3.2.1 Phƣơng pháp chung
a. Phƣơng pháp xác định hoạt tính enzyme amylase
Hoạt tính của enzyme đƣợc định nghĩa là lƣợng enzyme tạo ra lƣợng đƣờng khử tƣơng ứng với 1 mg glucose từ tinh bột trong thời gian 1 phút ở 50o
C trong dung dịch đệm acetate 0.1M (pH 5.5) với nồng độ cơ chất tinh bột là 3%.
H = l t V C (1) Với :
H: Hoạt tính của enzyme V: thể tích dung dịch thuỷ phân t: Thởi gian phản ứng l: Lƣợng enzyme sử dụng (ml hoặc g)
21
b. Xác định hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford[7]
Dung dịch màu bao gồm:
Coomassie blue G (Serva No 35050) 40 mg
Ethanol 20 ml
H3PO4 85% 40 ml
Thêm nƣớc cất đến 400 ml
Dung dịch BSA (Bovine serum albumin) 100 mg/ml
Xây dựng đƣờng cong chuẩn biểu diển nồng độ protein chuẩn 1.8 ml dung dịch protein chuẩn có chứa từ 5 – 40 mg BSA trong nƣớc cất. Thêm 0.6 ml dung dịch màu, lắc đều 5 phút cho phản ứng xảy ra ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp phụ ở bƣớc sóng 595 nm. Mẫu trắng là nƣớc cất không chứa protein.
Mẫu cần chuẩn độ tiến hành tƣơng tự.
Từ đƣờng chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đó suy ra hàm lƣợng protein của nguyên liệu là a (mg/ml).
Lƣợng protein (C) có trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu đƣợc tính theo công thức: C = an (mg) /1(g hoặc ml)
Tổng lƣợng protein trong mẫu (M) (2) M = anm (mg)
với
a: hàm lƣợng protein theo đƣờng chuẩn (mg/ml) n: hệ số pha loãng
m: khối lƣợng hoặc thể tích nguyên liệu (g hoặc ml)
c. Xác định đƣờng khử bằng phƣơng pháp DNS [7]
Dung dịch thuốc thử DNS đƣợc pha nhƣ sau:
- Hoà tan 45 g sodium potassium tartrate trong 75 mL H2O. - Dung dịch 3,5-DNS: hòa tan 1.5g DNS trong 30 ml NaOH 2M - Dung dịch NaOH 2M: Hoà tan 80 g NaOH trong một lit nƣớc
22
Trộn hai dung dịch (1) và (2) thêm nƣớc đến thể tích 150 ml ta đƣợc dung dịch thuốc thử.
Dung dịch đƣờng chuẩn pha 25 g Glucose trong 100ml nƣớc.
Dựng đƣờng chuẩn của đƣờng khử bằng cách cho từ 0 – 3 ml dung dịch đƣờng Glucose ở trên vào các ống nghiệm. Thêm nƣớc cất vào mỗi ống sao cho đủ 3ml. Thêm 1 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 5 phút. Để nguội đến nhiệt độ phòng và đo độ hấp phụ ở 540 nm.
Mẫu cần chuẩn độ tiến hành tƣơng tự.
Từ đƣờng chuẩn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu đƣờng. Từ đó suy ra hàm lƣợng đƣờng khử của nguyên liệu là a (mg/ml). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lƣợng đƣờng khử (C) có trong 1g hoặc 1ml nguyên liệu đƣợc tính theo công thức: C = m n x a mg glucose/1(g hoặc ml) (3) a: hàm lƣợng đƣờng khử theo đƣờng chuẩn (mg/ml) n: hệ số pha loãng
m: khối lƣợng hoặc thể tích nguyên liệu lấy phân tích (g hoặc ml)
3.2.2 Khảo sát quá trình cố định enzyme
a. Cố định enzyme trên chất mang vô cơ
Cân 1 g chất mang celite hoặc silica gel hoạt hoá bằng cách đun cách thủy với HNO3 5% trong vòng 1.5 giờ. Sau đó chất mang đƣợc rửa bằng nƣớc cất đến khi sạch hết acid và sấy khô.
