Nghiên cứu cố định chế phẩm Termamyl trên chất mang vô cơ (celite, silica gel) kết hợp alginate

Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup Đã có rất nhiều phương pháp nghiên cứu sử dụng chất mang vô cơ cố định amylase như hấp phụ lên than hoạt tính, bentonite hay đất sét và sử dụng c

NHẬN XÉT CỦA GVHD

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này em xin gửi lời cảm ơn đến

- Cô Huỳnh Ngọc Oanh, Bộ môn Công nghệ Sinh học trường đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện luận văn

- Gia đình và bạn bè đã động viên em hoàn thành luận văn

- Các bạn cùng lớp, đặc biệt là các bạn, các anh chị cùng thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô đã dạy dỗ em trong suốt thời gian học tập tại trường

Do thời gian thực hiện luận văn và kiến thức của em hạn chế, nên không tránh khỏi sai sót Rất mong nhận được ý kiến của thầy cô và các bạn

SUMMARY

Alpha-amylase is one of the most important commercial enzyme used to hydrolysis starch to products with low molecular weight in many kinds of industry From that, there were so many studies about immobilization of alpha-amylase To continue, this dissertation researched immobilization Termamyl on unorganic carriers (celite, silica gel) combine with alginate The enzyme immobilized on celite – alginate exhibited the highest activities (60% compared with the free enzyme) but lost its activities immediately However the result is quite respective with the enzyme immobilized on silica gel – alginate, retained 44% of the initial activity of free enzyme These si – alg enzyme capsules carrying α-amylase retained 60% of their initial efficiency after 40 starch hydrolysis batches When performing the hydrolysis of starch, the shifts of optimum temperature from 80 to 90 ◦C and pH around 5.5 Among the various starchy substrates tested, higher amounts of reducing sugars were released from potato starch hydrolysis

MỤC LỤC

NHẬN XÉT CỦA GVHD I LỜI CẢM ƠN II TÓM TẮT LUẬN VĂN III MỤC LỤC IV CÁC TỪ VIẾT TẮT SỬ DỤNG VI DANH MỤC BẢNG VII DANH MỤC HÌNH VIII

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Enzyme cố định 5

2.2 Các phương pháp cố định enzyme 5

2.2.1 Phương pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang 5

2.2.2 Phương pháp nhốt enzyme 7

2.3 Chất mang 8

Chia làm hai loại: hữu cơ và vô cơ 8

2.3.1 Chất mang hữu cơ – alginate 8

2.3.2 Chất mang vô cơ 12

2.4 Enzyme amylase 13

2.4.1 Chế phẩm Termamyl 14

2.4.2 Một số công trình nghiên cứu cố định enzyme 14

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 Vật liệu – hóa chất 20

3.2 Phương pháp 20

3.2.1 Phương pháp chung 20

3.2.2 Khảo sát quá trình cố định enzyme 22

3.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định 24

3.2.4 Phương pháp tính toán 25

3.2.5 Anova - Phân tích phương sai một nhân tố 26

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27

4.1 Khảo sát chế phẩm enzyme Termamyl 27

4.1.1 Khảo sát hàm lượng protein của chế phẩm enzyme Termamyl 27

4.1.2 Khảo sát hoạt tính của chế phẩm enzyme Termamyl 27

4.2 Cố định enzyme trên celite 28

4.3 Cố định enzyme trên celite kết hợp với alginate 29

4.3.1 Khảo sát tỉ lệ Celite 29

4.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch sodium alginate 30

4.4 Cố định enzyme trên silica gel 32

4.5 Cố định enzyme trên silica gel kết hợp với alginate 33

4.5.1 Khảo sát tỉ lệ silica gel 33

4.5.2 Khảo sát nồng độ alginate 34

4.6 Khảo sát độ ổn định của enzyme cố định 35

4.7 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 37

4.8 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg 38

4.9 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định si – alg 39

4.9.1 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cơ chất 39

4.9.2 Khảo sát phản ứng liên tục 41

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.2: Một số đặc điểm của chế phẩm Termamyl 14

Bảng 2.2: Kết quả nghiên cứu cố định lipase trên celite 19

Bảng 4.1: Kết quả khảo sát trên chế phẩm Termamyl 29

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:celite đến hiệu suất cđ protein và tổng hoạt độ của enzyme cđ trên celite 29

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel– alg 31

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ cel – alg 33

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ trên silica gel 34

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg 35

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg 36

Bảng 4.8: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme 36

Bảng 4.9: So sánh enzyme cđ celite – alg với enzyme cđ si – alg 38

Bảng 4.10: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme cđ si – alg 39

Bảng 4.11: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH lên hoạt độ của enzyme cđ si – alg 40

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột 1

Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup 2

Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme 3

Hình 2.1: Enzyme hấp phụ lên chất mang 6

Hình 2.2: Phương pháp nhốt enzyme trong hệ gel và trong hệ sợi 8

Hình 2.3: Phương pháp bao gói enzyme 8

Hình 2.4: Cấu tạo phân tử alginate 10

Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến hiệu suất cố định protein 15

Hình 2.6 : Sơ đồ xử lý enzyme và chất mang đối với chất mang ưa nước và kỵ nước 16

Hình 2.7: So sánh nồng độ đường khử theo thời gian ở 50oC và hiệu suất tái sử dụng của α-amylase tự do và α-amylase cố định 17

Hình 2.8: Nồng độ đường khử theo thời gian phản ứng sử dụng α-amylase cố định tại các nồng độ alginate khác nhau 18

Hình 2.9: Thuỷ phân tinh bột bằng enzyme cố định trong alginate bổ sung các nồng độ silíc gel khác nhau 18

Hình 2.10: Khả năng tái sử dụng enzyme cố định trên alginate và alginate/silica gel với các hàm lượng enzyme khác nhau 19

