu Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ sử dụng chỉ thị phân tử adn kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở việt nam Chủ nhiệm

Bộ y tế

viện d−ợc liệu

Báo cáo tổng kết đề tài cấp bộ

sử dụng chỉ thị phân tử adn kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại

một số cây thuốc ở việt nam

Chủ nhiệm đề tài: ts nguyễn văn tập

6913

01/7/2008

hà nội - 2007

Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ

Thông tin chung về đề tài

1 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong

nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam

2 Chủ nhiệm đề tài : TS Nguyễn Văn Tập

3 Phó chủ nhiệm đề tài : ThS Phạm Thanh Huyền

4 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu (Bộ Y tế)

5 Kinh phí thực hiện : 220.000 000 đồng (Hai trăm hai mươi triệu đồng)

6 Danh sách những người thực hiện chính:

- TS Nguyễn Văn Tập: Viện Dược liệu - Chủ nhiệm đề tài

- ThS Phạm Thanh Huyền: Viện Dược liệu - Phó chủ nhiệm đề tài

- TS Đinh Đoàn Long: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội

- CN Ngô Văn Trại: Viện Dược liệu

- ThS Lê Thanh Sơn: Viện Dược liệu

- ThS Ngô Đức Phương: Viện Dược liệu

- KTV Cù Hải Long: Viện Dược liệu

- ThS Hoàng Thị Hòa: Khoa Sinh học, trường Đại học KHTN Hà Nội

7 Thời gian thực hiện: từ tháng 10 năm 2005 đến tháng 10 năm 2007

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

ADN Axit deoxyribonucleic

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài các phân

đoạn khuếch đại)

BK Ba kích

DĐVN Dược điển Việt Nam

ĐDSH Đa dạng sinh học

FAO The Food and Agriculture Orgnization of the United Nation (Tổ chức

lương thực và nông nghiệp Liên hiệp quốc)

NGBG Ngũ gia bì gai

NGBGL Ngũ gia bì gai lông

NGBH Ngũ gia bì hương

HN Bảo tàng thực vật (thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện

Khoa học Việt Nam)

HNPM Bảo tàng Dược liệu (thuộc Khoa Tài nguyên dược liệu, Viện Dược

liệu)

HNU Bảo tàng thực vật (thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự

nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội)

HPLC High perfomance liquid chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

IUCN The International Union for Conservation of Nature and Natural

Resouses (Tổ chức bảo tồn thiên nhiên quốc tế)

RFLP Restricted Fragment Length Polymorphism (Đa hình độ dài các đoạn

TTH Tam thất hoang

WWF The World Wildlife Fund (Quĩ quốc tế bảo vệ động vật hoang dã)

Mục lục

Trang

đặt vấn đề 1

Chương 1 Tổng quan 3

1.1.Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam của các đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Về thực vật học 3

1.1.1.1 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai 3

1.1.1.2 Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh 5

1.1.1.3 Ba kích 7

1.1.2 Về giá trị sử dụng 8

1.1.2.1 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai 8

1.1.2.2 Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh 10

1.1.2.3 Ba kích 13

1.1.3 Vài nét về vấn đề bảo tồn 14

1.2.Tổng quan về các loại chỉ thị và dấu chuẩn trong nghiên cứu thảo dược trên thế giới và ở Việt Nam 16

1.2.1 Chỉ thị (kỹ thuật) RAPD-PCR 17

1.2.2 ứng dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị phân tử ADN ở Việt Nam 20

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp Nghiên cứu 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu 22

2.2 Nội dung nghiên cứu 22

2.2.1 Điều tra thu thập mẫu 22

2.2.2 Xác định tên khoa học và mô tả hình thái các loài 23

2.2.3 Phân tích chỉ thị phân tử ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu 23

2.2.4 Đánh giá về sự kết hợp giữa việc sử dụng chỉ thị ADN với các dấu chuẩn hình thái trong nghiên cứu phân loại phục vụ công tác bảo tồn và phát triển các loài cây thuốc 24

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Điều tra thu thập mẫu 23

2.3.2 Xác định tên khoa học 24

2.3.3 Phân tích ADN 24

2.3.4 Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS pc 2.02 25

2.5 Trang thiết bị, dung môi hóa chất 26

Chương 3 kết quả nghiên cứu và bàn luận 27

3.1 Điều tra, thu thập mẫu 27

3.1.1 Thu mẫu tiêu bản thực vật 27

3.1.2 Thu thập mẫu nghiên cứu ADN 28

3.1.3 Thu mẫu dược liệu chuẩn 29

3.2 Xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của các loài Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích 30

3.3 Kết quả nghiên cứu chỉ thị ADN 39

3.3.1 Nghiên cứu tách chiết ADN 39

3.3.2 Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) để đánh giá sự đa dạng di truyền 49

3.3.3 Bước đầu xác định một số chỉ thị RAPD-PCR đặc trưng của Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích góp phần trong việc xác định loài 73

3.4 Đánh giá về việc sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ chị ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu 82

3.4.1 áp dụng phương pháp phân loại hình thái so sánh trong việc xác định các loài NGBH, NGBG, SVD, TTH, SNL và BK và một số vấn đề đòi hỏi phải nghiên cứu 82

3.4.2 Xác định mối tương đồng giữa chỉ thị hình thái với chỉ thị ADN trong việc xác định các loài NGBH, NGBG, SNL, SVD, TTH và BK 85

Kết luận 88

đề nghị 90

Tài liệu tham khảo 91

Danh Mục các bảng

Trang

Bảng 3.1 Địa điểm và số lượng các mẫu nghiên cứu ADN của các loài Ngũ

gia bì gai (NGBG), Ngũ gia bì hương (NGBH), Sâm vũ diệp (SVD), Tam thất hoang (TTH), Sâm Việt Nam (SVN) và Ba kích

Bảng 3.2 Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của hai loài

Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) được sử dụng trong

Bảng 3.3 Kết quả đo quang phổ hấp thụ của dịch chiết ADN tổng số của

các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) 41

Bảng 3.4 Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của ba loài Sâm

ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian Sâm vũ diệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) 42

Bảng 3.5 Kết quả đo mật độ quang phổ của các mẫu Sâm ngọc linh (S),

Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và Tam thất hoang (T) 45

Bảng 3.6 Danh sách, địa điểm thu thập và kí hiệu các mẫu của Ba kích (B) 46

Bảng 3.7 Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc hai loài Ngũ gia

bì hương và Ngũ gia bì gai phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên 49

Bảng 3.8 Số kiểu di truyền biểu hiện khi sử dụng các mồi RAPD-PCR

khác nhau từ kết quả phân tích các mẫu Ngũ gia bì hương thu thập được trong nghiên cứu 52

Bảng 3.9 Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ

gia bì gai thu ở Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn tính theo từng

Bảng 3.10 Hệ số tương đồng di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của hai loài

Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) 56

Bảng 3.11 Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc ba loài Sâm Ngọc

linh (SNL), Sâm Vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH) phân tích

Bảng 3.12 Bảng hệ số tương đồng di truyền của các mẫu quần thể ba loài

Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng

Bảng 3.13 Thống kê số băng ADN thu được của 25 mẫu Ba kích (B) nghiên

Bảng 3.14 Số băng RAPD-PCR đa hình của các mẫu thuộc loài Ba kích với

Bảng 3.15 Hệ số tương đồng di truyền của 25 mẫu thuộc loài Ba kích (B) 69

Bảng 3.16 Các chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp

phần phân biệt hai loài Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai 73

phần phân biệt ba loài Sâm ngọc linh (SNL), Sâm vũ diệp (SVD)

và Tam thất hoang (TTH)

Bảng 3.18 Các chỉ thị RAPD-PCR đồng hình và đa hình có thể sử dụng góp

phần phân biệt các dạng hình thái của loài Ba kích (B) 82

Danh Mục các hình vẽ, đồ thị

Trang

Hình 3.1 Ngũ gia bì hương (Cành mang nụ hoa) 31

Hình 3.3 Ngũ gia bì gai (Cành mang hoa) 33

Hình 3.4a Sâm vũ diệp (Cây có quả chín) 34

Hình 3.5 Tam thất hoang (Cây có quả chín) 35

Hình 3.6 Dạng Panax có lá xẻ nông (dạng trung gian của Sâm vũ diệp

Hình 3.7 Sâm Việt Nam (cây có quả chín) 37

Hình 3.10 ảnh điện di ADN tổng số các mẫu Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ

Hình 3.11 ảnh điện di ADNts của các mẫu Sâm ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V) ,

Tam thất hoang (T) và dạng trung gian (VT) 44

Hình 3.12 Kết quả điện di ADN tổng số của các mẫu Ba kích sau khi điện di

Hình 3.13 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gai bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPC9 51

