- Kớ hiệu, trỡnh tự và nguồn gốc cỏc cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
4 Nũi 1 HAU0202-6 Khang dõn Văn Giang – Hưng Yờn
2.3.3 Phương phỏp sử dụng chỉ thị phõn tử xỏc định gen khỏng bệnh bạc lỏ và gen tương hợp rộng.
lỏ và gen tương hợp rộng.
* Phương phỏp tỏch chiết ADN:
ADN tổng số được tỏch chiết theo phương phỏp "NaOH extraction" của Wang (1992). Quy trỡnh tỏch chiết ADN bao gồm cỏc bước:
29
- Mẫu lỏ non được cắt nhỏ vào ống eppendorf 2ml. Thờm 200àl NaOH 0.25N. Nghiền mịn mẫu lỏ bằng mỏy nghiền RETSCH Mixer Mill MM 200.
- Thờm 800àl dung dịch Tris 100mM pH7.5, trộn đều. - Ly tõm 12.000vũng/phỳt trong 20 phỳt.
Chuyển 200àl dung dịch vào ống eppendorf 1.5ml. Lưu giữở -200C để
làm dung dịch ADN gốc. Pha loóng dung dịch gốc 10 lần, sử dụng 5àl dung dịch ADN pha loóng cho mỗi phản ứng PCR
* Kỹ thuật PCR:
Phản ứng PCR được tiến hành trờn mỏy Veriti 96well Thermal cycler. Tổng dung dịch phản ứng là 15 àl bao gồm 5àl ADN, 0.15àM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR, 2.5mM MgCl2 và 0.25 đơn vị Taq TaKaRa.
Điều kiện phản ứng PCR như sau: 950C - 7 phỳt; 35 chu kỳ của: 940C - 15 giõy, 550C - 30 giõy, 720C - 1 phỳt; 720C - 5 phỳt; giữ mẫu ở 40C. Sản phẩm PCR được phõn giải trờn gel agarose 3%.
*Phương phỏp điện di trờn gel agarose
Theo phương phỏp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học Tổng hợp Texas, Mỹ (2002) cú cải tiến.
Chuẩn bị gel agarose:
- Bột Agarose được hũa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ
3,0%.
- Đun sụi dung dịch agarose bằng lũ vi súng. - Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.
- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5àg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lược.
- Rút hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel
đụng là 45 - 60 phỳt. - Tra sản phẩm PCR.
30
- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.
- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào mỏy soi UV và chụp ảnh.
* Phương phỏp điện di trờn gel polyacrylamide
Theo phương phỏp của Khoa Genome thực vật, Trường Đại học tổng hợp Texas, Mỹ (2004) cú cải tiến.
Chuẩn bị gel polyacrylamide
1. Lau kớnh 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng ethanol 95% với giấy mềm 2. Chuẩn bị dung dịch đổ gel
3. Lắp rỏp kớnh và cài phần răng lược vào tấm kớnh đểđổ gel. 4. Để gel đụng tự nhiờn ớt nhất 2 giờ.
Bảng 2.5: Thành phần húa chất của gel Polyacrylamide
Nồng độ gel Thành phần 6% 8% 10% 12% H2O 55.5ml 51.75ml 48ml 44.25ml 10XTBE 7.5ml 7.5ml 7.5ml 7.5ml 40% BisAcrylamide 11.25ml 15ml 18.75ml 22.5ml 10% APS 750 àl 750 àl 750 àl 750 àl TEMED 75àl 75àl 75àl 75àl Tổng cộng 75ml 75ml 75ml 75ml
- Điện di sản phẩm PCR trờn gel polyacrylamide
1. Rỳt lược ra khỏi gel. Lau sạch gel dớnh phớa trờn khuụn gel bằng nước cất. 2. Dựng gel lờn giỏ chạy. Đổ 1 lớt TBE 1X (10,8g Tris base: 0,92g EDTA: 5,52g Boric acid trong 1 lit dung dịch) vào phớa trờn và dưới của bểđiện di. 3. Chuẩn bị mẫu: Thờm Dye 3X với tỷ lệ thể tớch là 5àlDye/15àl mẫu.
4. Dựng xylanh đuổi hết bọt khớ ở bề mặt phớa trờn của khuụn gel. Tra 15àl của từng mẫu vào giếng.
31
5. Chạy gel trong thời gian 4- 6,5h tựy thuộc vào loại gel ởđiều kiện 20W
- Nhuộm gel
- Gỡ hai tấm kớnh, nhẹ nhàng búc gel. Sau đú thả gel vào bể nhuộm Ethidium bromide cú nồng độ 10mg/ml trong 20 phỳt.
- Đặt bản gel trong mỏy soi UV, chụp ảnh. - Tỏch chiết và tinh sạch ADN.
- Nhõn nhanh số lượng ADN bằng kỹ thuật PCR - Kiểm tra phản ứng trờn gel agarose.
- Điện di sản phẩm PCR biến tớnh trờn gel polyacrylamide. - Nhuộm bản gel thu được bằng dung dịch AgNO3.