Hình 3.1: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ 23

Hình 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate 24

Hình 3.3: Hệ thống cột phản ứng 25

Hình 4.1: Đồ thị tương quan giữa OD và nồng độ albumin 28

Hình 4.2: Đồ thị tương quan giữa OD và nồng độ đường khử 29

Hình 4.3: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:celite lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ cel – alg 30

Hình 4.4: Ảnh hưởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cố cđ cel – alg 32

Hình 4.5:Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg 33

Hình 4.6: Ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ

của e cđ si – alg 34

Hình 4.7: Ảnh hưởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ của enzyme cđ si – alg 36

Hình 4.8: Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cđ si – alg 38

Hình 4.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ pư lên nồng độ đường khử tạo thành 39

Hình 4.10: Ảnh hưởng của pH phản ứng lên nồng độ đường khử tạo thành 40

Hình 4.11: Khả năng thuỷ phân các loại tinh bột khác nhau của enzyme cđ si – alg 41

Hình 4.12: Khảo sát ảnh hưởng của vận tốc dòng cơ chất lên khả năng xúc tác của enzyme cđ si – alg 42

Hình 4.13: Khảo sát khả năng phản ứng theo thời gian sử dụng enzyme cđ si – alg 43

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Tinh bột (C6H10O5)n, một carbonhydrate dự trữ của thực vật, là các polisacharide có khối lượng phân tử rất lớn được tạo thành từ các đơn phân phân tử glucose thông qua các cầu nối 1 – 4 và 1 – 6 Quá trình thủy phân các liên kết 1 – 4 của tinh bột để tạo thành các phân tử nhỏ hơn được xúc tác bởi enzyme α-amylase

Tinh bột là một nguồn cung cấp năng lượng quan trọng của con người Qúa trình thủy phân tinh bột xúc tác bởi enzyme α-amylase là một trong những quá trình quan trọng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, công nghiệp giấy và dệt may, đặc biệt là trong ngành công nghệ thực phẩm sản xuất sirup [9] Trong quá trình sản xuất sirup, α-amylase cắt ngắn phân tử tinh bột giúp giảm nhanh độ nhớt tạo thuận lợi cho quá trình thủy phân tiếp theo [2]

Cố định enzyme α-amylase cho phép dễ dàng tách enzyme ra khỏi sản phẩm thủy phân, tiết kiệm lượng enzyme nhờ có thể tái sử dụng và giảm các chi phí có liên quan

Hình 1.1: Cấu tạo phân tử tinh bột

Hình 1.2: Sơ đồ quá trình sản xuất sirup

Đã có rất nhiều phương pháp nghiên cứu sử dụng chất mang vô cơ cố định amylase như hấp phụ lên than hoạt tính, bentonite hay đất sét và sử dụng chất mang hữu cơ như gắn vào gel polyacrylamide, hấp phụ lên hạt gel sepharose hoạt hoá bởi cyanogen bromide (CNBr) [5], và nhốt trong hạt gel calcium alginate Tuy nhiên các phương pháp hấp phụ trên chất mang vô vơ như celite hoặc silica gel vẫn chưa được quan tâm do hiệu suất chưa cao và đặc biệt là độ ổn định thấp vì các liên kết có độ bền không cao, enzyme dể dàng thoát ra ngoài Người ta đã phát triển các phương pháp sử dụng chất hoạt hoá cho hiệu suất cố định cao nhưng lại có nhược điểm là các hoá chất này đều độc hại có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Một nhược điểm nửa của chất mang vô cơ là khả năng ứng dụng trong môi trường sản xuất kém Do chất mang vô cơ

thường ở dạng bột, dễ gây nghẽn mạch, quá trình tách enzyme cố định ra khỏi sản phẩm khó khăn Hơn nữa chất mang vô cơ thường lắng xuống đáy nên hạn chế khả năng xúc tác phản ứng Sử dụng chất mang vô cơ đòi hỏi phải có hệ thống khuấy trộn rất phức tạp, trong quá trình sản xuất có thể dẩn đến nghẽn mạch

Chất mang hữu cơ được sử dụng nổi bật hiện nay là sodium alginate với phương pháp bao gói Ưu điểm là giá thành rẻ, quá trình được thực hiện dể dàng trong điều kiện ôn hoà [10] Tuy nhiên để enzyme cố định có hiệu quả cao, lổ gel phải đủ lớn để

cơ chất có thể khuếch tán qua màng và đủ nhỏ để giữ lại enzyme Ở nhiệt độ cao, gel trương nở enzyme có thể thoát ra ngoài làm giảm khả năng tái sử dụng (theo Sadhukhan et al và cộng sự) Enzyme cố định giữ được khoảng 70 % hoạt tính sau khoảng 20 lần tái sử dụng [10] Một phương pháp khác rất triển vọng để khắc phục nhược điểm của các phương pháp trên là cố định enzyme vào các vật liệu có kích thước hạt lớn đồng thời sử dụng phương pháp bao gói hạn chế enzyme thoát ra ngoài Bắt nguồn từ ý tưởng trên, chúng tôi thực hiện đề tài này nghiên cứu sử dụng kết hợp vật liệu vô cơ (silica gel, celite) và hữu cơ (alginate) để cố định enzyme Termamyl (α-amylase) Ban đầu enzyme được gắn lên chất mang vô cơ sau đó đem đi bao gói bằng gel alginate Với mục đích tránh dùng các chất hoạt hoá tránh gây biến tính enzyme đồng thời vẫn giữ được sự ổn định nhờ lớp bao gói alginate

Hình 1.3: Mô hình cố định enzyme a) Bao gói bằng gel alginate b)Kết hợp cố định trên chất mang với bao gói

Enzyme

Mục tiêu

 Khảo sát quá trình cố định enzyme lên chất mang vô cơ và kết hợp với bao gói bằng calcium alginate

 Khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme cố định

 Khảo sát các điều kiện pH, nhiệt độ lên hoạt tính và độ ổn định của enzyme cố định