Hình 3.14 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA5 51

Hình 3.15 Sơ đồ hình cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của

hai loài Ngũ gia bì hương (H) và Ngũ gia bì gai (G) 57

Hình 3.16 Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình đầu mũi tên) của các mẫu Sâm

ngọc linh (S), Sâm vũ diệp (V) và Tam thất hoang (T) tương ứng với mồi OPA14, OPC1 và OPA7 cùng biểu đồ chi tiết số băng đa hình (màu ghi) và đồng hình (màu đen) của mỗi loài với từng mồi

Hình 3.17 Sơ đồ cây quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu của các

loài Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang (VT) và Tam thất hoang (T) 64

Hình 3.18 Cây quan hệ di truyền của các mẫu thuộc loài Ba kích (B) 70

Hình 3.19 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA10 74

Hình 3.20 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA15 74

Hình 3.21 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA12 75

Hình 3.22 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA1 75

Hình 3.23 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Ngũ gia bì hương

(H) và Ngũ gia bì gai (G) được khuếch đại bằng mồi OPA4 76

Hình 3.24 ảnh điện di sản phẩm RAPD-PCR các mẫu Sâm ngọc linh (S),

Sâm vĩ diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm

vũ diệp - Tam thất hoang (VT) được khuếch đại bằng mồi

Hình 3.25 Kết quả điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1 79

Hình 3.26 Kết quả điện di các mẫu ba kích với mồi OPC3 80

Hình 3.27 Hình ảnh một số băng đồng hình từ kết quả điện di các mẫu Ba

Hình 3.28 Hình ảnh một số băng đồng hình từ kết quả điện di các mẫu

bản tự đánh giá

Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KH & CN cấp Bộ

1 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong

nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam

2 Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tập

3 Phó chủ nhiệm đề tài: ThS Phạm Thanh Huyền

4 Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Dược Liệu (Bộ Y tế)

5 Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 10 năm 2005 đến tháng 12 năm 2007

6 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 220.000.000 đồng

- Qua nghiên cứu hình thái đã xác định các mẫu thu được thuộc 6 loài:

Acanthopanax gracilistylus, Acanthopanax trifoliatus, Panax vietnamensis, Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus và Morinda officinalis Kết quả giám định này

còn được giám định bới sự khác biệt về chỉ thị ADN khi áp dụng kỹ thuật PCR

RAPD Đã tách chiết được ADN của 6 loài đảm bảo tinh sạch, đáp ứng được yêu cầu cho các bước nghiên cứu tiếp theo (đã xây dựng được qui trình tách chiết)

- áp dụng thành công kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu đối với 6 loài cây thuốc quí hiếm (Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích) Kết quả đã xác định được về tính đa dạng di truyền cũng như bước đầu xác định được một số chỉ thị đặc trưng góp phần phân biệt các

Sâm vũ diệp (P bipinnatifidus ), dạng Ba kích có nhiều lông và không có lông có

thể thuộc hai loài khác nhau Đặc điểm này có sự khác biệt di truyền rõ nét hơn so

với đặc điểm có quả tụ hay quả rời Tuy nhiên, về thứ Ngũ gia bì lông (A trifoliatus var setosus) - Với kết quả nghiên cứu chỉ thị ADN hiện có, chưa thật đầy đủ các

dẫn liệu để khẳng định sự khác biệt với loài gốc của nó

- Bước đầu đã đưa ra được sự phân tích về sự kết hợp giữa phương pháp nghiên cứu phân loại hình thái với phương pháp sử dụng chỉ thị ADN trong việc xác

định chính xác tên khoa học cũng như về định hướng bảo tồn 6 loài cây thuốc quí hiếm kể trên

7.2 Về yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN:

- Về phương pháp nghiên cứu đã áp dụng là phù hợp và tối ưu trong điều kiện nghiên cứu hiện nay ở Việt Nam

- Các số liệu thu được cũng như toàn bộ nhưng xkết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực, đáng tin cậy và chất lượng khoa học cao

7.3 Về tiến độ thực hiện

Đây là đề tài vừa phải đi điều tra thu thập mẫu ở nhiều tỉnh miền núi khác nhau (cả Miền Bắc và Miền Nam), vừa phải tiến hành phân tích một số lượng mẫu lớn của 6 loài (nghiên cứu ADN) Tuy nhiên về tiến độ thực hiện vẫn được thực hiện chặt chẽ, đúng với yêu cầu về thời gian do đề tài đưa ra

8 Về những đóng góp mới của đề tài

Có thể nói gần như toàn bộ những kết quả nghiên cứu của đề tài này đều là những đóng góp mới đối với Việt Nam, thậm chí có nhiều điểm mới đối với khoa học, cụ thể:

8.1 Về giải pháp khoa học công nghệ

- Bước đầu đã ứng dụng thành công chỉ thị ADN (RAPD-PCR) với phương pháp phân loại hình thái cổ điển để xác định chính xác bậc phân loại ở taxon Loài Với kết quả nghiên cứu về tính đặc trưng và hệ số khác biệt di truyền còn có thể xác

định được các dạng hình thái trung gian thuộc loài nào Đồng thời hy vọng cũng sẽ xác định được về mặt phân loại thực vật ở bậc dưới loài

8.2 Về phương pháp nghiên cứu

- Đã xây dựng được qui trình tách chiết ADN đảm bảo độ tinh sạch, phục vụ quá trình nghiên cứu Phương pháp sử dụng chỉ thị ADN sẽ được áp dụng để kiểm

định đối với loại dược liệu thuộc 6 loài trên khi có yêu cầu nghiên cứu kiểm định tại Việt Nam

- Bước đầu đã nắm vững được kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu

8.3 Về những đóng góp mới và kết quả khác:

* Đã góp phần đào tạo 3 cử nhân công nghệ sinh học:

(1) Họ và tên sinh viên: Đàm Quang Hiếu Năm tốt nghiệp: 2007

Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử RAPD-PCR nhằm đánh giá tính đa dạng di

truyền và góp phần phân loại một số kiểu hình thái của cây Ba Kích (Morinda officinalis How) ở Việt Nam

(2) Họ và tên sinh viên: Nguyễn Minh Hường Năm tốt nghiệp: 2007

Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị RAPD-PCR trong đánh giá đa dạng di truyền và

góp phần phân loại một số loài cây thuốc quý thuộc chi Panax L ở Việt Nam

(3) Họ và tên sinh viên: Nguyễn Thị Tuyền Năm tốt nghiệp: 2007

Tên đề tài: Bước đầu đánh giá đa dạng di truyền hai loài cây thuốc Ngũ

gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W Smith) ở Việt Nam bằng chỉ thị

RAPD-PCR

* Đào tạo 1 nghiên cứu sinh về bảo tồn cây thuốc

Họ và tên nghiên cứu sinh: Phạm Thanh Huyền Bảo vệ cấp NN: 2008

Tên đề tài: Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của bốn loài cây thuốc quí

thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae) ở Việt Nam nhằm bảo tồn và phát triển

* Hướng dẫn nhóm sinh viên tham gia Hội nghị Khoa học sinh viên của Trường Đại học Khoa học tự nhiên (Đại học Quốc gia Hà Nội) năm 2007

Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) trong đánh giá đa dạng di

truyền và góp phần phân loại một số loài cây thuốc quý ở Việt Nam

Nhóm sinh viên: Nguyễn Minh Hường, Nguyễn Thị Tuyền, Đàm Quang Hiếu

Người hướng dẫn: TS Đinh Đoàn Long, ThS Phạm Thanh Huyền

Kết quả: Đạt giải Nhì toàn trường

* Công bố được 2 bài báo khoa học trong Báo cáo Hội nghị Dược liệu toàn quốc và Tạp chí khoa học của Đại học Quốc gia Hà Nội

Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2007

Chủ nhiệm đề tài

TS Nguyễn Văn Tập

danh sách tác giả của đề tài KH & CN cấp Bộ

1 Tên đề tài: Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong

nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam

2 Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 10 năm 2005 đến tháng 10 năm 2007

3 Cơ quan chủ trì: Viện D−ợc Liệu

Đặt vấn đề

Phân loại sinh học là một ngành khoa học có lịch sử lâu đời, giúp cho việc nhận biết và phân biệt giữa các taxon cùng với mối quan hệ của chúng trong quá trình tiến hóa

Phương pháp chung được sử dụng trong phân loại các bậc taxon sinh học nói chung và thực vật nói riêng là căn cứ vào các đặc điểm hình thái bên ngoài của các cơ quan sinh dưỡng, đặc biệt là các cơ quan sinh sản (thực vật)

Trong những năm gần đây, trên thế giới cũng như ở nước ta, các chỉ thị ADN (như RAPD, RFLP, SSR …) ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu nguồn gen các tài nguyên sinh vật Trong số các chỉ thị đó, đa hình độ dài các trình tự ADN được khuếch đại ngẫu nhiên RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA) được sử dụng rộng rãi trong việc đánh giá tính đa dạng của các nguồn gen Đây là một phương pháp phân tích hệ gen tương đối đơn giản và nhanh chóng, cho phép so sánh sự đa dạng di truyền trong phạm vi một loài cũng như giữa các loài khác nhau Đối với các loài thực vật, chỉ thị RAPD đã được sử dụng hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền và góp phần phân loại một cách chính xác các taxon dưới loài