Enzyme đƣợc cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ đơn thuần lên chất mang. Đối với celite lần lƣợt sử dụng các nồng độ enzyme khác nhau 3, 4, 5, 6 ml enzyme pha trong nƣớc cất thành 15 ml. Đối với silica gel sử dụng các nồng độ 4, 5, 6, 7, 8 ml enzyme pha thành 10 ml với nƣớc cất. Chất mang đƣợc ủ với dung dịch enzyme trong vòng 3 giờ ở 4oC. Sau đó tiến hành rửa với nƣớc cất. Nƣớc rửa thu đƣợc đƣợc định mức thành 100 ml đối với celite và 50 ml đối với silica gel để xác định hàm lƣợng protein không bị hấp phụ.
23
Hình 3.1: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ
b. Bọc enzyme cố định trên celite và silica gel với alginate
Enzyme cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ ở trên đƣợc trộn với dung dịch sodium alginate. Hỗn hợp này sau đó đƣợc nhỏ vào dung dịch CaCl2 để tạo gel. Rửa hạt gel với nƣớc cất và bảo quản trong nƣớc cất ở 4oC.
Chất mang Ngâm, 1h, 90oC HNO3 5% Nƣớc cất DD Enzyme Nƣớc cất Lọc rửa Ủ , 3h, 4o C Lọc rửa Nƣớc rửa 50ml Enzyme cố định
24
Hìmh 3.2: Sơ đồ tiến hành cố định enzyme trên chất mang vô cơ kết hợp alginate
3.2.3 Phƣơng pháp khảo sát khả năng sử dụng của enzyme cố định
Phản ứng gián đoạn theo mẻ:
Thuỷ phân 50 ml tinh bột 3% trong erlen 100 ml trong 8 giờ, tốc độ lắc 135 rpm, ở 50oC. Hoạt tính của enzyme đƣợc xác định sau 30 phút phản ứng.
Phản ứng liên tục:
Hệ thống cột phản ứng là một mô hình thiết bị phản ứng sinh học cho phản ứng liên tục. Ta sử dụng hệ thống này nhằm tính toán khả năng tái sử dụng và thời gian phản ứng của enzyme và từ đó nâng lên mô hình lớn hơn để áp dụng thực tiễn.
Hệ thống gồm: cột phản ứng, bể điều nhiệt và bơm định lƣợng Dung dịch Sodium
alginate
Trộn
Dung dịch CaCl2 Tạo gel
Rửa Nƣớc cất
Enzyme cố định Enzyme cố định trên
25
Hình 3.3: Hệ thống cột phản ứng
Nguyên tắc hoạt động: Enzyme đƣợc nhồi trong cột, cơ chất đƣợc bơm định lƣợng qua cột, bơm từ dƣới lên, cột phản ứng đƣợc điều chỉnh nhiệt độ bằng bể ổn nhiệt, sản phẩm đƣợc lấy ra ở đầu trên của cột.
3.2.4 Phƣơng pháp tính toán
Cách tính hiệu suất cố định protein
Từ đƣờng chuẩn ta xác định đƣợc hàm lƣợng protein trong chế phẩm enzyme tự do ban đầu và hàm lƣợng protein trong dung dịch CaCl2 không đƣợc cố định. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tổng lƣợng protein ban đầu đem cố định:
protein bđ = (Hàm lƣợng protein bđ) * m (4) Trong đó m : là lƣợng chế phẩm enzyme (ml hoặc mg)
Tổng lƣợng protein còn lại không đƣợc cố định:
protein còn lại = ( hàm lƣợng protein trong CaCl2) * n *V (5) Trong đó n : hệ số pha loãng
V: thể tích dung dịch sau khi rửa
Tổng lƣợng protein cố định đƣợc:
26
Hiệu suất cố định protein:
HS cđ protein (%) = protein cđ / protein bđ (7) Hiệu suất hoạt tính của enzyme
Hoạt độ enzyme :
Hoạt độ enzyme = UI / ml chế phẩm enzyme (8)
Tổng đơn vị hoạt độ enzyme ban đầu đƣợc sử dụng cho cố định :
hoạt độ enzyme bđ = Hoạt độ enzyme * m (ml) enzyme bđ (9)
Tổng đơn vị hoạt tính enzyme cố định đƣợc :
hoạt độ enzyme cđ = lƣợng đƣờng khử sinh ra khi thủy phân tinh bột bằng enzyme cố định trong 1 phút.