 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Enzyme cố định

Enzyme có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp và tham gia vào các phản ứng sinh học Enzyme không chỉ xúc tác cho các phản ứng nhất định trong cơ thể mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào

Theo Trevan, thuật ngữ enzyme cố định (immobilized enzyme, insoluble enzyme) được hiểu là đưa enzyme vào những pha riêng rẽ Pha này được tách riêng với pha dung dịch tự do

Enzyme cố định hay còn gọi là enzyme không hoà tan được hiểu theo cả nghĩa hẹp

có trong các tế bào sống được cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.[2]

2.2 Các phương pháp cố định enzyme

2.2.1 Phương pháp tạo liên kết giữa enzyme và chất mang

Tùy theo tính chất của chất mang, người ta thực hiện gắn enzyme vào chất mang theo những cơ chế sau:

- Phương pháp hấp phụ

- Phương pháp tạo liên kết đồng hóa trị

- Phương pháp tạo liên kết ion

- Phương pháp liên kết với kim loại

a) Phương pháp hấp phụ là một trong những phương pháp đầu tiên được dùng để

cố định enzyme Nhờ khả năng hấp phụ của các nguyên liệu làm chất mang, enzyme sẽ được gắn vào bề mặt của chất mang Khả năng hấp phụ của chất mang càng cao,

enzyme càng được gắn nhiều vào chất mang Do đó khả năng tái sử dụng enzyme cố định càng cao Nói chung phương pháp hấp phụ có những ưu điểm sau:

- Tính thuận nghịch: Không những có thể tinh sạch được protein mà còn có thể tái

sử dụng chất mang [5]

- Quá trình cố định đơn giản có thể thực hiện trong những điều kiện ôn hoà [5]

- Giữ được hoạt tính enzyme cao vì không có sự biến đổi hoá học trong quá trình

cố định [5]

Tuy nhiên enzyme cố định bằng phương pháp hấp phụ có nhược điểm là enzyme dễ

bị thoát ra khỏi bề mặt chất mang do các liên kết giữa enzyme và chất mang là những liên kết yếu dễ dàng bị phá vỡ trong các điều kiện phản ứng như lực ion cao, pH, nhiệt độ…Trong một vài trường hợp enzyme có thể được hấp phụ mạnh trên các chất mang thích hợp hoặc sự hấp phụ này đủ ổn định trong điều kiện phản ứng nhất định.[1]

Hình 2.1: Enzyme hấp phụ lên chất mang

b) Phương pháp cố định bằng liên kết cộng hoá trị

Cố định bằng liên kết cộng hoá trị là phương pháp được tìm ra thứ hai từ khoảng những năm 1950 và hiện nay là một trong những phương pháp quan trọng nhất để cố định enzyme [5] Do lực liên kết giữa enzyme và chất mang mạnh nên có thể hạn chế

sự rò rỉ enzyme ra khỏi bề mặt chất mang

Nói chung liên kết giữa chất mang và enzyme được tạo ra bằng liên kết hoá học giữa nhóm amino acid hoạt động trên bề mặt phân tử enzyme và nhóm chức hoá học gắn trên bề mặt chất mang Để có thể tạo ra các liên kết có hiệu quả nhóm chức của chất mang hoặc enzyme phải được hoạt hoá trước khi cố định Thông thường người ta thường hoạt hoá chất mang Tuy nhiên trong một số trường hợp người ta hoạt hoá

enzyme Khác với phương pháp hấp phụ đơn thuần phương pháp sử dụng liên kết cộng hoá trị là phương pháp không thuận nghịch, enzyme bị đông cứng vào chất mang do cấu trúc đa liên kết gắn vào chất mang do đó làm thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme.[5]

c) Phương pháp tạo liên kết ion

Dựa trên khả năng tạo liên kết ion giữa chất mang và enzyme, người ta gắn enzyme vào chất mang Liên kết ion thường không bền bằng sự hấp phụ của enzyme đối với chất mang [1]

Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là CMC, cellulose phosphate…

d) Phương pháp tạo liên kết với kim loại

Người ta làm tăng hoạt tính bề mặt của chất mang bằng những hợp chất kim loại

Từ đó, các enzyme sẽ gắn chặt hơn vào chất mang [1]

Những chất mang được hoạt hóa bề mặt bằng kim loại đã được ứng dụng là cellulose, gelatin, nhôm…

2.2.2 Phương pháp nhốt enzyme

Có hai phương pháp nhốt enzyme

a) Phương pháp nhốt enzyme trong gel: là phương pháp dựa trên cơ sở tạo ra một màng bọc hay một polimer Các chất tham gia phản ứng và sản phẩm của phản ứng có thể thẩm thấu vào trong hoặc thông ra ngoài thông qua màng bọc này và enzyme được giữ lại trong khuôn gel đó Phương pháp được thực hiện bằng cách trộn enzyme vào một polymer sau đó tiến hành các quá trình trùng hợp với

sự có mặt của một hay nhiều tác nhân khâu mạch, tạo ra phức chelate Khi đó, enzyme sẽ được bao bọc trong khoảng không của gel mới tạo thành [1]

b) Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi: có khả năng xúc tác phản ứng tốt hơn phương pháp nhốt trong hệ gel Các sợi thường được sử dụng là các sợi nhân tạo trong đó phổ biến nhất là cellulose acetate.[1]

Hình 2.2: Phương pháp nhốt enzyme trong hệ gel và trong hệ sợi

c Phương pháp tạo vi nang nhốt enzyme

Phương pháp vi bao hay còn gọi là phương pháp bao gói enzyme là phương pháp tạo một lớp màng bao chế phẩm enzyme tách khỏi pha dung dịch phản ứng.[1]

