Thực hiện theo sơ đồ hình 3.2 với các tỉ lệ silica gel nhƣ sau 2, 3, 4, 5, 6 % (w/v) so với thể tích alginate cố định 4 ml 2%. Silica gel đã hấp phụ enzyme với tỉ lệ 5 ml enzyme/1g chất mang ở thí nghiệm trên.
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt tính của enzyme cđ si – alg
Tỉ lệ silica gel 2 3 4 5 6
∑ hoạt độ enzyme cđ
(UI) 6 7.4 8.72 8.94 9.2
34
Hình 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ của enzyme cđ si – alg
Nhận xét: Ta thấy khi tăng hàm lƣợng silica gel thì tổng hoạt tính cố định đƣợc cũng tăng dần. Tuy nhiên từ hàm lƣợng 4 % đến 6 % thì hoạt tính tăng không đáng kể. Do vậy ta chọn tỉ lệ silica gel là 4%.
4.5.2 Khảo sát nồng độ alginate
Dùng 4 ml dung dịch sodium alginate tại các nồng độ khác nhau để cố định 0.16 g silica gel đã hấp phụ enzyme ở trêntheo sơ đồ hình 3.2.
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg
Nồng độ dd alginate (%w/v) 2 3 4 5 6
∑ hoạt độ enzyme cđ (UI) 8 8.6 9 9 8.9
(Số liệu chi tiết xem phần phụ lục 29 trang 60)
Nhận xét: Khi tăng lƣợng nồng độ sodium alginate, tổng hoạt độ cố định cũng tăng. Do khi nồng độ sodium alginate tăng gel tạo thành có độ bền cao hơn bao bọc các hạt silica gel tạo nên cấu trúc bền vững hơn. Tuy nhiên khi đạt đến tỉ lệ 4% thì tổng hoạt độ cố định đƣợc không tăng nữa. Ở nồng độ này độ nhớt của dung dịch sodium alginate đã đạt mức khá cao. Quá trình tạo gel khó khăn hơn. Tổng hoạt độ thu đƣợc
35
không tăng lên mà còn có xu hƣớng giảm tuy không đáng kể do hao hụt trong thao tác. Tổng hoạt độ cố định thu đƣợc cao nhất khi bao gói bằng dung dịch alginate có nồng độ 4% (w/v).
Sau khi khảo sát enzyme cố định trên silica gel kết hợp alginate, ta chọn các thông số cố định tối ƣu nhƣ sau. Thể tích enzyme:silica gel là 5 ml, tỉ lệ silica gel (w/v) là 4%, nồng độ sodium alginate tối ƣu ở 4%, ta tính đƣợc hiệu suất cố định là 44% (theo công thức 10 mục 3.2.4) (xem phụ lục 10).
Khảo sát độ ổn định của enzyme cố định
Chế phẩm α-amylase chịu nhiệt Termamyl đƣợc cố định theo bốn cách khác nhau: Cố định bằng hấp phụ lên celite, silica gel, kết hợp hấp phụ lên celite, silica gel và bọc trong gel alginate. Qua các thí nghiệm trên ta thấy enzyme cố định bằng phƣơng pháp sử dụng kết hợp chất mang vô cơ và hữu cơ có hiệu suất cố định hoạt độ cao hơn phƣơng pháp hấp phụ đơn thuần lên chất mang vô cơ: 60 % khi cố định trên celite kết hợp với alginate so với 22% khi cố định trên celite, 44% khi cố định trên silica gel kết hợp với alginate so với và 22,7% đối với silica gel. (xem các mục 4.2, 4.3, 4.4, 4.5). Kết quả thu đƣợc khá bất ngờ vì enzyme hấp phụ lên chất mang vô cơ sau đó đƣợc bọc lại bằng gel alginate lại có hiệu suất hoạt tính cao hơn khi hấp phụ đơn thuần lên chất mang vô cơ. Điều này có thể đƣợc lý giải nhƣ sau: Chất mang vô cơ thƣờng ở dạng bột mịn, trong quá trình thủy phân dù có chế độ lắc enzyme cố định vẫn bị lắng một phần xuống đáy bình phản ứng. Do vậy sự phân tán và tiếp xúc của enzyme với cơ chất bị hạn chế. Trong khi đó nồng độ sản phẩm cũng có ảnh hƣởng ức chế