Như chúng ta đã biết, trong nguồn tài nguyên thực vật ở nước ta, cây thuốc giữ một vai trò quan trọng trong việc cung cấp thuốc cho y học cổ truyền Tuy vậy, phần lớn các loài cây thuốc hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên nên tất yếu dẫn đến sự suy kiệt nguồn tài nguyên Bên cạnh đó, do thu hái tự phát trong tự nhiên nên chất lượng dược liệu không đồng bộ, hoặc đã xảy ra sự nhầm lẫn, thậm chí còn bị giả mạo Những vấn đề trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết cần có các biện pháp xác định chính xác các loài cây thuốc hoặc dược liệu, phục vụ cho yêu cầu bảo tồn và phát triển, nhằm cung cấp được các nguyên liệu làm thuốc có chất lượng cao

Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng các chỉ thị phân tử, ADN, cũng như chỉ thị hoá học , như một công cụ bổ sung cho công tác

kiểm định cây thuốc và dược liệu Trong các phương pháp về chỉ thị ADN cần

kể đến các chỉ thị RAPD-PCR Đây là kỹ thuật tiên tiến, dễ áp dụng và kết quả mang lại thường khả quan trong việc đánh giá tính đa dạng di truyền, góp phần phân loại các loài thực vật nói chung và cây thuốc nói riêng một cách chính xác Đặc biệt là những taxon có quan hệ gần gũi về mặt di truyền và có các đặc điểm hình thái tương tự nhau

Xuất phát từ tình hình thực tế nói trên, chúng tôi tiến hành đề tài "Sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với các dấu hiệu hình thái trong nghiên cứu phân loại một số cây thuốc ở Việt Nam", với các mục tiêu sau đây:

Mục tiêu chung: Tiếp cận được với một phương pháp mới trong việc sử dụng chỉ thị phân tử ADN kết hợp với phương pháp phân loại hình thái cổ

điển, nhằm xác định chính xác tên khoa học của các loài cây thuốc, góp phần

định hướng cho công tác bảo tồn, cũng như góp phần tiêu chuẩn hóa và kiểm

định dược liệu ở Việt Nam

Mục tiêu cụ thể là:

(1) áp dụng chỉ thị ADN (RAPD - PCR) kết hợp với phương pháp phân loại hình thái cổ điển nhằm xác định chính xác tên khoa học ở bậc phân loại loài hoặc dưới loài của 6 loài cây Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai, Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Ba kích

(2) Thông qua việc áp dụng kỹ thuật RAPD - PCR bước đầu đánh giá sự đa dạng nguồn gen, phục vụ cho yêu cầu bảo tồn, cũng như việc tiêu chuẩn hóa

về kiểm định dược liệu đối với 6 loài cây thuốc thuộc diện quí hiếm kể trên

chương 1 tổng quan

1.1 Tổng quan về tình hình nghiên cứu trên thế giới

và ở việt nam của các đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Về thực vật học

1.1.1.1 Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai

Trên thế giới, Ngũ gia bì hương (NGBH) và Ngũ gia bì gai (NGBG) đều

thuộc chi Acanthopanax Miq., họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Chi này trên thế

giới hiện đã biết có loài, phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới, nhiệt đới hoặc vùng ôn đới ấm của châu á [70, 92]

Ngũ gia bì hương đã được Smith xác định tên khoa học từ năm 1617 là

Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith và từ đó cho đến nay không thấy có

sự thay đổi nào Trên thế giới, loài này mới được phát hiện ở Trung Quốc [70, 92]

Ngũ gia bì gai được Linné xác định đầu tiên với tên khoa học là

Zanthoxylum trifoliatum L., năm 1753 Đến năm 1789 Ait chuyển thành chi Panax với tên khác là Panax aculeatus Ait Sau đó được Witte (1861), H L

Li (1970) xếp vào chi Acanthopanax Đồng thời để ghi nhớ cách đặt tên đầu

tiên của Linné (1753), nên các nhà thực vật học đều thống nhất tên khoa học

của loài Ngũ gia bì gai là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr Về sau, khi

nghiên cứu phân loại họ Araliaceae ở vùng Đông á, H.L.Li đã xác định thêm

trong loài NGBG ở Trung Quốc có một thứ (var.) nữa là A trifoliatus var setosus Li [70, 92] Thứ (var.) này cũng đã được phát hiện ở Việt Nam [3, 8,

2 loài Acanthopanax aculeatus (Ait.) Witte và một loài mới ông thu thập được

ở núi Ba Vì - Hà Tây: A baviensis R.Vig Loài A aculeatus (Ait.) Witt sau trở thành đồng danh (Syn.) của A trifoliatus (L.) Merr Loài NGBH (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) được Grushvitzky và Trương Canh

thu được mẫu lần đầu tiên năm 1969 tại Phó Bảng, Hà Giang Về sau, Nguyễn Tập, Bùi Xuân Chương, Lưu Minh Xư (1973) ghi nhận cụ thể thêm về phân

bố Bao gồm ở thị trấn Phó Bảng, xã Phố Là, Sủng Là (huyện Đồng Văn), xã Mèo Vạc (huyện Mèo Vạc) tỉnh Hà Giang; gần đây còn thấy trồng tại vườn một số nhà dân thuộc xã Quyết Tiến (huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang); xã Hầu Thào (huyện Sa Pa) và thị trấn Bắc Hà, tỉnh Lào Cai [21, 88]

Tổng hợp các chi Acanthopanax Miq ở Việt Nam, Nguyễn Quang Hào

và Mai Nghị (1972) thống kê có 4 loài là Acanthopanax trifoliatus, A gracilistylus, A baviensis và A evodiaefolius [10]

Loài A baviensis do R Viguer thu thập ở Ba Vì, nhưng cho đến nay chưa có ai thu lại được mẫu Còn loài A evodiaefolius hiện đã chuyển sang chi mới (Evodiopanax) Như vậy, theo Nguyễn Tập, Nguyễn Chiều, Ngô Văn

Trại và Mai Nghị (1986) [21]; theo Grushvitzky và Hà Thị Dụng (1990) [8] thì

chi Acanthopanax Miq ở Việt Nam có 2 loài và 1 thứ (var.) sau:

- Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.): phân bố tập

trung ở vùng rừng núi đá vôi, thuộc các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Lai Châu, Lào Cai và rải rác ở các tỉnh Yên Bái, Sơn La, Điện Biên, Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Nam và Kon Tum

- Ngũ gia bì gai lông (Acanthopanax trifoliatus var setosus L.): phân

bố lẫn loài trên ở Lạng Sơn, Lào Cai và Lai Châu

- Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W W Smith): phân bố

rất hẹp ở tỉnh Hà Giang (mọc tự nhiên và trồng) và Lào Cai (trồng)

1.1.1.2 Sâm vũ diệp, Tam thất hoang và Sâm ngọc linh

Trên thế giới, chi Panax L hiện đã biết có 13 loài và dưới loài, phân bố

chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới và ôn đới ấm châu á và châu Mỹ Trong đó, một

số loài như Nhân sâm, Tam thất, Giả nhân sâm, Tây dương sâm đã trở thành cây trồng Các loài mọc tự nhiên còn lại bao gồm cả Sâm vũ diệp (SVD), Tam thất hoang (TTH) và Sâm ngọc linh (SNL) kể trên

Sâm vũ diệp: Tên khoa học của loài Sâm vũ diệp được nhà thực vật học người Đức Berthold Carl Seemann xác định đầu tiên là Panax bipinnatifidus

Seem vào năm 1868 Đến năm 1879, Charles Baron Clarke đã chuyển loài

này sang chi Aralia là Aralia bipinnatifidus (Seem.) C B Clarke, 1879 Sau

Clarke còn có Isaac Henry Burkill lại xếp Sâm vũ diệp cùng loài với Sâm Mỹ

song là thứ (var.) khác của Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan Var major Burkill, 1902 (Kew Bull., 1902: 7); Aralia quinquefolia (L.) Dec et Plan var elegantior Burkill, 1902 (Kew Bull., 1902: 8) [25, 47, 48, 81, 86, 89] Quan

điểm trên tồn tại đến gần giữa thế kỷ 20, khi Hui-Lin Li (1996) nghiên cứu hệ

thực vật Đông á, ông đã đưa Sâm vũ diệp trở lại với chi Panax Đây là một

quan điểm đúng đắn, bởi vì từ đó đến nay, mặc dù Sâm vũ diệp có thể được xếp vào các loài, loài phụ (ssp.) hoặc thứ (var.) khác nhau, nhưng loài này vẫn

thuộc chi Panax với các tên khoa học khác nhau như: Panax pseudoginseng Wall var bipinnatifidus (Seem.) Li., 1942.; Panax pseudoginseng Wall var major (Burkill) Li, 1942.; Panax major Ting ex Pei, 1958.; Panax pseudoginseng Wall spp himalaycus Hara, 1970.; Panax pseudoginseng Wall elegantior (Burkill) Hoo et Tseng, 1973.; Panax japonicus Mey.var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng, 1975 [25, 39, 47, 48, 79, 80, 81, 89, 90, 92]