Hình 2.3: Phương pháp bao gói enzyme

2.3 Chất mang

Chia làm hai loại: hữu cơ và vô cơ

2.3.1 Chất mang hữu cơ – alginate

Alginate được tìm ra vào khoảng cuối thế kỷ 19 và trở thành một sản phẩm công nghiệp quan trọng được thu nhận từ tảo nâu ở biển Ở tảo nâu alginate là loại polysaccharide chiếm tỉ lệ cao nhất (lên tới 40% trọng lượng khô) nằm trong tế bào chất dưới dạng gel của sodium, cancium, mangnium strontium và barium có chức năng như bộ khung nâng đở tế bào, mang lại sự cứng chắc và mềm dẻo cho mô Alginate thu nhận từ tảo nâu có các đặc tính thay đổi theo mùa và sự thay đổi của điều kiện sinh thái nên người ta đang hướng đến nguồn alginate mới từ vi khuẩn Cho đến

hiện nay người ta chỉ mới tìm ra hai loại vi khuẩn sản xuất alginate là Pseudomonas và

Azotobacter Cả hai loài vi khuẩn này đều sản xuất alginate như một dạng

polissacharide ngoại bào trong giai đoạn tăng trưởng sinh dưởng của chúng nhưng chức năng sinh học của chúng là khác nhau và khác với alginate ở tảo nâu Trong khi ở

Dung dịch bên trong Màng bao

Enzyme

tảo nâu alginate đóng vai trò như một chất tạo cấu trúc nội bào (tương tự như pectin ở

tế bào thực vật) thì ở vi khuẩn nó đóng vai trò hoàn toàn khác biệt Vi khuẩn đất gram

âm Azotobacter vinelandii Alginates trải qua một quá trình phân hoá chống lại sự mất

nước bằng cách tạo bào tử trong các điều kiện bất lợi Bào nang trưởng thành được bao quanh bởi hai lớp vỏ Mỗi lớp vỏ này đều chứa thành phần rất cao alginate để có thể

giữ được tính toàn ven trong cấu trúc (Moreno et al 1998) Ở Pseudomonas

aeruginosa, một trong những vi khuẩn gây bệnh ở người, alginate được coi là một yếu

tố gây độc trong quá trình xâm nhiểm của vi khuẩn vào biểu mô (Gacesa and Russell 1990) Từ các đặc điểm có liên quan alginate được quan tâm nhiều trong các lĩnh vực màng sinh học (biofilm) và vật liệu sinh học Ở vi khuẩn alginate được tổng hợp ở dạng polymannuronic acid, trải qua quá trình biến đổi hoá học bao gồm quá tình acetyl hoá và sự epimer hoá diển ra trong quá trình vận chuyển periplasmmic trước khi được đưa ra ngoài qua màng Alginate với các đặc tính đặc biệt của nó đã được tăng cường cho những ứng dụng trong hoá sinh và y học Các chủng vi sinh vật biến đổi gen có thể tạo ra các loại alginate có các đặc tính mới phù hợp hơn cho các ứng dụng trongy học

và công nghiệp

Alginate là một polysaccharide thuộc nhóm copolymers mạch thẳng (không phân nhánh) và không lặp lại bao gồm một lượng b-D-mannuronic acid và đồng phân C5 của nó a- L-guluronic acid thông qua cầu nối b-1,4-glycosidic giống như phân tử ADN Là một polimer mang điện tích âm có dạng dung dịch nhớt đến dạng gel khi có

sự hiện diện của các liên kết với các cation hoá trị cao

Hình 2.4: Cấu tạo phân tử alginateAlginate hiện nay được sử dụng cho rất nhiều các mục đích công nghiệp khác nhau

và chủ yếu được thu nhận từ tảo nâu Bên cạnh những ứng dụng truyền thống như làm phụ gia thực phẩm alginate còn được ứng dụng nhiều trong y học như làm băng gạc trong điều trị vết thương hoặc dùng làm phụ gia, tá dược trong sản xuất thuốc Ngoài ra alginate còn là chất mang hữu cơ triển vọng được ứng dụng trong công nghệ lên men

cố định tế bào cũng như enzyme

Cố định enzyme trong alginate là một phương pháp rất hiệu quả, đơn giản trải qua một bước duy nhất, và thực hiện trong điều kiện ôn hoà Để cố định enzyme trong gel, người ta trộn enzyme vào dung dich sodium alginate sau đó nhỏ hỗn hợp này vào một dung dịch muối đa hóa trị Tuy nhiên phương pháp này cũng có nhiều giới hạn như bản chất hoá học đa dạng của alginate do nó có nguồn gốc tự nhiên và mạng lưới tạo liên kết ion trong gel có tính thuận nghịch Khi trong môi trường phản ứng có nhiều nhóm

có ái lực cao đối cancium như nhóm phosphate hay nhóm nitrate, calcium sẽ dần bị thay thế bởi các ion không tạo gel như sodium hay magnesium làm phá vỡ cấu trúc gel Nhược điểm này có thể được khắc phục bằng cách bảo quản hạt gel trong dung dịch trung tính có calcium với nồng độ khoảng vài milimol/l và giữ tỉ lệ Na:Ca nhỏ hơn

25:1 đối với alginate giàu G và 3:1 đối với alginate giàu M Ngoài ra có thể thay thế Ca bởi các ion tạo liên kết hoá trị khác có ái lực cao đối với alginate bao gồm Pb>Cu>Cd2>Ba2>Sr2> Ca>Co, Ni, Zn>Mn Ngoài ra tuy được tinh chế, alginate có thể vẫn còn chứa một lượng nhỏ polyphenol có thể gây ảnh hưởng cho enzyme

Các tính chất hoá lý của alginate như độ nhớt, cơ tính, độ xốp, độ giản nở chịu ảnh hưởng phần lớn do tỉ lệ thành phần G và M trong alginate