Hiệu suất cố định enzyme
HS cđ enzyme (%) = hoạt độ enzyme cđ / hoạt độ enzyme bđ. (10)
3.2.5 Anova - Phân tích phƣơng sai một nhân tố
Mức ý nghĩa trong sự khác biệt của mẫu (Ho không có sai khác, H1 sai khác) đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai. Quá trình tính toán thực hiện trong excel nhƣ sau:
Nếu trong menu Tools chƣa có mục Data Analysis… thì tiến hành cài Analysis ToolPak nhƣ sau: Tools \ Add-Ins \ chọn Analysis ToolPak\ OK
Chọn Tools\ Data Analysis Nhập dữ liệu theo cột
Chọn mục : Anova: Single Factor Chọn các mục nhƣ hình:
27
CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.1. Khảo sát chế phẩm enzyme Termamyl
4.1.1. Khảo sát hàm lƣợng protein của chế phẩm enzyme Termamyl
Hình 4.1: Đồ thị tƣơng quan giữa OD và nồng độ albumin Theo đồ thị ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 0,0645x + 0,0444
Kết quả: Hàm lƣợng protein của chế phẩm protein Termamyl 120L là 104 mg/ml
4.1.2. Khảo sát hoạt tính của chế phẩm enzyme Termamyl
28 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả: Hoạt tính của enzyme tự do là 25,5UI
Bảng 4.1 Kết quả khảo sát chế phẩm enzyme tự do Hoạt độ (UI/ml) Hàm lƣợng protein (mg/ml) Hoạt tính riêng (UI/mg protein) 25.5 104 0.24
(số liệu chi tiết ở phụ lục bảng 1, 2 trang 47 )
4.2 Cố định enzyme trên celite
Khảo sát cố định enzyme tại các nồng độ khác nhau 2, 3, 4, 5, 6 ml enzyme trong tổng thể tích 15 ml enzyme pha trong dung dịch đệm pH 7. Tiến hành cố định theo sơ đồ hình 3.1.
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme : celite lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ trên celite
Thể tích enzyme (ml/1g celite) 2 3 4 5 6
∑ protein cđ (mg/1g celite) 103 110 152 146 146
∑ hoạt độ enzyme cđ (UI/1) 7 15.7 22.3 24 23
(Xem số liệu chi tiết ở phụ lục bảng 4, 5 trang 49)
Hình 4.3: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:celite lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ celite
29
Nhận xét: Theo bảng số liệu trên ta thấy khi tăng thể tích enzyme đem đi hấp phụ trên celite thì lƣợng protein cố định đƣợc tăng. Tuy nhiên khi thể tích enzyme/1 g celite lớn hơn 4 ml thì lƣợng protein không tăng nửa. Qua đó có thể cho rằng lƣợng protein mà 1g chất mang celite có thể hấp phụ đƣợc tối đa khoảng 150 mg. Vì vậy khi tăng thể tích enzyme ban đầu thì hiệu suất cố định protein giảm.
Phù hợp với hiệu suất cố định protein, khi tăng tỉ lệ enzyme cố định/1g celite thì tổng hoạt độ cố định đƣợc cũng tăng. Tuy nhiên từ tỉ lệ 4 ml/1g celite trở đi thì tổng hoạt độ cố định không tăng nửa. Tỉ lệ 4 ml enzyme cho 1 g chất mang celite mang lại hiệu quả cố định cao nhất. Ở tỉ lệ này, theo công thức (10) mục 3.2.4 => Hiệu suất cố định khoảng 22 % > 10% có triển vọng để tiếp tục khảo sát.
4.3 Cố định enzyme trên celite kết hợp với alginate
4.3.1 Khảo sát tỉ lệ Celite
Thực hiện cố định lƣợng dung dịch Alginate 2% sử dụng 4 ml. Thay đổi lƣợng celite đã hấp phụ enzyme ở thí nghiệm trƣớc. Lƣợng celite đƣợc sử dụng lần lƣợt 1, 2, 3, 4, 5, 6 % (w/v) so với thể tích dung dịch alginate sử dụng. Tiến hành tạo gel theo sơ đồ 3.2.
