Tài liệu Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng bố, mẹ phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai 2 dòng kháng bệnh bạc lá pot

NG DNG CH TH PHN T DNA CHN LC GEN KHNG BNH BC L CC DềNG B, M PHC V CễNG TC CHN TO GING LA LAI 2 DềNG KHNG BNH BC L Phan Hu Tụn 1 , Tng Vn Hi 1 , guyn Vn Giang 1 , H Hu h 2 , guyn Trớ Hon 2 SUMMARY Application of DA marker for screening resistance gen to bacterial leaf bligh in parents lines of hybrid rice Bacterial leaf blight disease caused by Xanthomonas oryzea pv. oryzea is one of the most serious diseases in rice -cultivating areas of Vietnam. To prevent this disease, the use of resistant varieties offers the most economic efficiency. In order to breed resistant two line hybrid rice varieties, the parental lines containing resistance genes plays a very important role. In this study, DA markers were used for screening resistance gene to bacterial leaf blight in parent rice lines. pb 181, RG556, P3 and pT818 marker were used to select Xa4, Xa5 Xa7 and Xa21 respective. The results shown that, the resisitance genes homozygote types were selected in 11 mother and 14 father populations. Three strains of bacterial leaf blight were used innoculation on the individuals that contain resistance genes homozygotes were resistant. Keywords: DA marker, resistance gene, Bacterial leaf blight, Hybrid rice. I. ĐặT VấN Đề Mt trong nhng hng tng nng sut lỳa go l s dng u th lai. Hin nay chỳng ta ang s dng hai h thng: H thng lỳa lai hai dũng v lỳa lai ba dũng, trong ú lỳa lai hai dũng vt tri v chim u th hn hn. Theo số liệu thng kờ hng nm nng sut lỳa ton th gii c tớnh gim t 10- 20% vỡ cỏc bnh vi khuNn, trong ú cú ti 50% l do bnh bc lỏ gõy nờn. min Bc Vit N am bnh tr nờn nghiờm trng v phỏ hoi nng c hai v, c bit đối với cỏc ging nhp ni t Trung Quc. Hng chn to ging khỏng bnh c coi l cú hiu qu nhiu mt, va gim chi phớ, bo v mụi trng li to ra sn phNm sch. i vi lỳa lai 2 dũng, chn to ra t hp cú kh nng khỏng bnh bc lỏ ch cn mt trong hai b m phi cha gen khỏng nu ú l gen tri, hoc c b m u cha gen nu ú l gen ln. Cỏc tác gi cng ó xỏc nh c gen Xa4, Xa5, Xa7 v Xa21 khỏng c hu ht cỏc chng bnh bc lỏ ở min Bc Vit N am (Bùi Trọng Thuỷ và cs, 2007). a gen khỏng hu hiu vo mt ging, phng phỏp truyn thng l lai 1 Trng i hc N ụng nghip H N i; 2 Vin Khoa hc N ụng nghip Vit N am Backcross, chn cõy cú gen khỏng lai li vi ging lỳa tt hoc trng F2 sau ú chn cỏ th cha gen. N gy nay vi s phỏt trin ca cụng ngh sinh hc, k thut di truyn phõn t ngi ta ó nh v c chớnh xỏc cỏc gen và chỉ thị liờn kt vi chúng. õy cỏc tỏc gi ó xỏc nh gen Xa4 liờn kt vi RFLP locus XN pb181 v XN pb78 trờn N ST s 11, vi khong cỏch liờn kt u l 1,7 cM (Yoshimura et al., 1992); Gen Xa5 liờn kt vi ch th RZ390, RG556 v RG207 trờn N ST s 5, vi khong cỏch liờn kt 0-1 cM (Mc Couch et al., 1991); Gen Xa7 nm trờn N ST s 6 liờn kt vi ch th Mp3 vi khong cỏch di truyn 2,5 