Alginate có độ nhớt rất cao khi nó vẫn còn ở trong tế bào, khi được tách chiết độ nhớt giảm đáng kể Độ nhớt phụ thuộc vào phương pháp tách chiết và thành phần có β-D-Mannuronic (M) hay không Các đoạn mạch ngắn chứa những đoạn M sẽ không tham gia vào quá trình tạo gel, do đó nó dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, ở dạng acid hay muối kết hợp với kim loại hóa trị 2 trở lên, sẽ tạo alginate không tan trong nước, nhưng lại có khả năng hút nước và trương nở tạo thể gel Khi kết hợp với ion kim loại hóa trị

1 như Na+, K+, NH4… sẽ làm alginate tan trong nước tạo dung dịch có độ nhớt cao Trong đó, những loại có độ nhớt vào khoảng 200 ÷ 400 mPa.s là được sử dụng nhiều nhất Khi nồng độ thay đổi, độ nhớt cũng thay đổi theo, ngoài ra đố nhớt còn phụ thuộc vào:

- Khối lượng phân tử: khối lượng phân tử càng cao, độ nhớt càng tăng Các nhà sản xuất sẽ kiểm soát khối lượng phân tử (DP) tương ứng với độ nhớt Độ nhớt của alginate từ 10 ÷ 1000 mPa.s ứng với DP khoảng 100 – 1000 đơn vị

- Nhiệt độ: khi nhiệt độ tăng 10oC thì độ nhớt giảm tương ứng 2,5%

Bằng cách tăng tỉ lệ G sẽ làm tăng cơ tính của gel và sự ổn định của nó trước các yếu tố làm hỏng gel (Na, Mg) Tăng tỉ lệ G làm tăng độ xốp, giảm sự co trong quá trình tạo gel, và hạt gel không bị trương nở khi làm khô Tăng tỉ lệ M làm gel nhẹ hơn đồng thời tăng khả năng co giản Gel co lại nhiều hơn và giảm độ xốp Chúng dể bị trương

nở khi làm khô và dể dàng bị tan khi có sự hiên diện của các nhóm EDTA hay phosphate hơn là gel tạo bởi alginate giàu G

Sự khuếch tán có vai trò quan trong trong cố định enzyme bằng gel alginate vì vậy

ta phải biết được kích thước lỗ xốp trên bề mặt gel và tác dụng của nó Khả năng khuếch tán của các phân tử nhỏ như glucose, etanol hay lactate chịu ảnh hưởng rất ít

của gel Tốc độ khuếch tán các chất này trong alginate rất cao đạt 90% tốc độ khuếch tán trong nước Các phân tử lớn như protein bắt đầu khó khuếch tán và bị giữ lại trong mạng lưới gel Tuy nhiên nghiên cứu cho thấy các phân tử protein có khối lượng phân

tử MW>3.105

vẫn có thể bị rò rỉ ra khỏi bề gel với tốc độ phụ thuộc vào kích thước phân tử Các gel alginate giàu G thường có tốc độ khuếch tán cao Kích thước lỗ xốp cũng được nghiên cứu bằng các phương pháp khác nhau kết quả cho thấy đường kính

lỗ xốp giao động từ 5 – 200 nm trong khi mạng lưới trên bề mặt hạt gel thì hẹp hơn 5 –

16 nm Do gel tích điện âm nên các protein trung tính thường không dễ dàng khuếch tán vào trong gel Mặt khác sau khi cố định chúng cũng có xu hướng thoát ra ngoài Để khắc phục nhược điểm này có thể sử dụng các phương pháp tăng cường độ ổn định của gel đã nói ở trên Một phương pháp hiệu quả hơn là cho alginate tương tác với các polycation như polypeptide hay chitosan tạo thành lớp màng polyanion – polycation Đường kính lỗ xốp của gel calcium alginate có thể được giảm đáng kể bằng cách làm khô hạt gel, sử dụng alginate giàu guluronic acid [6]

2.3.2 Chất mang vô cơ

a) Celite

Celite hay còn gọi là diatomic là một loại đá trầm tích có chứa silic, dể vở vụn, dễ nghiền vụn, giống như đất nhẹ hay có dạng như đá phấn Celite thường có màu sáng, xốp, nhẹ (nổi trên nước cho đến khi đạt được độ bảo hoà) và điều đặc biệt quan trọng là trơ với hầu hết các chất lỏng và khí Nó dẫn nhiệt kém và có điểm nóng chảy rất cao Các sản phẩm thương mại thường có thành phần được phân tích khoảng 80 – 90% silica, có thể lên đến 95% (SiO2), cộng thêm thành phần alumina 2 – 4 % và hematite (0,5 – 5%) Thành phần phân tích thường mất đi 4 – 6% do bị đốt cháy Khối lượng riêng nhỏ khoảng 320 – 640 g/l với phần rỗng chiếm tới 80 – 90 %, celite có thể chứa

từ 10% đến hơn 60% nước Vì vậy đá ở dạng khô có thể hấp phụ một lượng nước nặng hơn gấp nó từ 1.5 đến 3 lần Đá ở dạng bột tự nhiên có khối lượng riêng dao động từ 80 – 250 g/l Điểm nóng chảy dao động từ 1000 – 1750 oC

Các sản phẩm celite thương mại có kích thước hạt tốt, hình dạng không nhất định, hạt xốm, có bề mặt lớn, khả năng hấp phụ chất lỏng cao và trơ hoá học[14]

b) Silica gel

Silica gel hay gel acid silixic là một chất rất sẵn có trong tự nhiên có nhiều tính năng ưu việt rất được quan tâm hiện nay Silica gel thực chất là dioxit silic, ở dạng hạt cứng và xốp (có vô số khoang rỗng li ti trong hạt) Công thức hóa học đơn giản của nó

là SiO2.nH2O (n<2), được sản xuất từ natri othosilicat (Na2SiO4) hoặc silic tetraclorua (SiCl4) Hiện nay silica gel có vai trò rất quan trọng trong công nghệ hóa học từ đơn giản đến phức tạp Silica gel được dùng rất nhiều làm xúc tác trong tổng hợp hữu cơ hóa dầu, lọc nước,