Cho đến năm 1975, một số nhà nghiên cứu ở Viện Thực vật Côn Minh (Vân Nam, Trung Quốc) khi nghiên cứu về mối quan hệ giữa phân loại và

phân bố địa lý của các loài thuộc chi Panax ở Trung Quốc [86], rồi sau đó là Jun Wen (1999 - 2000) nghiên cứu sâu về sự đa dạng chi Panax ở Trung Quốc

chỉnh, trên cơ sở bổ sung một số chỉ thị ADN [80, 81] Vì thế, Sâm vũ diệp lại

được trở về với tên khoa học là Panax bipinnatifidus Seem do Berthold Carl

Seemann xác định từ năm 1868

Về phân bố, Sâm vũ diệp trên thế giới được ghi nhận ở phía Nam Trung Quốc, Bắc Myanma, Đông - Bắc ấn Độ và Nêpan [25, 47, 48, 81, 86, 89, 92]

Tam thất hoang: Tam thất hoang còn gọi là Bình biên tam thất, Hương

thích hay Bạch tam thất (Trung Quốc) Loài này lúc đầu chỉ được xếp là một

thứ (var.) của loài giả Nhân sâm (Panax pseudoginseng var bipinnatifidus

Hoo et Tseng) cùng với loài Sâm vũ diệp [48] Về sau, khi đã đầy đủ dẫn liệu,

Tam thất hoang được công bố là loài mới đối với khoa học (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng, 1975) bởi một nhóm các nhà thực vật

học Trung Quốc, trong Acta Phytotaxonomy Sinica, số 13 năm 1975 [86]

Đến năm 2000, trong một công bố của Jun Wen , tác giả cũng thừa nhận Tam thất hoang là một loài độc lập [81], với tên khoa học đã được các nhà thực vật Trung Quốc công bố kể trên [86]

Về phân bố, Tam thất hoang hiện mới chỉ thấy ở tỉnh Vân Nam - Trung Quốc Trong công bố năm 1975 của các nhà Thực vật học Trung Quốc cũng ghi nhận còn có ở Lào Cai - thuộc miền Bắc Việt Nam [81, 86]

Cả hai loài SVD và TTH cũng có ở Việt Nam; còn SNL là loài đặc hữu hẹp của Việt Nam - chưa phát hiện thấy ở các quốc gia khác trên thế giới

ở Việt Nam, ngay từ năm 1964 Viện Dược liệu đã thu thập được mẫu SVD và TTH ở Sa Pa (Lào Cai) – với tên gọi địa phương là "Phan xiết" và

"Xán xì" Gần cuối năm 1964, nhà thực vật học người Trung Quốc - Ngô Chỉnh Dật khi đến thăm Viện Dược liệu đã xác định tên khoa học mẫu SVD

thu ở Sa Pa là Panax bipinnatifidus Seem Từ năm 1969, loài cây thuốc này

mới được công bố bởi I V Grushvitzky và một số tác giả trong nước khác [25] Trong khi đó, loài TTH đến giữa thập kỷ 80 của thế kỷ trước vẫn để tên

khoa học là Panax sp [25] Năm 1985 Viện Dược liệu có gửi mẫu TTH (No

1628) sang Liên Xô nhờ giám định Kết quả N Skvortsova đã xác định là P pseudoginseng Wall (?) [25] Đến năm 1993, sau khi tham khảo một công bố

mới của J Zhou, W G Huang, M I Wu, et al (1975), Nguyễn Tập đã xác

định loài Tam thất hoang của Việt Nam có tên khoa học là Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng [86] Từ đó cho đến nay, loài này đã

được chính thức ghi nhận trong hệ thực vật Việt Nam và các tài liệu khác về cây thuốc [3, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 31]

Tuy nhiên, trong quá trình điều tra nghiên cứu SVD và TTH ở Sa Pa

(Lào Cai), Viện Dược liệu còn thu thập được mẫu của dạng Panax có lá xẻ nông Theo tài liệu mô tả về loài P stipuleanatus, các tác giả Trung Quốc đã

xếp dạng hình thái trên vào loài này [81] Đây là một vấn đề cần được xem xét thêm (?)

Sâm ngọc linh: Sâm ngọc linh còn gọi là Sâm khu năm, Sâm Việt Nam

hay là "Thuốc dấu" và "Rơm con" (Xê Đăng) được Đào Kim Long, Nguyễn Châu Giang và Nguyễn Thị Lê phát hiện năm 1973 tại núi Ngọc Linh [25, 31]

Nhưng đến năm 1985 mới được công bố là loài mới: Panax vietnamensis Ha

et Grushv [25, 31, 89] Trước đó, vào năm 1970 Phạm Hoàng Hộ có công bố

loài Panax schinseng var japonicus thu thập được ở núi Lang Bian (Lâm

Đồng) [12] Song về sau, Hà Thị Dụng (1996) đã đính chính và cho rằng loài này vẫn chính là Sâm ngọc linh [13, 14, 25]

Như vậy, thuộc chi Panax L ở Việt Nam hiện có 3 loài mọc tự nhiên,

đó là Sâm vũ diệp và Tam thất hoang ở Sa Pa (Lào Cai) và Sâm ngọc linh ở núi Ngọc Linh thuộc tỉnh Kon Tum, Quảng Nam và đã từng có ở Lang Bian (Lâm

Đồng) [3, 25]

1.1.1.3 Ba kích

Cây Ba kích được xác định tên khoa học là Morinda officinalis How từ

năm 1958 Cây này đã được ghi nhận ở bậc phân loại loài trong Thực vật chí của một số nước trên thế giới [90] Theo các tài liệu đã công bố, Ba kích phân

bố ở một số tỉnh phía Nam của Trung Quốc (tỉnh Quảng Tây, Vân Nam ), Lào và Việt Nam [3, 5, 6, 13, 14, 31, 92]

ở Việt Nam, Ba kích là một cây thuốc quan trọng, nên đã được đề cập tới trong tất cả các tài liệu về hệ thực vật cũng như về cây thuốc ở Việt Nam [3, 5,

6, 13, 14, 31]

Theo các tài liệu đã công bố, Ba kích phân bố ở một số tỉnh thuộc vùng núi thấp và trung du phía bắc, bao gồm Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Lào cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Kạn, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Bắc Giang, Sơn La, Hoà Bình, Hà Tây, Thanh Hóa [3, 5, 6, 13, 14, 31] Gần

đây mới phát hiện hai điểm ở phía Nam thuộc tỉnh Quảng Trị và tỉnh Quảng

Nam [6] Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), cây Ba kích - Morinda officinalis How) còn có tên là Dây ruột gà, tên gọi này cũng để chỉ một số loài cây khác như cây Sam trắng - Bacopa monnieri Pennel.; cây Mộc thông - Clematis chinensis Osbeck [31] Trên thực tế, dược liệu "Ba kích" được lấy từ một số loài khác như: cây Ba kích lông (Morinda cochinchinesis (Lour.) DC.), Rubiaceae; cây Mặt quỷ (Morinda villosa Wall ex Hook.f.), Rubiaceae, Dây giang mủ (Zygostelma benthami Bailon var lineare Cost.), Asclepiadaceae;

Ba kích tại Sa Pa (Polygala sp.), Polygolaceae [31]

1.1.2 Về giá trị sử dụng

1.1.2.1 Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai

Trong Y học cổ truyền Trung Quốc, hầu hết các loài thuộc chi

Acanthopanax Miq., như Acanthopanax gracilistylus, A henryi, A trifoliatus,

A verticillatus đều được dùng làm thuốc Nếu lấy vỏ thân thì vị thuốc có tên

là "Ngũ gia bì"; lấy vỏ rễ có tên là "bản kinh" ; còn lấy lá thì có tên gọi là

“ngũ gia diệp” hay là "ngũ gia hồng" Các vị thuốc này có thể dùng tươi hay

đã làm khô, có tác dụng ích khí, làm mạnh gân cốt và bổ Vì thế, thuốc từ các loài ngũ gia bì gai dùng để chữa đau lưng, thấp khớp, trẻ em chậm biết đi

[92] Vị thuốc "ngũ gia bì" cũng được phối hợp với nhiều vị thuốc khác để làm thuốc bổ, thuốc về bệnh thần kinh [73, 93]