cM; Gen Xa21 liờn kt vi ch th pTA818 v pTA248 vi khong cỏch di truyn 0-1cM (Ronal et al., 1992) N h vy ch cn dựng k thut PCR chỳng ta cú th phỏt hin c s hin din ca cỏc gen khỏng bệnh bạc lá trong cỏc th h phõn ly nhất là cỏc dũng cú cha gen khỏng dng ng hp tử phục vụ tốt hơn cho công tác chọn giống lúa lai II. VậT LIệU V PHƯƠN G PHáP N GHIÊN CứU 1. Vt liu nghiờn cu - 11 dũng m TGMS ó c chn ra t cỏc t hp lai gia cỏc dũng TGMS vi ging cha gen khỏng bnh hu hiu: V102; V115; V121; V122; V123; V125; V128; V130; V133; V138; V140. - 14 dũng b ln lt chn t 14 t hp: BB5/R23; BB4/RTQ5; BB11/RTQ5; Cht Ct/RTQ5; Cht ct/R838; BB11/R23; BB21/c thanh; Chựm bụng/c thanh; BB8/4492; BB5/Q99 BB13/Qu. Ch th N pb181 phỏt hin gen Xa4 (Yoshimura et al., 1992) vi primer F5- ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG- 3vR5-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA- TTC-GGG-3,ch th RG556 chn lc gen khỏng Xa5 (McCough et al., 1991) vớ trỡnh t mi R5-AAT-ATT-TCA-GTG- TGC-ATC-TC-3 v F5-TAG-CTG-CTG- CCG-TGC-TGT-GC-3,ch th P3 chn lc gen khỏng Xa7 (Taura et al.,) vi mi R5-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT- ATC-GGA-3 v F5-CAG-CAA-TTC- ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3và ch th pTA818 chn lc gen khỏng Xa21 (Ronald et al., 1992) vi trỡnh t mi F5 ATA GCA ACT GAT TGC TTT GC 3 v R5 CGA TCG GTA TAA CAG CAA AAC 3. 2. Phng phỏp nghiờn cu Quy trỡnh chit tỏch DNA theo N. Furuya v cng s, 2003: Mu lỏ của dòng bố,mẹ đợc lấy ngẫu nhiên 10 cá thể c ct v nghin nh trong 800l dung dch chit tỏch DNA (tớnh cho 10ml hn hp dung dch: 50mM Tris-HCl pH = 8.0; 0.25mM EDTA pH = 8.0; 300mM NaCl; 1% SDS cũn li l H 2 O), thờm 400l dung dch 25:24:1 (Phenol: Chlorofom: Isoaminalchohol) ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 5 phỳt hỳt phn dch phớa trờn. Thờm vo ng nghim 400l dung dch 24:1 (Chlorofom:Isoaminalchohol) v ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, thu dch phớa trờn. Kt ta DNA tng s bng 800l ethanol hoc isopropanol, sau ú ly tõm 5 phỳt vi tc 13000 vũng/phỳt, phn dung dch phớa trờn, gi li phn kt ta di ỏy ng nghim. i cn bay hi, ho tan kt ta bng 50l dung dch TE ri bo qun nhit -20 0 C hoc 4 0 C. Phản ứng PCR phát hiện gen kháng bạc lá Xa4, Xa5 Xa7 và Xa21 Thành phn 20µl dung dch phn ng PCR gm có: 12.24µl nưc ct, 0.1µl Taq DNA Polymerase, 2.0µl 10X buffer, 1.5µl of 50 mM MgCl2, 0.16µl of dNTPs 25 mM, 1µl mi mi, 1µl DNA nguyên bn. PCR ca gen Xa4 và Xa 7 và Xa21 ưc thc hin theo chu kì nhit như sau: 94ºC trong 4 phút, 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút và 72ºC trong 8 phút. PCR ca gen Xa5 ưc thc hin theo chu kì nhit: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút 50 giây và 72ºC trong 7 phút. Sau ó, sn phNm PCR ưc ct bng enzyme DraI như sau: 15µl phn ng gm có 10µl sn phNm PCR, 0,3µl enzyme DraI 10unit/µl, 1,5µ buffer B và 3,2µl nưc. Hn hp ưc   37ºC trong ít nht 6 gi. Sn phNm PCR ưc in di trên gel agarose 1,5%. Bn gel ưc nhum bng Ethidium bromide, chp nh dưi tia UV. III. KÕT QU¶ V TH¶O LUËN 1. Kết quả chọn lọc gen Xa4 Gen kháng Xa4 là gen tri, theo Phan Hu Tôn và cng s (2005) thì gen này kháng ưc 6/10 chng bnh bc lá chính ca min Bc Vit Nam. Chúng tôi ã s dng ch th Npb181 (Yoshimura et al., 1992)  chn lc gen Xa4.  