đối với phản ứng của enzyme. Đây cũng là một nhƣợc điểm của chất mang vô cơ nhƣ đã đề cập ở trên. Sử dụng enzyme cố định trên chất mang vô cơ đòi hỏi quá trình vận hành khuấy đảo phức tạp, enzyme dể làm nghẽn mạch đồng thời khó tách enzyme ra khỏi sản phẩm phản ứng. Bọc enzyme đã hấp phụ trên chất mang vô cơ bằng gel alginate giúp phân tán đều enzyme trong hạt gel. Hạt gel có khối lƣợng riêng nhỏ kích thƣớc lớn dễ dàng đƣợc khuấy đảo và tách khỏi sản phẩm. Qua đó ta thấy enzyme cố định trên chất mang vô cơ kết hợp với chất mang hữu cơ có nhiều ƣu điểm vƣợt trội so với cố định đơn thuần trên chất mang vô cơ và có thể có khả năng ứng dụng trong thực tế sản xuất.
36
Do vậy ta tiếp tục khảo sát độ ổn định của enzyme cố định trên chất mang vô cơ kết hợp với chất mang hữu cơ.
Chế độ khảo sát: Lƣợng enzyme cố định trong 10 ml alginate thủy phân 50ml tinh bột 3% ở 50oC, pH 5.5 trong 8 tiếng. Hoạt tính enzyme xác định sau khi thủy phân 30 phút.
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme stt Hoạt độ so với lần đầu
(%) stt
Hoạt độ so với lần đầu
(%) stt
Hoạt độ so với lần đầu (%) 1 100 11 114 21 101 2 105 12 111 22 99 3 101 13 111 23 96 4 95 14 121 24 93 5 101 15 120 29 92 6 104 16 118 32 84 7 112 17 122 36 71 8 120 18 122 40 64 9 121 19 114 10 114 20 101
(số liệu chi tiết xem phụ lục bảng 30 trang 60)
37
Kết quả: Enzyme cố định trên celite kết hợp với alginate mất hoạt tính nhanh chóng sau hai lần sử dụng. Mặt khác enzyme cố định bằng phƣơng pháp này cũng không thể bảo quản lâu dù trong nƣớc cất hay trong dung dịch đệm. Enzyme cố định trên silica gel kết hợp với alginate có độ ổn định rất cao trong điều kiện phản ứng trên. Sau 30 lần tái sử dụng enzyme vẫn giữ đƣợc 80% hoạt tính. Sau 40 lần sử dụng enzyme còn 60 % hoạt tính nhƣng hạt gel có dấu hiệu bị mềm dể bị bóp vụn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.9: So sánh enzyme cố định cel – alg với enzyme cố định si – alg.
Phƣơng pháp cố định Celite - alginate Silica gel – alginate
Hiệu suất cố định 60% 44%
Độ ổn định Mất hoạt tính nhanh chóng Giữ đƣợc 80% hoạt tính sau 30 lần tái sử dụng Do vậy ta tiếp tục khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến enzyme cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ lên silica gel kết hợp bao gói bằng alginate.
4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg
Ta tiếp tục khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enzyme cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ lên silica gel kết hợp với alginate.
Bảng 4.10: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzyme cđ si – alg Nhiệt độ (oC) 40 50 60 70 80 90 100 Nồng độ đƣờng khử (mg/ml) 2.87 5.78 8.38 9.68 14.45 14.52 8.87
38
Hình 4.9: Ảnh hƣởng của nhiệt độ pƣ lên nồng độ đƣờng khử tạo thành
Nhận xét: Theo đồ thị ta thấy nhiệt độ hoạt động tối ƣu của enzyme nằm trong khoảng 80 – 90oC tức là cao hơn so với enzyme tự do. Kết quả này có thể do enzyme đƣợc hấp phụ trên silica gel sau đó đƣợc bọc trong alginate làm tăng khả năng chịu nhiệt của enzyme.