Bảng 4.3 Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite lên tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg Tỉ lệ celite
(%) 1 2 3 4 5 6
∑ hoạt độ
enzyme (UI) 3 5 6 6.2 6.45 6.5
30
Hình 4.4: Ảnh hƣởng của tỉ lệ celite đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg
Nhận xét: Khi ta tăng tỉ lệ celite thì tổng hoạt độ cố định trong alginate cũng tăng. Do tỉ lệ celite càng nhiều lƣợng enzyme cố định trong hạt gel càng nhiều. Tuy nhiên khi tỉ lệ này lớn hơn 3% thì tổng hoạt độ cđ tăng không đáng kể. Có thể do nồng độ này đã đạt đến mức bảo hoà làm giới hạn khả năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme. Do vậy ta lấy tỉ lệ celite cố định là 3% để khảo sát các thí nghiệm tiếp theo.
4.3.2 Khảo sát nồng độ dung dịch sodium alginate
Với tỉ lệ celite 3% ta tiếp tục khảo sát nồng độ thích hợp của dung dịch sodium alginate để tạo hạt gel. Sử dụng các dung dịch sodium alginate với các nồng độ: 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5 (%w/v). Tổng thể tích dung dịch trƣớc khi tạo gel là 4 ml. Tiến hành theo sơ đồ hình 2.12.
Bảng 4.4: Ảnh hƣởng nồng độ dung dịch alginate đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg
Nồng độ alginate (%w/v) 2 2.5 3 3.5 4 5
∑ hoạt độ enzyme cđ (UI) 5.3 6 7 7.4 6.9 6.9
31 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 4.5: Ảnh hƣởng của nồng độ dung dịch alginate đến tổng hoạt độ của enzyme cđ cel – alg
Nhận xét: Theo bảng ta thấy nồng độ dung dịch alginate ở 3.5% mang lại hiệu suất cố định cao nhất. Hiệu suất cố định tƣơng ứng rất cao (60%). Thực tế thí nghiệm cho thấy khi tăng nồng độ dung dịch alginate thì tổng hoạt tính cố định cũng nhƣ hiệu suất hoạt tính tăng. Tuy nhiên khi nồng độ hơn 3.5 % thì dung dịch bắt đầu có độ nhớt cao. Ở nồng độ 5%, dung dịch alginate có độ nhớt rất cao, hoạt tính cố định cũng không tăng nữa thậm chí giảm do hao hụt trong quá trình thao tác. Nhiều nghiên cứu trƣớc cố định enzyme trên alginate cũng cho thấy hiệu suất hoạt tính tăng khi nồng độ dung dịch alginate tăng có thể do hạt gel tạo thành có nhiều lỗ xốp hơn, nhốt chặt enzyme hơn.
Sau khi khảo sát enzyme cố định trên celite kết hợp alginate, ta chọn các thông số cố định tối ƣu nhƣ sau. Thể tích enzyme:1g celite gel là 4 ml, tỉ lệ silica gel (w/v) là 3%, nồng độ sodium alginate tối ƣu ở 3.5%, ta tính đƣợc hiệu suất cố định là: 60% (theo công thức 10 mục 3.2.4)
32
4.4 Cố định enzyme trên silica gel
Tiến hành theo sơ đồ hình 3.1. Sau khi ủ 1g chất mang silica gel với enzyme trong 3 giờ, ta rửa đi phần enzyme không hấp phụ.
Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel lên tổng protein cđ và tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg Thể tích enzyme (ml/1g silica gel) 3 4 5 6 7 8 ∑ protein cđ (mg/1g silica gel) 294 338 418 448 445 432 ∑ hoạt độ enzyme cđ (UI) 14 26 29 29.3 29.6 30.6
(Số liệu chi tiết xem phần phụ lục 17 và 18 trang 54, 55)
Hình 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ enzyme:silica gel đến tổng protein cđ và tổng hoạt độ của enzyme cđ si - alg
Nhận xét: Ta thấy khi tăng lƣợng enzyme thì lƣợng protein hấp phụ tăng nhanh. Tuy nhiên khi thể tích enzyme lớn hơn 5 ml thì lƣợng protein cđ không tăng nữa.
