Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate

Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 i NHẬN XÉT CỦA GVHD Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này em xin gửi lời cảm ơn đến - Cô Huỳnh Ngọc Oanh, Bộ môn Công nghệ Sinh học trƣờng đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn. - Gia đình và bạn bè đã động viên em hoàn thành luận văn. - Các bạn cùng lớp, đặc biệt là các bạn, các anh chị cùng thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học. Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô đã dạy dỗ em trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Do thời gian thực hiện luận văn và kiến thức của em hạn chế, nên không tránh khỏi sai sót. Rất mong nhận đƣợc ý kiến của thầy cô và các bạn. Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 iii TÓM TẮT LUẬN VĂN Enzyme α-Amylase là enzyme quan trọng dùng để thủy phân tinh bột đƣợc ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp. Vấn đề cố định để tái sử dụng enzyme cũng đã đƣợc đề cập trong rất nhiều nghiên cứu. Luận văn này khảo sát khả năng cố định enzyme α-Amylase trên chất mang vô cơ kết hợp với chất mang hữu cơ. Enzyme α- amylase đƣợc khảo sát cố định trên celite, silica gel, celite kết hợp với alginate, silica gel kết hợp với alginate. Kết quả hiệu suất hoạt tính thu đƣợc cao nhất ở celite kết hợp với alginate (60%) và silica gel kết hợp với alginate (44%). Enzyme cố định trên celite kết hợp với alginate bị mất hoạt tính nhanh chóng. Tuy nhiên kết quả rất khả quan đối với enzyme cố định trên silica gel kết hợp với alginate. Sau 40 lần sử dụng enzyme vẫn giữ đƣợc 60 % hoạt tính. Khoảng pH hoạt động tối ƣu của enzyme cố định khoảng 5,5. Khoảng nhiệt độ hoạt động tối ƣu là 80 – 90 o C. Trong số các nguồn cơ chất tinh bột đƣợc khảo sát lƣợng đƣờng khử tạo ra cao nhất đối với tinh bột khoai tây. SUMMARY Alpha-amylase is one of the most important commercial enzyme used to hydrolysis starch to products with low molecular weight in many kinds of industry. From that, there were so many studies about immobilization of alpha-amylase. To continue, this dissertation researched immobilization Termamyl on unorganic carriers (celite, silica gel) combine with alginate. The enzyme immobilized on celite – alginate exhibited the highest activities (60% compared with the free enzyme) but lost its activities immediately. However the result is quite respective with the enzyme immobilized on silica gel – alginate, retained 44% of the initial activity of free enzyme. These si – alg enzyme capsules carrying α-amylase retained 60% of their initial efficiency after 40 starch hydrolysis batches. When performing the hydrolysis of starch, the shifts of optimum temperature from 80 to 90 ◦C and pH around 5.5. Among the various starchy substrates tested, higher amounts of reducing sugars were released from potato starch hydrolysis. Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 iv MỤC LỤC NHẬN XÉT CỦA GVHD I LỜI CẢM ƠN II TÓM TẮT LUẬN VĂN III MỤC LỤC IV CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 2.1 Enzyme cố định 5 2.2 Các phƣơng pháp cố định enzyme 5 2.2.1 Phƣơng pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang 5 2.2.2 Phƣơng pháp nhốt enzyme 7 2.3 Chất mang 8 Chia làm hai loại: hữu cơ và vô cơ 8 2.3.1 Chất mang hữu cơ – alginate 8 2.3.2 Chất mang vô cơ 12 2.4 Enzyme amylase 13 2.4.1 Chế phẩm Termamyl 14 2.4.2 Một số công trình nghiên cứu cố định enzyme 14 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP 20 3.1 Vật liệu – hóa chất 20 3.2 Phƣơng pháp 20 3.2.1 Phƣơng pháp chung 20 3.2.2 Khảo sát quá trình cố định enzyme 22 3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định 24 3.2.4 Phƣơng pháp tính toán 25 3.2.5 Anova - Phân tích phƣơng sai một nhân tố 26 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 v CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 4.1. Khảo sát chế phẩm enzyme Termamyl 27 4.1.1. Khảo sát hàm lƣợng protein của chế phẩm enzyme Termamyl 27 4.1.2. Khảo sát hoạt tính của chế phẩm enzyme Termamyl 27 4.2 Cố định enzyme trên celite 28 4.3 Cố định enzyme trên celite kết hợp với alginate 29 4.3.1 Khảo sát tỉ lệ Celite 29 4.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch sodium alginate 30 4.4 Cố định enzyme trên silica gel 32 4.5 Cố định enzyme trên silica gel kết hợp với alginate 33 4.5.1 Khảo sát tỉ lệ silica gel 33 4.5.2 Khảo sát nồng độ alginate 34 4.6 Khảo sát độ ổn định của enzyme cố định 35 4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 37 4.8 Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 38 4.9 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định si – alg 39 4.9.