Đối với điều kiện nhiệt độ khảo sát cao từ 60 – 90oC hoạt tính enzyme tăng mà không thấy ảnh hƣởng đến cấu trúc bên ngoài của hạt gel. Tuy nhiên cần có thêm các khảo sát về khả năng tái sử dụng enzyme ở các nhiệt độ này.
4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cố định si – alg
Bảng 4.11: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của pH lên hoạt độ của enzyme cđ si - alg
pH 4 5 5.5 6 7
Nồng độ đƣờng khử (mg/ml) 3.65 17.22 22.43 20.96 17.84 (số liệu cụ thể xem phụ lục bảng 32 trang 62)
39
Hình 4.10: Ảnh hƣởng của pH pƣ lên nồng độ đƣờng khử tạo thành
Nhận xét: Theo đồ thị ta thấy enzyme cố định hoạt động tối ƣu ở pH khoảng 5,5. Hoạt tính của enzyme cố định tại pH 4 rất thấp sau đó tăng nhanh khi pH tăng và đạt đỉnh khi pH khoảng 5.5. Trong khoảng pH 6 – 7 hoạt tính của enzyme giảm nhƣng vẫn ở mức cao. Ta thấy enzyme cố định có khoảng pH hoạt động dịch chuyển qua khoảng acid so với enzyme tự do. Tuy nhiên hoạt tính enzyme cố định giảm nhanh khi pH giảm từ pH tối ƣu xuống khoảng pH thấp hơn.
4.8 Khảo sát khả năng ứng dụng của enzyme cố định si – alg 4.8.1 Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn cơ chất
40
(số liệu cụ thể xem phụ lục bảng 33 trang 62)
Hình 4.11: Khả năng thủy phân các loại tinh bột khác nhau của enzyme cố định si - alg
Nhận xét: Qua đồ thị hình 4.8 cho thấy enzyme cố định đạt hiệu quả thủy phân cao nhất đối với tinh bột khoai tây và thấp nhất đối với bột gạo. Tuy nhiên sự chênh lệch không nhiều. Khả năng thủy phân tinh bột bắp và thủy phân tinh bột sắn là gần nhƣ nhau. Kết quả này liên quan đến cấu trúc thành phần amylose và amylopectin trong phân tử các loại tinh bột. Tinh bột khoai tây chứa tỉ lệ thành phần amylose lớn nhất so với các loại tinh bột kể trên nhƣ tinh bột mì, tinh bột bắp. Amylose có cấu trúc mạch thẳng đơn giản gồm các liên kết α-1,4 và một phần rất nhỏ liên kết α-1,6 (khoảng 0,5%). Trong khi đó các loại tinh bột chứa thành phần amylopectin cao sẽ khó thủy phân hơn do cấu trúc mạch nhánh chằng chịt phức tạp của phân tử amylopectin [3]. Riêng bột gạo do không thể mua đƣợc dạng tinh bột nên ta sử dụng dạng bột gạo xay nhỏ vốn bao gồm nhiều thành phần khác ngoài thành phần tinh bột. Cấu trúc của hạt tinh bột do đó chƣa đƣợc giải phóng hoàn toàn dẫn đến hiệu quả thủy phân kém hơn so với các loại tinh bột đã đƣợc xử lý loại bỏ các thành phần không phải là tinh bột.
41
4.8.2 Khảo sát phản ứng liên tục
Phản ứng đƣợc thực hiện trong hệ thống chạy cột (bình phản ứng dạng ống). Enzyme nhồi trong cột, cơ chất chạy từ đƣơi lên trên. Độ dài cột phản ứng 20 cm, đƣờng kính 1cm. Nồng độ cơ chất tinh bột là 1%. Khảo sát các vận tốc chạy cơ chất sử dụng bơm nhu động. Vận tốc thấp nhất có thể khảo sát là 3,5 vòng/phút do giới hạn của thiết bị.