Theo Song, Xiang và cộng sự (1983), trong vỏ rễ của NGBH có chứa một số hợp chất như sesamin, beta-sitosterol, syringin, beta-sitosterol glucosid, eleutherosid B, senticosid và một số acid hữu cơ [67, 82] Trong lá

có các glycosyl ester của nhóm 3 anpha-hydroxyolean [83]

Về tác dụng dược lý, theo Shan và một số người khác (1999) đã nghiên cứu trên tế bào lympho người cho thấy, dịch chiết của NGBH có hoạt tính điều hòa miễn dịch Vì thế, có thể sử dụng NGBH để điều trị một số bệnh có liên quan đến dị ứng và miễn dịch [65]

Đối với loài NGBG, hiện đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của cây thuốc này [37, 58, 91] Trong vỏ thân và vỏ rễ đã xác

định được nhiều acid hữu cơ nhóm hydroxy và hydroxylup; ngoài ra còn có nevadesin và taraxerol Vỏ cành và lá NGBG có chứa tinh dầu, gồm hơn 80 chất đã được xác định, trong đó chủ yếu terpen và các dẫn chất của nó, như anpha-pinen, terpinen-4-ol, beta-pinen, p-cynen [37, 58, 91]

ở Việt Nam, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược

lý của 2 loài trên còn ít Trong một số tài liệu đã công bố như "Selected Medicinal Plants in Vietnam" (1999) [50] và "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam" (2004) [31] - về các phần này chủ yếu được trích dẫn từ tài liệu nước ngoài

Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất tự nhiên trong NGBG của Việt Nam đáng chú ý nhất có công trình của Phan Văn Kiện và cộng sự (2003) Các tác giả đã xác định trong lá NGBG có cá phenylpropanoid glucosid và acid carboxylic lupan [54, 55] Đến năm

2004, vẫn hai tác giả này còn phân lập và xác định được cấu trúc của 23 hợp chất, trong đó có 7 hợp chất mới [18]

Ngoài ra, qua nghiên cứu hoạt tính sinh học, Châu Văn Minh và Phan Văn Kiện (2004) cũng đã chỉ ra hợp chất quercitrin và acid 3α - acetoxy - 30-hydroxylup - 20(29) - en - 23,28 - diodic có tác dụng kháng Monoamine oxidase (MAO) và Cyclooxygenase (COX) khá cao ngay ở cả nồng độ thấp

Đặc biệt, hoạt tính kháng mạnh này đối với cả 3 chủng tế bào ung thư người (tế bào biểu mô, màng tim và tế bào gan) [18] Những kết quả bước đầu này

mở ra triển vọng mới cho việc nghiên cứu để sử dụng NGBG để làm thuốc trong tương lai

Về giá trị sử dụng làm thuốc của NGBH và NGBG tại Việt Nam có thể nói là khá phổ biến Gần như ở bất cứ đâu có 2 cây thuốc này thì ở đó người dân địa phương cũng biết dùng làm thuốc chữa đau nhức xương khớp, bồi bổ sức khỏe, tăng cường sức dẻo dai của cơ thể Những công dụng này đều được

đề cập trong hầu hết các tài liệu về cây thuốc đã xuất bản tại nước ta [5, 13,

14, 16, 31] Bên cạnh đó, theo kinh nghiệm của nhân dân một số địa phương, như Sa Pa (Lào Cai) lá NGBG còn được dùng làm trà uống có tác dụng kích thích ăn ngon, ngủ yên giấc Lá non NGBH có thể làm rau ăn (Sìn Hồ - Lai Châu), hoặc vỏ rễ của NGBH đem nấu với chân giò hoặc thịt gà cho phụ nữ mới sinh ăn mau khỏe và lợi sữa (Phó Bảng - Hà Giang) Ngoài ra, trong những năm 70 của thế kỷ trước, chế phẩm "Rượu bổ Ngũ gia bì" được bào chế

từ vỏ NGBH của tỉnh Cao Bằng và Lạng Sơn đã từng được thị trường ưa chuộng

Tóm lại, NGBG và NGBH là hai cây thuốc quí của Việt Nam, nhưng việc nghiên cứu cơ bản nhìn chung chưa đáp ứng được với yêu cầu đề ra

1.1.2.2 Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang

Sâm ngọc linh (SNL)

Trước khi Sâm ngọc linh được các nhà khoa học biết đến, cộng đồng dân tộc Xê Đăng ở xung quanh núi Ngọc linh (Quảng Nam và Kon tum) đã biết sử dụng cây thuốc này làm thuốc bổ, chữa viêm họng, ho và chống khát

nước khi bị sốt cao Vì thế, ngay sau khi được phát hiện, từ những năm cuối của thập kỷ 70 cho đến nay đã có hàng chục công trình nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như tác dụng dược lý của SNL

Tổng hợp lại hiện đã biết trong thân rễ (củ) và phần trên mặt đất SNL có các nhóm hợp chất chủ yếu như: Saponin, acid amin tự do, acid béo, đường, hợp chất steroid, tinh dầu, vitamin C và nhiều nguyên tố vi lượng khác Riêng nhóm saponin, các tác giả đã phân lập được 39 loại, trong đó có một số chất mới [9, 42, 43, 44, 71, 75, 76]

Về tác dụng dược lý của SNL cũng đã được nghiên cứu khá đầy đủ về

độc tính cấp; về tác dụng tăng lực, cải thiện trí nhớ, giảm stress; tác dụng hạ cholesterol và lipid máu; tác dụng bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa v.v [15, 49, 62, 76]

Với những nghiên cứu cơ bản trên đây, càng khẳng định Sâm ngọc linh

là một cây thuốc có giá trị sử dụng cao

Sâm vũ diệp (SVD) và Tam thất hoang (TTH)

Theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền của vùng Vân Nam (Trung Quốc), SVD và TTH có tác dụng kiện tỳ, hoạt huyết nên được dùng làm thuốc

bổ cho người già, người mới ốm dậy bị thiếu máu Đặc biệt cả 2 loài cây thuốc này đều có tác dụng cầm máu tốt nên được dùng để chữa xuất huyết dạ dày, thổ huyết, chảy máu cam hoặc lao phổi [93] ở Việt Nam, trong cộng đồng dân tộc Dao Đỏ và H'Mông ở Sa Pa - Lào Cai có nhiều người cho rằng cả 2 cây thuốc này đều được dùng làm thuốc bổ cho người già, chống được đau nhức xương khớp Phụ nữ mới sinh cũng có thể dùng SVD hay TTH như vị thuốc Tam thất của Trung Quốc Đồng thời một vài lang y cũng biết sử dụng SVD hay TTH làm thuốc chữa đau dạ dày, nhất là trong trường hợp bị chảy máu [31]

Trong khi đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng dược lý

đối với 2 loài SVD và TTH nhìn chung còn rất ít

Công trình được công bố sớm nhất có lẽ do một nhóm tác giả ở Trung Quốc là Zhou J., Huang W G., Wu M.Z et al (1975) Theo các tác giả này, trong SVD có nhóm saponin (16,71%) nhóm sapogenin (3,51%); còn trong TTH nhóm saponin (16,38%) và sapogenin (5,46%) Trong nhóm sapogenin của cả 2 loài có 3 thành phần triterpen, chủ yếu là acid oleanolic, panaxadiol

và panaxatriol [31] Theo Tanaka (1986), trong thân rễ (củ) và lá của SVD có saponin thuộc nhóm B (không phải nhóm dammaran) và đã xác định được tới

13 chất khác nhau [71, 72, 77]

ở Việt Nam, ngay từ khi chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học, Phạm Duy Mai, Vũ Thị Tâm và cộng sự (1974) đã có một công bố đầu tiên về tác dụng dược lý của SVD và TTH, thu thập được ở vùng Sa Pa - Lào Cai Kết quả nghiên cứu này đã xác định được sơ bộ về tác dụng gây động dục, gây ngủ, chỉ số tán huyết và độc tính cấp đối với chuột nhắt trắng Hơn nữa, khi sử dụng thử dịch chiết của SVD cho người cho thấy không có tác dụng phụ, ăn ngủ tốt hơn và có người đã tăng cân [17] Đáng tiếc rằng, những nghiên cứu tương tự đã không được tiếp tục, thậm chí còn bị lãng quên một thời gian quá dài

Cho đến vài năm gần đây (2001-2003), nằm trong một đề tài cấp Bộ về Bảo tồn SVD và TTH, Trần Công Luận, Nguyễn Thu Hương và cộng sự mới chính thức tiến hành nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như về tác dụng dược lý của 2 cây thuốc này Trong đó, về thành phần hóa học của SVD và TTH đã xác định có các nhóm hợp chất saponin, sapogenin, polyacetylen, một

số axit béo, nguyên tố vi lượng Về tác dụng dược lý, bước đầu cũng đã xác

định về độc tính cấp, tác dụng tăng lực, giảm stress và tác dụng chống ôxy hóa của TTH Những kết quả này đã được lựa chọn công bố trong một chuyên khảo về Sâm Việt Nam (2007) [7]