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cơ chất 39 4.9.2 Khảo sát phản ứng liên tục 41 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 47 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 vi CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG bđ: Ban đầu cđ: Cố định pƣ: Phản ứng cel: celite si: silica gel alg: alginate. OD 540 : Độ hấp thu ở bƣớc sóng 540 nm OD 595 : Độ hấp thu ở bƣớc sóng 595 nm ODtb: Độ hấp thu trung bình của mẫu ∑protein cđ: Tổng lƣợng protein đƣợc cố định HS: Hiệu suất Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.2: Một số đặc điểm của chế phẩm Termamyl 14 Bảng 2.2: Kết quả nghiên cứu cố định lipase trên celite 19 Bảng 4.1: Kết quả khảo sát trên chế phẩm Termamyl 29 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cđ protein và tổng hoạt độ của enzyme cđ trên celite 29 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg 31 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ cel – alg 33 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ trên silica gel 34 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg 35 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg 36 Bảng 4.8: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme 36 Bảng 4.9: So sánh enzyme cđ celite – alg với enzyme cđ si – alg 38 Bảng 4.10: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme cđ si – alg 39 Bảng 4.11: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cđ si – alg 40 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột 1 Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup 2 Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme 3 Hình 2.1: Enzyme hấp phụ lên chất mang 6 Hình 2.2: Phƣơng pháp nhốt enzyme trong hệ gel và trong hệ sợi 8 Hình 2.3: Phƣơng pháp bao gói enzyme 8 Hình 2.4: Cấu tạo phân tử alginate 10 Hình 2.5: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến hiệu suất cố định protein 15 Hình 2.6 : Sơ đồ xử lý enzyme và chất mang đối với chất mang ƣa nƣớc và kỵ nƣớc 16 Hình 2.7: So sánh nồng độ đƣờng khử theo thời gian ở 50 o C và hiệu suất tái sử dụng của α-amylase tự do và α-amylase cố định 17 Hình 2.8: Nồng độ đƣờng khử theo thời gian phản ứng sử dụng α-amylase cố định tại các nồng độ alginate khác nhau 18 Hình 2.9: Thuỷ phân tinh bột bằng enzyme cố định trong alginate bổ sung các nồng độ silíc gel khác nhau 18 Hình 2.10: Khả năng tái sử dụng enzyme cố định trên alginate và alginate/silica gel với các hàm lƣợng enzyme khác nhau 19 Hình 3.1: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ 23 Hình 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate 24 Hình 3.3: Hệ thống cột phản ứng 25 Hình 4.1: Đồ thị tƣơng quan giữa OD và nồng độ albumin 28 Hình 4.2: Đồ thị tƣơng quan giữa OD và nồng độ đƣờng khử 29 Hình 4.3: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:celite lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ cel – alg 30 Hình 4.4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cố cđ cel – alg 32 Hình 4.5: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg 33 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 ix Hình 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ của e cđ si – alg 34 Hình 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ của enzyme cđ si – alg 36 Hình 4.8: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cđ si – alg 38 Hình 4.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ pƣ lên nồng độ đƣờng khử tạo thành 39 Hình 4.10: Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên nồng độ đƣờng khử tạo thành 40 Hình 4.11: Khả năng thuỷ phân các loại tinh bột khác nhau của enzyme cđ si – alg 41 Hình 4.12: Khảo sát ảnh hƣởng của vận tốc dòng cơ chất lên khả năng xúc tác của enzyme cđ si – alg 42 Hình 4.13: Khảo sát khả năng phản ứng theo thời gian sử dụng enzyme cđ si – alg 43 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 1 CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Tinh bột (C 6 H 10 O 5 ) n , một carbonhydrate dự trữ của thực vật, là các polisacharide có khối lƣợng phân tử rất lớn đƣợc tạo thành từ các đơn phân phân tử glucose thông qua các cầu nối 1 – 4 và 1 – 6. Quá trình thủy phân các liên kết 1 – 4 của tinh bột để tạo thành các phân tử nhỏ hơn đƣợc xúc tác bởi enzyme α-amylase. Tinh bột là một nguồn cung cấp năng lƣợng quan trọng của con ngƣời. Qúa trình thủy phân tinh bột xúc tác bởi enzyme α-amylase là một trong những quá trình quan trọng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy và dệt may, đặc biệt là trong ngành công nghệ thực phẩm sản xuất sirup [9]. Trong quá trình sản xuất sirup, α-amylase cắt ngắn phân tử tinh bột giúp giảm nhanh độ nhớt tạo thuận lợi cho quá trình thủy phân tiếp theo [2]. Cố định enzyme α-amylase cho phép dễ dàng tách enzyme ra khỏi sản phẩm thủy phân, tiết kiệm lƣợng enzyme nhờ có thể tái sử dụng và giảm các chi phí có liên quan. Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột [...]... các chất hoạt hoá tránh gây biến tính enzyme đồng thời vẫn giữ đƣợc sự ổn định nhờ lớp bao gói alginate Enzyme a b Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme a) Bao gói bằng gel alginate b )Kết hợp cố định trên chất mang với bao gói 3 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 Mục tiêu  Khảo sát quá trình cố định enzyme lên chất mang vô cơ và kết hợp. .. nƣớc cất ở 4oC 23 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 Enzyme cố định trên celite hoặc silica gel Dung dịch Sodium alginate Trộn Dung dịch CaCl2 Tạo gel Nƣớc cất Rửa Enzyme cố định Hìmh 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate 3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định Phản ứng gián... 6.23 Nghiên cứu này cho thấy triển vọng cố định enzyme bằng phƣơng pháp hấp phụ đơn thuần trên celite (hiệu suất hoạt tính > 10%) Đề tài chúng tôi thực hiện cố định enzyme Termamyl (alpha amylase) trên vật liệu celite và kết hợp với alginate 19 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 CHƢƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu – hóa chất Chế. .. phát triển các phƣơng pháp sử dụng chất hoạt hoá cho hiệu suất cố định cao nhƣng lại có nhƣợc điểm là các hoá chất này đều độc hại có thể ảnh hƣởng đến hoạt tính enzyme Một nhƣợc điểm nửa của chất mang vô cơ là khả năng ứng dụng trong môi trƣờng sản xuất kém Do chất mang vô cơ 2 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 thƣờng ở dạng bột, dễ... calcium alginate  Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định  Khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ lên hoạt tính và độ ổn định của enzyme cố định  Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định 4 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Enzyme cố định Enzyme có bản chất là protein đƣợc sinh vật tổng hợp. .. của chất mang Khả năng hấp phụ của chất mang càng cao, 5 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 enzyme càng đƣợc gắn nhiều vào chất mang Do đó khả năng tái sử dụng enzyme cố định càng cao Nói chung phƣơng pháp hấp phụ có những ƣu điểm sau: - Tính thuận nghịch: Không những có thể tinh sạch đƣợc protein mà còn có thể tái sử dụng chất mang. .. độ đƣờng hoá có thể >75oC thậm chí có thể hoạt động ở 90 – 100oC) [2] 13 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 2.4.1 Chế phẩm Termamyl Chế phẩm Termamyl 120L, là chế phẩm của enzyme α-amylase chịu nhiệt đƣợc sản xuất từ chủng vi sinh vật Bacillus licheniformis Chế phẩm này có dạng dung dịch lỏng hoặc hơi sánh, màu nâu nhạt hoặc đậm tuỳ... ngƣời ta thƣờng hoạt hoá chất mang Tuy nhiên trong một số trƣờng hợp ngƣời ta hoạt hoá 6 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 enzyme Khác với phƣơng pháp hấp phụ đơn thuần phƣơng pháp sử dụng liên kết cộng hoá trị là phƣơng pháp không thuận nghịch, enzyme bị đông cứng vào chất mang do cấu trúc đa liên kết gắn vào chất mang do đó làm thay đổi... đối với hydrophilic silica gel and 0.099 mg/ml for DEAE-cellulose bao gói trong gel alginate so với enzyme tự do 0.199 mg/ml) Khoảng nhiệt độ tối ƣu của enzyme cố định khoảng 50 – 60oC, pH tối ƣu khoảng 5.0 – 5.5 15 Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 Enzyme đồng cố định trên silica gel và DEAE-cellulose nhốt trong alginate giữ đƣợc 92.3.. .Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate 2010 Hạt tinh bột Huyền phù tinh bột α-amylase Quá trình hồ hoá Tinh bột hồ hoá Quá trình dịch hoá Tinh bột Dịch hoá Quá trình đƣờng hoá Sirup glucose &maltose Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup Đã có rất nhiều phƣơng pháp nghiên cứu sử dụng chất mang vô cơ cố định αamylase nhƣ hấp . industry. From that, there were so many studies about immobilization of alpha-amylase. To continue, this dissertation researched immobilization Termamyl on unorganic carriers (celite, silica gel). cho các phản ứng nhất định trong cơ thể mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào. Theo Trevan, thuật ngữ enzyme cố định (immobilized enzyme, insoluble enzyme) đƣợc hiểu là đƣa enzyme vào