Khi silica gel đã ngậm no nước, ta có thể tái sinh nó bằng cách sấy ở nhiệt độ khoảng 150 °C trong khoảng nửa giờ

Silica gel có hiệu quả hút ẩm và tính kinh tế cao so với các loại chất hút ẩm khác Nơi sản xuất silica gel nhiều nhất là Thượng Hải, Thanh Đảo của Trung Quốc [14]

2.4 Enzyme amylase

Alpha amylase ( - 1,4 glucan – glucanhydrolase Mã số 3.2.1.1) là enzyme thủy phân liên kết 1,4 glucozit ở giữa chuổi mạch polysaccharide Dưới tác dụng của enzyme α-amylase, tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất nhanh Enzyme α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác và độ bền cấu trúc tăng lên khi có mặt ion canxi.[2]

Sản phẩm thủy phân tinh bột của α-amylase bao gồm maltose, glucose, dextrin phân tử lượng thấp trong đó chủ yếu là dextrin có phân tử lượng thấp Có nhiều nguồn amylase bao gồm từ nấm mốc và vi khuẩn Trong đó α-amylase của vi khuẩn có nhiều

ưu điểm như hoạt động ở khoảng pH rộng (5 – 9, pH tối ưu là 6,5 – 7) và khả năng chịu nhiệt (nhiệt độ đường hoá có thể >75oC thậm chí có thể hoạt động ở 90 – 100o

C) [2]

2.4.1 Chế phẩm Termamyl

Chế phẩm Termamyl 120L, là chế phẩm của enzyme α-amylase chịu nhiệt được sản

xuất từ chủng vi sinh vật Bacillus licheniformis Chế phẩm này có dạng dung dịch lỏng

hoặc hơi sánh, màu nâu nhạt hoặc đậm tuỳ theo mẻ sản xuất Tuy nhiên độ đậm nhạt của màu không thể hiện hoạt tính của enzyme Các chất được sử dụng để ổn định enzyme bao gồm methionine, sodium chloride và sucrose Cụ thể một vài đặc tính của chế phẩm như sau

Bảng 2.1: Một số đặc điểm của chế phẩm Termamyl

Giới hạn dưới Giới hạn trên Đơn vị α- Amylase unit

2.4.2 Một số công trình nghiên cứu cố định enzyme

a) Nghiên cứu cố định α-amylase trên silica gel và alginate

Đã có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme α-amylase trong đó phổ biến nhất hiện nay là cố định trong alginate Trong nghiên cứu cố định α-amylase chịu nhiệt trong alginate [12] hiệu suất cố định thu được lên đến 65 % Khoảng pH hoạt động tối ưu của enzyme cố định dịch chuyển về khoảng pH kiềm so với enzynme tự do (7,5 so với 7),

nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzyme lên đến 60 – 70 oC Nồng độ cơ chất tối ưu 2 – 3% Cụ thể ảnh hưởng của nồng độ sodium alginate như sau:

Hình 2.5: Ảnh hưởng của nồng độ sodium-alginate lên hiệu suất cố định protein Nghiên cứu cho thấy ở nồng độ alginate tối ưu 4%, ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hoạt tính của enzyme tự do và enzyme cố định khác biệt không đáng kể Vì thế

có thể cho rằng chất mang hầu như không ảnh hưởng đến sự khuếch tán của cơ chất Kích thước của lỗ trên hạt gel là thích hợp với kích thước của cơ chất

Ngoài ra hiện nay có rất nhiều nghiên cứu đi theo hướng ứng dụng cố định trong alginate kết hợp với các chất mang khác để khắc phục các điểm yếu của alginate như khả năng chịu nhiệt kém đồng thời tăng các đặc tính mong muốn khác như tính thấm,

độ bền cơ học của chất mang Một trong các nghiên cứu đó là cố định enzyme amylase đơn và cố định kết hợp với glucoamylase trên các chất mang [8] Silica gel và DEAE-cellulose nhốt trong gel alginate là những chất mang hiệu quả nhất Các đặc tính ưa nước và kỵ nước của chất mang được tạo ra bằng cách phủ lớp vỏ áo polyethylimine hoặc silanization Tất cả các enzyme cố định trên chất mang ưa nước đều thể hiện hoạt tính cao nhất trong các thí nghiệm Kết quả rất có triển vọng khi hệ

α-số Km của enzyme cố định thấp hơn của enzyme tự do được lý giải do khả năng thu hút

cơ chất của chất mang (0.102 mg/ml đối với hydrophilic silica gel and 0.099 mg/ml for DEAE-cellulose bao gói trong gel alginate so với enzyme tự do 0.199 mg/ml) Khoảng nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định khoảng 50 – 60oC, pH tối ưu khoảng 5.0 – 5.5

Nồng độ sodium alginate (%)

H pr (%)

Enzyme đồng cố định trên silica gel và DEAE-cellulose nhốt trong alginate giữ được 92.3 và 88.9% hoạt tính sau 10 lần tái sử dụng

Hình 2.6: Sơ đồ xử lý enzyme và chất mang đối với chất mang ưa nước (A) và chất

mang kỵ nước (B)

Trong một nghiên cứu khác α-amylase chịu nhiệt từ chủng Bacillus subtilis được cố

địng trong gel alginate Ngoài ra các đặc tính của hạt gel còn được gia cố thêm bằng cách bổ sung thêm silica gel vào trong thành phần tạo gel Hạt gel tạo bởi sodium alginate 2% (w/v), CaCl2 5% (w/v) có thể tái sử dụng 20 lần và chỉ mất đi 30% hoạt tính ban đầu Thậm chí người ta còn thu được hiệu quả và độ ổn định cao hơn khi cho