Với những nghiên cứu đã có trên đây, đem so với SNL, rõ ràng SVD và TTH mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như về tác dụng dược lý của chúng

1.1.2.3 Ba kích

Ba kích là vị thuốc được sử dụng khá phổ biến trong Y học Cổ truyền tại Trung Quốc, Việt Nam và một số nước khác

Theo quan niệm của Y học cổ truyền Trung Quốc, Ba kích có tác dụng

bổ thận, tráng dương nên được dùng trong các trường hợp cơ thể bị suy nhược, người có triệu chứng liệt dương hoặc bị xuất tinh sớm Ngoài ra, vị thuốc này còn được sử dụng chữa viêm dây thần kinh tọa (ở phụ nữ), chứng đi tiểu nhiều hoặc kinh nguyệt không đều [74, 93]

ở Việt Nam, qua một số tài liệu đã được công bố cũng đều ghi nhận Ba kích có tác dụng bổ dưỡng và được dùng làm thuốc tăng cường khả năng sinh dục đối với những nam giới bị yếu về sinh lý hoặc bị suy kiệt Ba kích phối hợp với các vị thuốc khác để chữa đau nhức xương khớp, giảm sơ cứng động mạch và bổ thần kinh [5, 16, 31]

Là một vị thuốc có giá trị sử dụng cao như vậy, nên Ba kích cũng đã

được nghiên cứu khá đầy đủ về thành phần hóa học cũng như về tác dụng dược lý

Theo một số công trình đã được công bố thì trong rễ cây Ba kích có chứa một số chất như anthraglucosid, iridoid, glucosid, sterol, lacton, đường

và một số khoáng chất vô cơ Trong đó nhóm anthraglucosid được chú ý nhiều nhất Theo Yoshikawa M., Yamguchi S., et al (1995) ngay từ năm 1992 Yang Y.J đã chiết tách được 8 loại anthraquinon thuộc nhóm anthraglucosid [84] Ngoài ra, một số chất thuộc nhóm này cũng đã được xác định như: tectoquinon, alizadin - 1- metyl ete, lucidin - w - metyl ete, 1 - hydroxy - 2,3 - dimetyl - anthraquinon c [84] Thuộc nhóm hoạt chất iridoid glucosid hiện đã biết có monotropein, asperulosid, morindolid, morofficinalosid, acid deacetyl asperulosidic, acetat asperulosid Cũng theo Yoshikawa M., et al thì hợp chất monotropein có vai trò quan trọng trong tác dụng giảm đau và chống viêm [84]

Về tác dụng dược lý của Ba kích cũng đã được nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu, như Zhang Z.Q., Yuan L., Yang M., et al (2002) [85]; Soon

Y Y., Tan B K (2002) [68]; Choi J., et al (2005) [40] và Kim J.T., et al (2005) [57] v.v Theo các tác giả này thì rễ Ba kích có tác dụng tăng lực rõ nét; tác dụng giảm đau, chống viêm, chống stress lâm sàng trên chuột cái; [40, 57, 68, 85] Ngoài ra, Soon Y Y., Tan B K (2002) còn chứng minh dịch chiết rễ Ba kích có tác dụng chống oxy hóa và làm giảm hàm lượng đường trong huyết thanh của chuột thí nghiệm bị gây đái tháo đường [68]

ở Việt Nam, trong các tài liệu về cây thuốc xuất bản gần đây đều khẳng

định trong rễ Ba kích có chứa các hợp chất tự nhiên như: anthraglucosid, iridoid glucosid, các hợp chất sterol, lacton, đường, nhựa, acid hữu cơ, tinh dầu, một số chất khoáng vô cơ Trong rễ tươi còn thấy cả Vitamin C [6, 16, 31]

Nghiên cứu về tác dụng dược lý cũng cho thấy, nước sắc từ Ba kích đem thử trên chuột nhắt trắng và chuột cống có tác dụng tăng lực, chống độc, chống viêm, làm tăng cường co bóp ruột và hạ đường huyết Ngoài ra, với chỉ

số LD50 = 193g/kg chứng tỏ Ba kích có độc tính thấp [31]

Như vậy, với những trích dẫn khái quát trên đây có thể nhận định rằng cả 6 loài cây thuốc: NGBG, NGBH, SNL SVD, TTH và Ba kích là những cây thuốc đã được sử dụng khá lâu đời theo kinh nghiệm của Y học cổ truyền Qua nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý còn cho thấy giá trị sử dụng hiện tại và tiềm năng của những cây thuốc này là khá phong phú

1.1.3 Vài nét về vấn đề bảo tồn

Hiện tại chưa có nhiều thông tin về vấn đề bảo tồn 6 loài cây thuốc kể

trên Tuy nhiên, ngay từ trước năm 2000 loài SVD (P bipinnatifidus Seem.)

đã được IUCN đưa vào Danh lục Đỏ của thế giới [22] Trong một vài nghiên

cứu về tính đa dạng nguồn gen các loài thuộc chi Panax L mọc hoang dại ở

Trung Quốc, Cheng - Li Duan, Xing - Long Yan, Guo - Song Wen, et al

(2006), Shi - Liang Zhou, Gao - Ming Xiong, Zhong - Yi Li và Jun Wen (2005) và Jun Wen (1999, 2000) đều chỉ ra rằng SVD cũng như TTH là những loài cần được bảo tồn ở các quốc gia [66, 80, 81] Còn đối với NGBH

(Acanthopanax gracilistylus W W Smith) và Ba kích (Morinda officinalis

How) đang được sử dụng làm thuốc ở Trung Quốc là do trồng trọt và dường như không được khai thác cây mọc tự nhiên

ở Việt Nam, trong tất cả các tài liệu đã công bố [3, 5, 12, 13, 14, 16, 31], NGBG, NGBH, SVD, TTH, SNL và Ba kích đều thừa nhận đây là những cây thuốc quí về giá trị sử dụng và có giá trị kinh tế cao Trải qua nhiều năm tìm kiếm khai thác khốc liệt, cả 6 loài cây thuốc này được xếp vào diện đã bị suy giảm nghiêm trọng (NGBG và Ba kích) hoặc có nguy cơ bị tuyệt chủng cao (SVD, SNL, TTH, NGBH) Tất cả chúng là những đối tượng cần phải bảo tồn khẩn cấp và cần được đưa vào trồng thêm ở Việt Nam

Trong Sách Đỏ Việt Nam (1996) có 5 loài trong số 6 loài trên được xếp hạng như: NGBH: R (Hiếm - dễ bị rủi ro); NGBG: T (Bị đe dọa); SVD: E (Đang bị nguy cấp; SNL: E; Ba kích: K (Bị đe dọa nhưng chưa đủ dẫn liệu cụ thể) - Xếp theo khung phân hạng IUCN (1970) [2]

Trong Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam, cả 6 loài trên đều được ghi nhận trong cả 3 lần công bố (1996, 2001 - 2006) [22, 23, 27]

Cụ thể trong Danh lục Đỏ cây thuốc Việt Nam (2006), chúng được xếp hạng cụ thể như: NGBH: CR.B2a,b (ii,iii,v); NGBG: VU.A1c,d; B2a,b(ii,iii,v); SVD, SNL và TTH đều ở mức CR.A1c,d và Ba kích: EN.A1a,c,d Trong đó CR: Đang cực kỳ bị nguy cấp; EN: Đang bị nguy cấp và VU: Sắp bị nguy cấp Các tiêu chí A, B là tình trạng quần thể và phân bố [27]

Ngoài ra, trong Nghị định số 32/2006/NĐ-CP của Thủ tướng Chính phủ (30/3/2006) về việc Quản lý Thực vật rừng, Động vật rừng nguy cấp, quí, hiếm cũng đưa SVD, SNL và TTH vào Danh sách II.A để tăng cường quản lý chặt chẽ [29]

Mặc dù hiện nay chưa có đủ thông tin về vấn đề bảo tồn NGBG, NGBH, SVD, SNL, TTH và Ba kích trên thế giới, song ở Việt Nam chúng đều là những đối tượng cần ưu tiên nghiên cứu để bảo tồn

1.2 tổng quan về các loại chỉ thị và dấu chuẩn trong nghiên cứu thảo dược trên thế giới và ở việt Nam

Ngày nay, trên thế giới, các nhóm thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc ngày càng được quan tâm phát triển, nhờ vào tính an toàn cũng như lợi thế về chi phí sản xuất của chúng Thị trường thế giới về thuốc có nguồn gốc thảo mộc, bao gồm cả dược liệu thô, ước tính đạt trung bình 62 tỷ đô la Mỹ một năm Ước tính đến năm 2050, doanh thu của thị trường này có thể đạt đến 5 nghìn tỷ đô la Mỹ (Kalpana, 2004) [52] Trong hoàn cảnh đó, việc chứng minh cơ sở khoa học và tiêu chuẩn hoá công nghệ bào chế thuốc từ thảo dược

có vai trò hết sức quan trọng Các sản phẩm từ thảo dược thường kém ổn định

về thành phần và dược tính, trái ngược với các sản phẩm tân dược được tổng hợp nhân tạo từ hoá chất tinh khiết và các quy trình công nghệ ổn định Chính vì vậy, công tác kiểm định và đảm bảo chất lượng nguồn nguyên liệu ban đầu

là yêu cầu thiết yếu để tạo được các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược với chất lượng ổn định và an toàn