trng thái ng hp t tri in di sn phNm PCR thy xut hin 1 vt băng sáng kích thưc 150bp, trng thái ng hp t ln là 130bp và trng thái d hp xut hin 2 vt băng 130bp, 150bp. Phân tích 11 qun th dòng b ã chn ưc dng ng hp t gen kháng Xa4  3 qun th. Qun th BB4/RTQ5 chn ưc 2 cá th s 4 và 5. Qun th BB4/4492 chn ưc 3 cá th, là các cá th s 2, 3 và 4. Qun th BB4/R242 chn ưc 2 cá th 1 và 2. N hng cá th này mang gen kháng Xa4 không phân ly qua các th na. Tương t như dòng b chn lc gen kháng Xa4  11 qun th dòng m chn ưc 4 qun th cha gen ng hp t ó là qun th V115 cây s 6, qun th V122 cây s 3 và 4, qun th V123 cây s 2, 3 và 5, qun th V138 cây s 2. Hai qun th không chn ưc gen Xa4 ng hp, ch chn ưc dng d hp t (Rr) ó là các qun th V102 và V130. N hng cá th cha gen kháng d hp này ưc trng theo dâi tiÕp ë vô sau. Hình 1. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa4 Lane 1: Marker, lane 2 IR24 (/C âm trng thái ng hp ln), lane 3 BB4 (/C dương trng thái ng hp tri), lane 4, 6 và 7 các cá th cha gen kháng ng hp, lane 5 và 9 cá th cha gen kháng ng hp ln, lane 8 và 10 trng thái d hp t 2. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa5 Gen kháng Xa5 là gen kháng ln vµ kháng ưc 10 chng/10 chng bnh bc lá ë min Bc Vit N am. Vì vËy mun s dng ưc gen này thì c b và m u mang gen  trng thái ng hp t ln. S dng ch th RG556  chn lc gen Xa5. i vi ch th này vt băng cha gen  trng thái ng hp tri, ng hp ln cũng như d hp u cho kt qu như nhau.  phân bit chúng tôi s dng enzym DraI, sn phNm PCR ca mu mang gen ln Xa5 sau khi ct bng enzyme s xut hin vch băng kép ti kích thưc khong 450bp (hình 2). i vi qun th dòng b, tng s 10 qun th chn lc không chn ưc cây nào  dng ng hp t ln tc ng hp kháng (kt qu tng hp  bng 1), ch có 2 t hp chn ưc cây mang gen d hp t ó là qun th BB5/R23 cây s 3 và t hp BB5/Qu 99 cây s 4, nhng cá th này trng theo dâi tiÕp ë vô sau Hình 2. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa5 1. marker; 2. IR24 (/C âm gen  trng thái ng hp tri); 3. BB5 (/C gen  trng thái ng hp ln kháng); 4-9. Các cá th trong t hp BB5/R23 ln lưt t cây 1-6; 10-18. Các cá th trong t hp BB5/Qu 99 ln lưt t cây 1-9 i vi qun th dòng m, 11 qun th phân tích chn ưc 4 qun th cha có cá th cha gen ng hp kháng. Qun th V121 cây s 2, qun th V122 cây s 8, 9 và 10, qun th V128 cây s 3 và 4, qun th V133 cây s 3 và 4. N goài các cá th ng hp t kháng chúng tôi còn chn ưc dng d hp t 4 qun th trên. Các t hp còn li gen Xa5 ng hp kháng hay d hp không ưc tìm thy. 3. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa7 Gen kháng Xa7 là gen tri, do vËy ch cn mt trong hai b m cha gen này thì con lai F1 cũng có th kháng ưc các chng bnh bc lá. Gen Xa7 kháng ưc 9/10 chng bnh chính ang tn ti  min Bc Vit N am.  chn lc gen kháng Xa7 ã s dng ch th P3. on DN A nhân lên có kích thưc vt băng nu mu cha gen Xa7 ng hp t tri là 297bp, ng hp ln Xa7 là 262bp, d hp bao gm c hai vt (hình 3). Hình 3. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa7qun th V140 1. Marker; 2. IRBB7 (/C dương cha gen ng hp tri); 3. IR24 (/C âm không cha gen ng hp ln) 4-11. Các cá th ca t hp V140 ln lưt t cây s 1-8 Phân tích 7 qun th dòng b  chn lc gen kháng ng hp t tri nhưng c 7 t hp không chn ưc cá th nào mang gen ng hp tri. Tt c các cá th u mang gen ng hp t ln. (bng 1) Tương t, phân tích 11 qun th dòng m gen kháng Xa7 ng hp tri cũng không tìm thy. Tuy nhiên chúng tôi ã chn ưc các cá th dng d hp t  các qun th V115, V123 và V140. ây là ngun vt liu quý  chn ưc dòng m cha gen kháng Xa7  nhng v tip theo. 4. Kết quả chọn lọc gen kháng Xa21 Gen Xa21 là gen tri, kháng ưc 7 chng trong s 10 chng bÖnh b¹c l¸  xác nh và chn lc gen kháng Xa21 trong các t hp ã s dng ch th pTA818. Vi ch th này vt băng nhân lên ca gen Xa21 ng hp tri là 1100bp, ng hp ln 980bp, d hp có c 2 vt băng (hình 4). i vi các qun th dòng b ® sµng lc ®−îc 1 t hp cã cây d hp t, ó là BB21/c thanh víi cây s 1 và 3. Trong 11 qun th dòng m không tìm thy kiu gen ng hp t tri. Tuy nhiên dng d hp thì ã ưc tìm thy  qun th V135 cây s 2, 3 và 4. Qun th V120 cây s 2, 3 và 4, qun th V133 cây s 1, 2 và 10, qun th V138 cây s 1, 2 và qun th V140 cây s 4, 5, 6 và 7. Các qun th còn li gen u  trng thái ng hp ln. Hình 4. in di sn phNm PCR phát hin và chn lc gen kháng Xa21 1. Marker; 2. BB21 (/C cha gen); 3. IR24 (/C không cha gen) 3-11. Các cá th trong qun th BB21/c thanh cây t 1-8 Bảng 1. Tổng hợp kết quả chọn lọc gen kháng bạc lá ở các quần thể dòng bố Tổ hợp Số cây phân tích Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21 - - + + - - + + - - + + - - + + BB5/R23 6 5 1 BB4/RTQ5 10 8 2 BB11/RTQ5 6 6 6 6 6 Chệt Cụt/RTQ5 7 7 7 7 7 Chệt cụt/R838 8 8 8 8 8 BB11/R23 7 7 7 7 7 BB21/Đặc thanh 8 6 2 Chùm bông/Đặc thanh 6 6 6 6 6 BB8/4492 8 7 1 8 8 8 BB5/Q99 9 6 3 BB13/Quế 99 7 7 7 7 7 BB4/4492 9 4 2 3 BB4/R242 10 7 1 2 BB15/Trắc 64 8 8 8 8 8 Ghi chú: -: Không cha gen +: Cha gen-+: Dng d hp t. Bảng 2. Tổng hợp kết quả chọn lọc gen kháng bạc lá ở các quần thể dòng mẹ Tổ hợp Số cây phân tích Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21 - - + + - - + + - - + + - - + + V102 10 7 3 10 10 10 V115 9 6 2 1 9 8 2 9 V121 7 7 4 2 1 7 7 V122 10 5 3 2 5 2 3 10 10 V123 11 6 2 3 11 8 3 11 V125 6 6 6 6 3 3 V128 10 10 6 2 2 10 10 V130 7 5 2 7 7 4 3 V133 10 10 5 3 2 10 7 3 V138 5 1 3 1 5 5 3 2 V140 11 11 11 5 6 7 4 Ghi chú: -: Không cha gen +: Cha gen-+: Dng d hp t T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 8 IV. KÕt luËn Trên cơ s kt qu s dng ch th phân t sàng lc  mt s qun th ã chn ưc các dòng b, m mang gen