Enzyme cố định trên silica gel

Enzyme cố định trên silica gel - polyethyleneimine

Enzyme cố định trên polyethylênimine – DEAE cellulose

Silica gel

Silica gel

silica gel 2% (w/v) vào hổn hợp tạo gel trước khi tạo gel với Ca2+ Với nồng độ enzyme cố định phù hợp những hạt gel alginate/silica cố định α-amylase giữ được tới 90% hoạt tính ban đầu sau 20 lần sử dụng và tạo ra hơn 10700 mg đường khử trong suốt quá trình kéo dài 160 giờ Tăng nhiệt độ phản ứng từ 50o

C đến 70oC dẫn đến làm tăng khả năng thủy phân tinh bột của enzyme cố định mà không gây ảnh hưởng đến độ bền của hạt gel

Hình 2.7: So sánh nồng độ đường khử theo thời gian ở 50oC và hiệu suất tái sử dụng

của α-amylase tự do và α-amylase cố định

Hình 2.8: Nồng độ đường khử theo thời gian phản ứng sử dụng α-amylase cố định ở

các nồng độ alginate khác nhau

Số mẻ phản ứng

Thời gian thủy phân (h)

Thời gian thủy phân (h)

Enzyme tự do Alginate Alginate/silica

Độ ổn định của alginate

Độ ổn định của alginate/silica

Hình 2.9: Thủy phân tinh bột bằng enzyme cố định trong alginate 2% bổ sung silica gel

với các hàm lượng khác nhau

Hình 2.10: Khả năng tái sử dụng của enzyme cố định trên alginate và trên

alginate/silica gel với các hàm lượng enzyme khác nhau

b) Cố định lipase trên celite [13]

Rhizopus japonicus lipase được cố định bằng phương pháp hấp phụ đơn giản trên

celite Phương pháp hấp phụ thực hiện theo Adlercreutz and Mattiasson (1993) như sau 1 g lipase được hoà tan trong 20 ml nước tinh khiết sau đó trộn với 5 g celite và khuấy trong 1 giờ và đem đi đông khô Enzyme cố định được bảo quản ở 4o

C

Thời gian thủy phân (h)

Số mẻ

Kết quả cho thấy lipase (1g/20ml nước cất) hấp phụ tốt trên 5g celite Lượng enzyme không hấp phụ khoảng 64 % Hiệu suất cố định enzyme khoảng 36 % tương ứng với hiệu suất hoạt tính thủy phân 18,9 % Ngoài ra một điều đặc biệt là enzyme cố định còn có thêm hoạt tính ester hoá so với enzyme tự do có rất ít hoặc không có hoạt tính này

Bảng 2.2 Kết quả nghiên cứu cố định lipase trên celite [13]

Enzyme tự do Enzyme cố định

Nghiên cứu này cho thấy triển vọng cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ đơn thuần trên celite (hiệu suất hoạt tính > 10%)

Đề tài chúng tôi thực hiện cố định enzyme Termamyl (alpha amylase) trên vật liệu celite và kết hợp với alginate

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu – hóa chất

Chế phẩm enzyme Termamyl (Novo – Đan mạch)

Silica gel (200–425 mesh, 150 Å)

Celite R-646, 8/14 mesh

Sodium alginate (Kanto – Nhật)

Và một số hoá chất để chuẩn độ đường khử bằng phương pháp DNS và chuẩn độ protein bằng phương pháp Bradford

a Phương pháp xác định hoạt tính enzyme amylase

Hoạt tính của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme tạo ra lượng đường khử tương ứng với 1 mg glucose từ tinh bột trong thời gian 1 phút ở 50o

C trong dung dịch đệm acetate 0.1M (pH 5.5) với nồng độ cơ chất tinh bột là 3%

H =

l t

V C



 (1)

Với :

H: Hoạt tính của enzyme V: thể tích dung dịch thuỷ phân

t: Thởi gian phản ứng l: Lượng enzyme sử dụng (ml hoặc g)

b Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford[7]

Dung dịch màu bao gồm:

Coomassie blue G (Serva No 35050) 40 mg

Thêm nước cất đến 400 ml

Dung dịch BSA (Bovine serum albumin) 100 mg/ml

Xây dựng đường cong chuẩn biểu diển nồng độ protein chuẩn 1.8 ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5 – 40 mg BSA trong nước cất Thêm 0.6 ml dung dịch màu, lắc đều 5 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng Đo độ hấp phụ ở bước sóng 595

nm Mẫu trắng là nước cất không chứa protein

Mẫu cần chuẩn độ tiến hành tương tự

Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein Từ đó suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a (mg/ml)

Lượng protein (C) có trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu được tính theo công thức:

C = an (mg) /1(g hoặc ml) Tổng lượng protein trong mẫu (M) (2)

M = anm (mg) với

a: hàm lượng protein theo đường chuẩn (mg/ml)

n: hệ số pha loãng

m: khối lượng hoặc thể tích nguyên liệu (g hoặc ml)

c Xác định đường khử bằng phương pháp DNS [7]

Dung dịch thuốc thử DNS được pha như sau:

- Hoà tan 45 g sodium potassium tartrate trong 75 mL H2O

- Dung dịch 3,5-DNS: hòa tan 1.5g DNS trong 30 ml NaOH 2M

- Dung dịch NaOH 2M: Hoà tan 80 g NaOH trong một lit nước

Trộn hai dung dịch (1) và (2) thêm nước đến thể tích 150 ml ta được dung dịch thuốc thử

Dung dịch đường chuẩn pha 25 g Glucose trong 100ml nước

Dựng đường chuẩn của đường khử bằng cách cho từ 0 – 3 ml dung dịch đường Glucose ở trên vào các ống nghiệm Thêm nước cất vào mỗi ống sao cho đủ 3ml Thêm

1 ml thuốc thử DNS Đun cách thủy trong 5 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng và đo