Việc nhầm lẫn các loài thảo dược với nhau trong quá trình thu hái, chế biến và sử dụng là hiện tượng hay gặp, do trong tự nhiên có thể tồn tại nhiều loài có hình thái tương tự khó phân biệt Thêm nữa, trong nhiều nền y học cổ truyền khác nhau, một cây dược liệu có thể được gọi bằng nhiều tên khác nhau hoặc các cây dược liệu khác nhau lại có tên trùng nhau Vì vậy, yêu cầu trước tiên đối với ngành công nghiệp chế biến thuốc từ thảo dược là phải xác

định chính xác nguồn nguyên liệu ban đầu

Có nhiều phương pháp để định loại các cây dược liệu, như sử dụng chỉ thị cảm quan (hình thái, màu sắc, mùi, vị ) và chỉ thị hoá học Trong đó, chỉ thị hóa học thường được sử dụng là các kỹ thuật sắc ký (sắc ký lớp mỏng -

áp - HPLC ) và các phương pháp khối phổ Cả phương pháp sử dụng chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa học đều có những ưu điểm nổi bật nhất định Song đối với các dược liệu và cây thuốc là các loài cùng chi (genus) hoặc cùng loài nhưng khác thứ (var.) thì hai phương pháp trên sẽ khó phân biệt được chính xác [36]

Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cung cấp thêm một công cụ mới cho công tác định loại thảo dược là các chỉ thị ADN Những chỉ thị ADN thường được dùng có thể kể đến là RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism), RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA), RFLP-PCR, AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeat) Các chỉ thị ADN có nhiều lợi thế đáng kể so với các chỉ thị cảm quan hoặc hoá học vì nó hầu như không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường, ngoại cảnh, tuổi cây hay tình trạng sinh lý khi thu hái Đồng thời, sử dụng các chỉ thị ADN còn có thể đánh giá được mức độ đa dạng di truyền trong các loài cây thuốc.Như vậy, sử dụng các chỉ thị ADN trước hết sẽ giúp cho việc phân tích chính xác các loài cây thuốc hay giữa các loại dược liệu gây nhầm lẫn Hơn nữa, với việc đánh giá được về mức độ đa dạng di truyền trong các loài còn là cơ sở để chọn tạo giống cây thuốc có năng suất cao, cũng như trong việc bảo tồn chính xác được nguồn gen quí

PCR, được Welsh và McClelland đưa ra, 1990) [78] sử dụng các mồi có trình

tự ngẫu nhiên dài 15 nucleotid với điều kiện khuếch đại khác với RAPD-PCR, hay DAF (DNA Amplification Fingerprinting, Caetano-Annoles, 1991) sử dụng các mồi ngẫu nhiên ngắn hơn 10 nucleotid và cho phổ điện di tương đối phức tạp [35]

Với nhiệt độ gắn mồi phù hợp, các mồi oligonucleotid trình tự ngẫu nhiên sẽ gắn vào một vài vị trí có trình tự bổ sung trên sợi khuôn ADN và cho sản phẩm khuếch đại nếu các vị trí gắn mồi nằm trong phạm vi có thể khuếch

đại được Sự khác biệt về trình tự nucleotid của các khuôn ADN khác nhau

được thể hiện ở sự có mặt hay vắng mặt của các băng khuếch đại

So với hầu hết các chỉ thị ADN khác, chỉ thị RAPD-PCR có những ưu

điểm nổi bật như nhanh chóng, rẻ tiền và dễ thực hiện Mặc dù vậy, chỉ thị RAPD-PCR cũng có những nhược điểm khó tránh khỏi là tính ổn định không cao, phụ thuộc nhiều vào điều kiện thí nghiệm, đặc biệt là nồng độ ADN khuôn và nhiệt độ gắn mồi trong một phản ứng (Aitchitt M., 1998, C.J Jones,

1997, Liu, 2004) [32, 51] Đồng thời, phổ điện di thu được khi sử dụng phản ứng RAPD-PCR thường có rất nhiều băng, đôi khi gây khó khăn cho việc xác

định chính xác Bên cạnh đó, chỉ thị RAPD-PCR cũng có thể cho các kết quả

đa hình giả do cạnh tranh giữa các trình tự khuôn (Halldén, 1996) hoặc do cấu trúc kết cặp không tương đồng hoàn toàn (heteroduplex) như cấu trúc được hình thành giữa các trình tự alen trong hệ gen (Ayliffe, 1994) [46, 59]

Việc ứng dụng chỉ thị RAPD-PCR trong nghiên cứu thảo dược đã được tiến hành bởi một số phòng thí nghiệm trên thế giới và thu được những thành công nhất định Chẳng hạn, vào những năm 40 và 70 của thế kỷ trước, khi căn

cứ vào các đặc điểm hình thái, một số nhà thực vật học Nhật Bản (Hara, H., 1970) và Trung Quốc (Li, H.L., 1942; Hoo, G & Tseng, C., J., 1978) đã đưa ra

quan điểm đồng nhất một số loài Panax mọc tự nhiên ở Trung Quốc (đã được

xác định trước đó) xuống ở bậc dưới loài Đến năm 1999 - 2000, Jun Wen và

một số người khác dựa trên cơ sở phân tích chỉ thị ADN đã khẳng định các

bậc dưới loài thuộc chi Panax ở Trung Quốc kể trên, hoàn toàn có đủ cơ sở để

xếp chúng ở bậc phân loại loài, như trước kia đã có [80, 81]

Mặc dù vậy, từ năm 1985 trở lại đây, việc áp dụng kỹ thuật RAPD-PCR

đã trở thành phương pháp khá phổ biến, mang lại nhiều thành công trong nghiên cứu cây thuốc

Nghiên cứu tính đa hình di truyền và đặc trưng cá thể có lên quan tới khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của cây thuốc, tiêu biểu có các công trình của: Baun, của Feng - hui Xiao, Gou - song Wen, et al (2006) đã xác định tính đa hình di truyền có liên quan tới hàm lượng ginsenoid của các

giống Tam thất (Panax notoginseng) trồng RAPD- PCR, Gavidia, et al (1996)

và Steck, et al (2001) đã đánh giá được về mức độ đa hình của các loài cây

thuốc Digitalis obscura, Hypericum perforatum để phục vụ cho công tác chọn

tạo giống [34, 45, 69] Năm 2004 còn kết hợp giữa 2 chỉ thị RAPD với

allozym để đánh giá mức độ đa dạng di truyền của hai loài Nhân sâm (Panax ginseng) và Tây dương sâm (P quinquefolius) [33]

Gần đây, Cheng - li Duan, Xing - long Yan, Gou - song Wen, et al

(2006) qua nghiên cứu 5 taxon Panax mọc tự nhiên ở Trung Quốc (P stipuleanatus, P japonicus, P bipinnatifidus, P bipinnatifidus var angustifolius và P japonicus var major) cho thấy chúng có mức độ đa dạng

di truyền cao hơn hẳn so với các loài Panax trồng trọt Với kết quả này, các

tác giả đã đưa ra kiến nghị phải bảo tồn khẩn cấp quần thể hoang dại của các

loài Panax kể trên [38]

Ngoài ra, áp dụng chỉ thị RAPD-PCR, Ke-jun Deng, Zu - jun Yang, Cheng Liu, et al (2006) còn chỉ ra có một chuỗi nucleotid đặc trưng có thể sử

dụng để phân biệt các loài thuộc chi Rhodiola (Rh crenulata, Rh fastigiata,

Rh sachelinensis ) họ Crassulaceae phân bố ở vùng Sichuan và Jilin-Trung

Quốc [53] Về lĩnh vực này đáng chú ý hơn cả là một số công trình của Jun

Wen và cộng sự (1996, 1999, 2000), ứng dụng chỉ thị phân tử ADN, tác giả đã góp phần quan trọng trong việc phục hồi một số bậc taxon dưới loài (var.) của

chi Panax L ở Trung Quốc trở lại với bậc phân loại loài hoàn chỉnh [79, 80,

81] Hoặc áp dụng kỹ thuật RAPD-PCR trong nghiên cứu chỉ thị ADN, Park

Sy, et al (2004) còn đánh giá được về mối quan hệ di truyền giữa một số loài

trong chi Acanthopanax [63]