(số liệu cụ thể xem phụ lục bảng 34 trang 62)
Hình 4.12: Khảo sát ảnh hƣởng của vận tốc dòng cơ chất lên khả năng xúc tác của enzyme cố định si – alg
Nhận xét: Vận tốc dung dịch cơ chất càng cao thì nồng độ đƣờng khử tạo thành càng thấp do thời gian enzyme tiếp xúc với cơ chất giảm. Ở vận tốc bơm 3,5v/p, nồng độ đƣờng khử tạo thành là cao nhất tƣơng ứng khoảng 3mg/ml. Ta tiếp tục khảo sát khả năng phản ứng của enzyme, độ bền của enzyme trong điều kiện vận tốc cơ chất 3,5 v/p.
42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(số liệu cụ thể xem phụ lục bảng 35 trang 63)
Hình 4.13: Khảo sát khả năng phản ứng theo thời gian sử dụng enzyme cố định si – alg
Nhận xét: Hoạt độ của enzyme giảm nhanh theo thời gian xuống dƣới 50% sau khoảng 4 giờ. Kết quả này là khá mâu thuẫn với thí nghiệm khảo sát khả năng tái sử dụng của enzyme trong phản ứng theo mẻ trong đó enzyme vẫn giữ đƣợc 60% hoạt độ sau 40 lần tái sử dụng với tốc độ lắc 135 rpm. Có thể giải thích điều này do phản ứng liên tục trong cột, áp lực dòng chảy qua liên tục sẽ bào mòn và làm rửa trôi enzyme. Giai đoạn đầu hoạt độ của enzyme giảm nhanh chóng do lớp enzyme phía ngoài bị mất đi. Sau đó hoạt độ tiếp tục giảm nhƣng với tốc độ chậm hơn. Tuy nhiên trong phản ứng theo mẻ với tốc độ lắc 135 rpm thì tác động của dòng cơ chất đến hạt gel cũng không nhỏ. Vì vậy ta có thể kết luận enzyme cố định trên silica gel kết hợp với alginate không thích hợp với bình phản ứng liên tục dạng cột. Nguyên nhân có thể do khi nhồi cột, các hạt gel đƣợc nhồi chặt với nhau làm giảm bề mặt tiếp xúc với cơ chất. Chỉ còn những khe nhỏ cho cơ chất chạy qua. Những khe nhỏ này trở thành con đƣờng lƣu chuyển cố định của dòng cơ chất và không có sự lƣu chuyển trên bề mặt hạt gel. Những bề mặt tiếp xúc với dòng chảy của cơ chất nhanh chóng bị bào mòn dẫn đến khả năng xúc tác phản ứng của cột enzyme cố định giảm nhanh chóng. Tuy nhiên kết quả vẫn khá khả
43
quan khi từ phút thứ 80 đến phút thứ 240 hoạt độ của cột enzyme cố định khá ổn định, giảm không đáng kể. Thiết nghĩ để ứng dụng enzyme cố định theo phƣơng pháp này có hiệu quả ta nên sử dụng bình phản ứng liên tục dạng khuấy trộn. Cơ chất có thể đƣợc lấy ra khi đã đạt đƣợc nồng độ yêu cầu hoặc có thể đƣợc tuần hoàn trở lại bình phản ứng.
44
CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN
Từ kết quả thí nghiệm, ta rút ra đƣợc một số kết luận nhƣ sau:
Chế phẩm enzyme Termamyl đƣợc cố định hiệu quả trên chất mang silica gel kết hợp với alginate với hiệu suất cố định là 44%. Thành phần cố định nhƣ sau: - Tỉ lệ enzyme/1 g silica gel là 5ml
- Tỉ lệ silica gel so với thể tích alginate là 3%. - Nồng độ sodium alginate thích hợp là 3.5%
Khả năng tái sử dụng: giữ đƣợc 60 % hoạt tính sau 40 lần tái sử dụng.