kháng bc lá sau: Có 7 dòng b mang gen kháng bc lá Xa4  dng ng hp t là dòng s 4, 5 thuc t hp BB4/RTQ5; Dòng s 2, 3, 4 thuc t hp BB4/4492 và dòng s 1, 2 thuc t hp BB4/R242. Có 2 dòng b mang gen kháng bc lá Xa21 là các dòng s 1, 2 thuc t hp lai BB21/c thanh, ng thi cũng ã chn lc ưc mt s cá th cha hai gen kháng  trng thái d hp t trên các qun th dòng m như: Cây s 4 cha hai gen  trng thái d hp Xa4 và Xa7 thuc qun th V115; Cây s 6 cha 2 gen Xa4 và Xa5  trng thái d hp thuc qun th V122. Qun th V123 cây s 1 cha gen kháng Xa4 và Xa7 d hp. Qun th V130 và V138 cây s 2 cha gen Xa4 và Xa21 d hp. Qun th V140 cây s 5, 6 và 7 cha gen Xa7 và Xa21. Nhng cá th cha 2 gen khác nhau  trng thái d hp là ngun vt liu vô cùng quý giá  to ra ging cha a gen kháng, phc v c lc trong công tác chn to ging lúa lai kháng bnh bc lá. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Phan Hữu Tôn, 2005. Phân b, c im gây bnh các chng vi khuNn bc lá lúa và phát hin ngun gen kháng bng k thut PCR. Khoa hc Công ngh và Phát trin nông thôn 20 năm i mi, tp 1, tr 311-325. 2. Bùi Trọng Thủy, Furuya, ., Taura, S., Yoshimura, A., Lê Lương Tề, Phan Hữu Tôn, 2007. Mt s nhn xét v s a dng ca các nhóm nòi vi khuNn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây bnh bc lá lúa  min Bc Vit Nam (2001- 2005). Tp chí BVTV, ISSN 0868-2801, s 3(213)-2007. tr 19-26. 3. Furuya, ., Taura, S., Bui Trong Thuy, Phan Huu Ton, guyen Van Hoan & Yoshimura, A., 2003. “Experimental technique for Bacterial Blight of Rice”. HAU- JICA ERCB Project, Hanoi, 2003, 42 pages. 4. aruto Furuya, Bui Trong Thuy, Matsaru Matsumoto, Seint San Aye & Phan Huu Ton, 2002. “Isolation and preservation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from Vietnam in 2001-2002”. Kyushu Uni. Institute of Tropical Agricaltural, Bull. Vol.25,pp.43-50, Japan. 5. McCouch, S.R., Abenes, M.L., Angeles, R., Khush, G.S. & Tanksley, S.D., 1991. Molecular tagging of a recessive gene Xa5, for resistance to bacterial blight of rice. Rice Genet. Newsl., 8: 143-145. 6. Ronald, P.C., Albano, B., Tabien, R., Abenes, L., Wu, K., McCouch, S.R. & Tanksley, S.D., 1992. Genetic and physical analysis of the rice bacterial blight resistance locus, Xa21. Mol. Gen. Genet., 236: 113-120. 7. Yoshimura, S., Yoshimura, A., Saito, A., Kishimoto, ., Kawase, M., Yano, M., akagahra, M., Ogawa, T. & Iwata, ., 1992. RFLP analysis of introgressed chromosomal segments in three near-isogenic lines of rice bacterial blight resistance genes, Xa1, Xa3 and Xa4. Jpn. J. Genet., 67: 29-37 gười phản biện: T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 9 PGS. TS. Nguyn Văn Vit . ca cỏc gen khỏng bệnh bạc lá trong cỏc th h phõn ly nhất là cỏc dũng cú cha gen khỏng dng ng hp tử phục vụ tốt hơn cho công tác chọn giống lúa lai II quả chọn lọc gen kháng Xa21 Gen Xa21 là gen tri, kháng ưc 7 chng trong s 10 chng bÖnh b¹c l¸  xác nh và chn lc gen kháng Xa21 trong các