1.2.2 ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu chỉ thị

phân tử ADN ở Việt Nam

Khoảng hơn chục năm trở lại đây, với những thành tựu của công nghệ sinh học và Di truyền học phân tử, việc sử dụng các kỹ thuật gen bước đầu đã

có những thành công đáng kể trong nghiên cứu - xác định tính đa dạng di truyền; xác định loài và chọn tạo giống cây Trong đó, riêng về kỹ thuật RAPD - PCR có thể nêu ra một số công trình nghiên cứu như:

Trương Quốc Phong và Nguyễn Văn Mùi (2004) đã sử dụng chỉ thị

phân tử ADN để góp phần phân loại 2 loài Trà hoa vàng (Camellia cucphuongensis và C flava) [20] Hoặc để phân biệt giữa các loài Trà hoa

trắng ở Vườn quốc gia Tam Đảo (Nguyễn Văn Mùi và Bùi Thị Mai Hương (2004)) [19] Trong khi đó, Nguyễn Minh Vĩ và Nguyễn Văn Mùi (2004) cũng sử dụng kỹ thuật RAPD - PCR để đánh giá về sự đa dạng di truyền của một số loài cây rừng giữa 2 điểm phân bố khác nhau ở Trường Sơn [30] Hoặc trong các nghiên cứu của Hoàng Thị Hòa, Đinh Đoàn Long, et al (2005), bằng chỉ thị ADN, các tác giả này đã chỉ ra tính đa hình và đồng hình cao

trong loài Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus) và phân biệt rõ nét giữa loài P amarus với P urinaria thu thập ở Bắc Việt Nam [11, 59] Hoặc gần đây, Lê

Công Kiệt và Kebler (2005) cũng với chỉ thị ADN, các tác giả này đã khẳng

định về một loài Trầm hương mới, phát hiện ở Kon Tum là Aquilaria rugosa

L.C.Kiet et Kebler [56]

Với những nghiên cứu bước đầu kể trên cho thấy, việc ứng dụng các kỹ thuật chỉ thị ADN đã góp phần quan trọng trong việc phân định chi, loài một cách chính xác hơn, cùng với các dạng đa hình trong loài của chúng Bên cạnh

đó, sử dụng phương pháp RAPD-PCR, chúng tôi hi vọng bước đầu có thể xác

định được một số tập hợp chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt nhanh các loài

cây thuốc thuộc chi Acanthopanax Miq., Panax L và Morinda L kể trên,

cung cấp một công cụ bổ sung cho công tác kiểm định dược liệu ở Viêt Nam trong tương lai

Tuy nhiên, đáng tiếc rằng về cây thuốc hầu như chưa có nhiều nghiên cứu nào về lĩnh vực này Mặc dù trong nguồn tài nguyên cây thuốc ở Việt Nam hiện còn nhiều vấn đề về tên khoa học loài, cũng như về tính đa dạng trong loài của nhiều cây thuốc thuộc diện quí hiếm cần quan tâm Đó

cũng chính là lý do chúng tôi thực hiện đề tài này

Chương 2 Đối tượng, nội dung và phương pháp

nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm thu mẫu

Đối tượng nghiên cứu là 6 loài cây thuốc cùng với các dạng hình thái của chúng, được thu thập tại các địa điểm sau:

2.1.1 Ngũ gia bì hương - Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith

- Thị trấn Phó Bảng, huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang

- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

2.1.2 Ngũ gia bì gai - Acanthopanax trifoliatus (L.) Voss

- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

- Huyện Thạch An, tỉnh Cao Bằng

- Huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn

2.1.3 Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem (gồm cả loại lá xẻ

nông)

- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

2.1.4 Tam thất hoang - Panax stipuleanatus H.T.Tsai & K.M.Feng

- Xã Bản Khoang; thị trấn Sa Pa, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

2.1.5 Sâm ngọc linh (Sâm Việt Nam) - Panax vietnamensis Ha et

Grushv

- Xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam

- Xã Ngọc Lây, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum

- Xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai

2.1.6 Ba kích - Morinda officinalis How (gồm các dạng hình thái)

- Xã Chân Mộng, huyện Đoan Hùng, tỉnh Phú Thọ

- Lâm trường Tân Lạc, huyện Tân Lạc, tỉnh Hòa Bình

- Huyện Hoành Bồ, tỉnh Quảng Ninh

- Thôn Hòa Bình II, xã Quân Chu, huyện Đại Từ, tỉnh Thái Nguyên

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Điều tra thu thập mẫu

Căn cứ vào các điểm phân bố đã biết, tiến hành các đợt điều tra khảo sát, thu thập mẫu của 6 loài Mẫu nghiên cứu gồm 3 loại:

- Tiêu bản thực vật cây thuốc có đủ hoa hoặc quả, để phân tích xác định tên khoa học và mô tả Mỗi loại dự kiến thu ít nhất 3 tiêu bản, với các dạng hình thái khác nhau

- Mẫu nguyên liệu nghiên cứu ADN là cành lá tươi (NGBH và NGBG) hay cả cây có cả củ và rễ (SNL, SVD, TTH và Ba kích) Loại mẫu này thu ở nhiều cá thể khác nhau (cả các dạng hình thái khác nhau), tại các điểm phân

bố khác nhau

- Mẫu nguyên liệu làm dược liệu chuẩn lưu trữ: Là các bộ phận dùng chủ yếu của 6 loài cây thuốc Gồm: Lá, vỏ thân - cành, vỏ rễ (NGBH và NGBG); thân rễ (củ) và rễ (SNL, SVD, TTH và Ba kích) Mẫu dược liệu thường được lấy trên các cá thể đã lấy tiêu bản và mẫu nghiên cứu ADN

2.2.2 Xác định tên khoa học và mô tả đặc điểm hình thái của các

loài

- Đối chiếu với các khoá phân loại loài, thuộc các chi Panax, Acanthopanax, Morinda L trong các bộ Thực vật chí hiện có để khẳng định

về tên loài, dưới loài (nếu có) của 6 đối tượng nghiên cứu trên

- Mô tả đặc điểm hình thái của các loài

2.2.3 Phân tích chỉ thị phân tử ADN (RAPD-PCR) trong nghiên cứu

* Tiến hành tách chiết, tinh sạch ADN và xây dựng qui trình tách chiết ADN của các đối tượng nghiên cứu

* Phân tích sự đa dạng di truyền của các loài

* Bước đầu xác định một số chỉ thị đặc trưng phân biệt các loài và dưới

loài

2.2.4 Đánh giá về sự kết hợp giữa việc sử dụng chỉ thị ADN với các

dấu chuẩn hình thái trong nghiên cứu phân loại phục vụ công tác bảo tồn và phát triển các loài cây thuốc

- Trước khi thu mẫu (các loại) đều xác định toạ độ địa lý (bằng GPS) nơi

có cây thuốc nghiên cứu Ghi chép các thông tin về môi trường cây mọc, đo

đếm số cá thể hiện có và ghi nhận xét về hiện trạng của từng cây thuốc

- Tiến hành thu mẫu bao gồm: Mẫu tiêu bản thực vật, mẫu nguyên liệu nghiên cứu ADN và mẫu dược liệu (bộ phận dùng) Các mẫu này đều có nhãn ghi đầy đủ lý lịch mẫu

2.3.2 Xác định tên khoa học bằng phương pháp so sánh hình thái, sử dụng

khóa phân loại các loài thuộc chi Acanthopanx Miq và Panax L., Morinda

Vật liệu để tách chiết ADNts là thân, rễ và lá của các mẫu đã được nghiền mịn Sau đó tiến hành tách chiết riêng rẽ các phần của mẫu thực vật và

so sánh hàm lượng ADN thu được bằng phương pháp điện di trên gel agarose 0,8% để xác định bộ phận cho hiệu suất thu ADN cao nhất, sử dụng cho các thí nghiệm tách chiết tiếp theo

2.3.3.2 Kiểm tra chất lượng ADN tổng số (ADNts) bằng phương pháp

điện di và quang phổ

Sản phẩm ADNts thu được sau đó được phân tích bằng cách chạy điện

di trên gel agarose 0,8% (0,8 g agarose + 100 ml TBE 1x) ở 60-80 V trong 30 phút Nồng độ và kích thước tương đối của sản phẩm ADNts được xác định bằng cách so sánh với marker Lambda / HindIII

Sau đó, sản phẩm ADNts được pha loãng 100 lần (10 àl ADNts + 990

àl ddH2O) cho thí nghiệm đo mật độ quang phổ (OD) bằng máy đo quang phổ Ultrospec 1100 Pro ở các bước sóng 260 và 280 nm Mức tinh sạch của sản phẩm (mức độ lẫn ARN và protein) được xác định bằng tỷ số quang phổ hấp thụ A260/A280 Nồng độ ADN của dung dịch gốc được tính theo công thức 1,0

được so sánh với marker 1kb (Fermentas, 1kb DNA Ladder)

2.3.4 Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h

Sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.02h (Numerical Taxonomy System Applied Biotstatistics, Setauket, New York), các kết quả điện di sản phẩm