Khoảng nhiệt độ hoạt động tối ƣu: 80 – 90 oC
pH hoạt động tối ƣu khoảng 5.5
Khả năng xúc tác phản ứng tốt nhất với nguồn cơ chất là tinh bột khoai tây.
Ứ dụng trong điều kiện phản ứng liên tục:
- Khi vận tốc dòng cơ chất tăng thì khả năng xúc tác của enzyme cố định giảm. Nồng độ đƣờng khử tạo thành cao nhất là 3 mg/ml với vận tốc dòng cơ chất là 3,5 v/p.
- Enzyme cố định giảm 50 % hoạt tính sau 4 giờ chạy cơ chất. Kiến nghị:
Trong luận văn này, do hạn chế về thời gian và thiết bị nên chỉ khảo sát khả năng tái sử dụng enzyme trong điều kiện tƣơng đối ôn hoà. Để có thể ứng dụng hiệu quả vào thực tế sản xuất cần có thêm những khảo sát khả tái sử dụng enzyme cố định silica – alginate ở những khoảng nhiệt độ cao hơn.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
[1] Nguyễn Đức Lƣợng. Công nghệ enzyme. NXB Đại Học Quốc Gia tp Hồ Chí Minh. 98 – 127.
[2] Nguyễn Đức Lƣợng. Công nghệ vi sinh tập 2 vi sinh vật học công nghiệp. 198, 200. [3]Trần Thị Thu Trà. Công nghệ bảo quản và chế biến lương thực tập 1 bảo quản lương thực. nxb Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh (2007) 39 – 43.
[4] Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo. Khảo sát quá trình cố định enzyme α-Amylase (Termamyl) bởi chất mang CMC – Alginate. Tạp chí phát triển KH&CN tập 10, số 12,2007
Tài liệu tiếng anh
[5] Linqiu Cao. Carrier-bound Immobilized Enzymes. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA,Weinheim.(2005)
[6] R.H. Wijffels, Immobilized cells Basics and Applications, Elsevier Science B.V(1996) 19 – 28
[7] S. Harisha, PH.D. Biotechnology procedures and experiment handbook. Infinity science press LLC. (2007) 61, 62, 69.
[8] Daewon Park, Seungjoo Haam, Kyongho Jang, Ik-Sung Ahn, Woo-Sik Kim.
Immobilization of starch-converting enzymes on surface-modified carriers using single and co-immobilized systems: properties and application to starch hydrolysis. Process Biochemistry 40 (2005) 53–61 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
[9] Joonmok Shim, Gha-Young Kim, Kyeong-Ho Yeon, Seung-Hee Cho, Jung-Je Woo and Seung-Hyeon Moon. Degradation of azo dye by an electroenzymatic method using horseradish peroxidase immobilized on porous support. Korean J. Chem. Eng., 24(1), 72-78 (2007)
[10] Zoe Konsoula, Maria Liakopoulou-Kyriakides. Starch hydrolysis by the action of an entrapped in alginate capsules a-amylase from Bacillus subtilis. Process Biochemistry 41 (2006) 343–349
46
[11] Zoe Konsoula, Maria Liakopoulou-Kyriakides. Thermostable α-amylase production by Bacillus subtilis entrapped in calcium alginate gel capsules. Enzyme and Microbial Technology 39 (2006) 690–696.
[12] Aliya Riaz, Shah Ali Ul Qader, Abida Anwar and Samina Iqbal. Immobilization of a Thermostable α-amylase on Calcium Alginate Beads from Bacillus Subtilis KIBGE-HAR, Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 3(3): 2883-2887, 2009(một số nghiên cứu cố định amylase)
[13] Sunil Kumar Khare, Mitsutoshi Nakajima. Immobilization of Rhizopus japonicus lipase on celite and its application for enrichment of docosahexaenoic acid in soybean oil. Food Chemistry 68 (2000) 153±157
47
PHỤ LỤC
Kết quả tƣơng quan giữa OD và nồng độ albumin – nồng độ protein của chế phẩm Termamyl
Bảng 1: Kết quả tƣơng quan giữa OD và nồng độ albumin