độ hấp phụ ở 540 nm

Mẫu cần chuẩn độ tiến hành tương tự

Từ đường chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu đường Từ đó suy

ra hàm lượng đường khử của nguyên liệu là a (mg/ml)

Lượng đường khử (C) có trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu được tính theo công thức:

C =

m

n

x a

mg glucose/1(g hoặc ml) (3)

a: hàm lượng đường khử theo đường chuẩn (mg/ml)

n: hệ số pha loãng

m: khối lượng hoặc thể tích nguyên liệu lấy phân tích (g hoặc ml)

3.2.2 Khảo sát quá trình cố định enzyme

a Cố định enzyme trên chất mang vô cơ

Cân 1 g chất mang celite hoặc silica gel hoạt hoá bằng cách đun cách thủy với HNO3 5% trong vòng 1.5 giờ Sau đó chất mang được rửa bằng nước cất đến khi sạch hết acid và sấy khô

Enzyme được cố định bằng phương pháp hấp phụ đơn thuần lên chất mang Đối với celite lần lượt sử dụng các nồng độ enzyme khác nhau 3, 4, 5, 6 ml enzyme pha trong nước cất thành 15 ml Đối với silica gel sử dụng các nồng độ 4, 5, 6, 7, 8 ml enzyme pha thành 10 ml với nước cất Chất mang được ủ với dung dịch enzyme trong vòng 3 giờ ở 4oC Sau đó tiến hành rửa với nước cất Nước rửa thu được được định mức thành

100 ml đối với celite và 50 ml đối với silica gel để xác định hàm lượng protein không

bị hấp phụ

Hình 3.1: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ

b Bọc enzyme cố định trên celite và silica gel với alginate

Enzyme cố định bằng phương pháp hấp phụ ở trên được trộn với dung dịch sodium alginate Hỗn hợp này sau đó được nhỏ vào dung dịch CaCl2 để tạo gel Rửa hạt gel với nước cất và bảo quản trong nước cất ở 4oC

Chất mang

Ngâm, 1h, 90oC HNO3 5%

Hìmh 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate

3.2.3 Phương pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định

Phản ứng gián đoạn theo mẻ:

Thuỷ phân 50 ml tinh bột 3% trong erlen 100 ml trong 8 giờ, tốc độ lắc 135 rpm, ở

50oC Hoạt tính của enzyme được xác định sau 30 phút phản ứng

Phản ứng liên tục:

Hệ thống cột phản ứng là một mô hình thiết bị phản ứng sinh học cho phản ứng liên tục Ta sử dụng hệ thống này nhằm tính toán khả năng tái sử dụng và thời gian phản ứng của enzyme và từ đó nâng lên mô hình lớn hơn để áp dụng thực tiễn

Hệ thống gồm: cột phản ứng, bể điều nhiệt và bơm định lượng

Hình 3.3: Hệ thống cột phản ứng Nguyên tắc hoạt động: Enzyme được nhồi trong cột, cơ chất được bơm định lượng

qua cột, bơm từ dưới lên, cột phản ứng được điều chỉnh nhiệt độ bằng bể ổn nhiệt, sản

phẩm được lấy ra ở đầu trên của cột

3.2.4 Phương pháp tính toán

Cách tính hiệu suất cố định protein

Từ đường chuẩn ta xác định được hàm lượng protein trong chế phẩm enzyme tự do

ban đầu và hàm lượng protein trong dung dịch CaCl2 không được cố định

Tổng lượng protein ban đầu đem cố định:

 protein bđ = (Hàm lượng protein bđ) * m (4) Trong đó m : là lượng chế phẩm enzyme (ml hoặc mg)

Tổng lượng protein còn lại không được cố định:

 protein còn lại = ( hàm lượng protein trong CaCl2) * n *V (5)

Trong đó n : hệ số pha loãng

V: thể tích dung dịch sau khi rửa

Tổng lượng protein cố định được:

 protein cđ =  protein bđ -  protein còn lại (6)

Hiệu suất cố định protein:

HS cđ protein (%) =  protein cđ /  protein bđ (7)

Hiệu suất hoạt tính của enzyme

Hoạt độ enzyme :

Hoạt độ enzyme = UI / ml chế phẩm enzyme (8)

Tổng đơn vị hoạt độ enzyme ban đầu được sử dụng cho cố định :

 hoạt độ enzyme bđ = Hoạt độ enzyme * m (ml) enzyme bđ (9)

Tổng đơn vị hoạt tính enzyme cố định được :

 hoạt độ enzyme cđ = lượng đường khử sinh ra khi thủy phân tinh bột bằng

enzyme cố định trong 1 phút

Hiệu suất cố định enzyme

HS cđ enzyme (%) =  hoạt độ enzyme cđ /  hoạt độ enzyme bđ (10)

3.2.5 Anova - Phân tích phương sai một nhân tố

Mức ý nghĩa trong sự khác biệt của mẫu (Ho không có sai khác, H1 sai khác) được

xác định bằng phương pháp phân tích phương sai Quá trình tính toán thực hiện trong

excel như sau:

 Nếu trong menu Tools chưa có mục Data Analysis… thì tiến hành cài Analysis

ToolPak như sau: Tools \ Add-Ins \ chọn Analysis ToolPak\ OK

 Chọn Tools\ Data Analysis

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4.1 Khảo sát chế phẩm enzyme Termamyl

4.1.1 Khảo sát hàm lượng protein của chế phẩm enzyme Termamyl

Hình 4.1: Đồ thị tương quan giữa OD và nồng độ albumin

Theo đồ thị ta có phương trình đường chuẩn y = 0,0645x + 0,0444

Kết quả: Hàm lượng protein của chế phẩm protein Termamyl 120L là 104 mg/ml

4.1.2 Khảo sát hoạt tính của chế phẩm enzyme Termamyl

Hình 4.2 Đồ thị tương quan giữa OD và hàm lượng đường khử