33
Tƣơng tự nhƣ thí nghiệm đối với celite, 1 g silica gel chỉ có thể hấp phụ tối đa một lƣợng protein khoảng 400 mg/g. Tƣơng ứng với khả năng cố định protein, khi tăng lƣợng enzyme cố định thì tổng hoạt độ enzyme cố định tăng nhƣng đến 5 ml trở đi thì tăng không đáng kể. Vậy thể tích enzyme thích hợp hấp phụ lên 1 g silica gel là 5 ml. Tại nồng độ enzyme này hiệu suất cố định thu đƣợc là 22.7%. Kết qủa này tƣơng đối thấp và không khác nhiều với hiệu suất cố định enzyme trên celite và các nghiên cứu hấp phụ enzyme lên chất mang vô cơ trƣớc đó.
Sau khi khảo sát cố định trên silica gel ta chọn thể tích enzyme (ml) hấp phụ trên 1 g silica gel tối ƣu là 5 ml. Ở tỉ lệ này hiệu suất cố định là: 22.7 %
4.5 Cố định enzyme trên silica gel kết hợp với alginate 4.5.1 Khảo sát tỉ lệ silica gel 4.5.1 Khảo sát tỉ lệ silica gel
Thực hiện theo sơ đồ hình 3.2 với các tỉ lệ silica gel nhƣ sau 2, 3, 4, 5, 6 % (w/v) so với thể tích alginate cố định 4 ml 2%. Silica gel đã hấp phụ enzyme với tỉ lệ 5 ml enzyme/1g chất mang ở thí nghiệm trên.
Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt tính của enzyme cđ si – alg
Tỉ lệ silica gel 2 3 4 5 6
∑ hoạt độ enzyme cđ
(UI) 6 7.4 8.72 8.94 9.2
34
Hình 4.7: Ảnh hƣởng của tỉ lệ silica gel đến tổng hoạt độ của enzyme cđ si – alg
Nhận xét: Ta thấy khi tăng hàm lƣợng silica gel thì tổng hoạt tính cố định đƣợc cũng tăng dần. Tuy nhiên từ hàm lƣợng 4 % đến 6 % thì hoạt tính tăng không đáng kể. Do vậy ta chọn tỉ lệ silica gel là 4%.
4.5.2 Khảo sát nồng độ alginate
Dùng 4 ml dung dịch sodium alginate tại các nồng độ khác nhau để cố định 0.16 g silica gel đã hấp phụ enzyme ở trêntheo sơ đồ hình 3.2.
Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của nồng độ alginate đến tổng hoạt độ enzyme cđ si – alg
Nồng độ dd alginate (%w/v) 2 3 4 5 6
∑ hoạt độ enzyme cđ (UI) 8 8.6 9 9 8.9
(Số liệu chi tiết xem phần phụ lục 29 trang 60)
Nhận xét: Khi tăng lƣợng nồng độ sodium alginate, tổng hoạt độ cố định cũng tăng. Do khi nồng độ sodium alginate tăng gel tạo thành có độ bền cao hơn bao bọc các hạt silica gel tạo nên cấu trúc bền vững hơn. Tuy nhiên khi đạt đến tỉ lệ 4% thì tổng hoạt độ cố định đƣợc không tăng nữa. Ở nồng độ này độ nhớt của dung dịch sodium alginate đã đạt mức khá cao. Quá trình tạo gel khó khăn hơn. Tổng hoạt độ thu đƣợc
35 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
không tăng lên mà còn có xu hƣớng giảm tuy không đáng kể do hao hụt trong thao tác. Tổng hoạt độ cố định thu đƣợc cao nhất khi bao gói bằng dung dịch alginate có nồng độ 4% (w/v).
Sau khi khảo sát enzyme cố định trên silica gel kết hợp alginate, ta chọn các thông số cố định tối ƣu nhƣ sau. Thể tích enzyme:silica gel là 5 ml, tỉ lệ silica gel (w/v) là 4%, nồng độ sodium alginate tối ƣu ở 4%, ta tính đƣợc hiệu suất cố định là 44% (theo công thức 10 mục 3.2.4) (xem phụ lục 10).
Khảo sát độ ổn định của enzyme cố định
Chế phẩm α-amylase chịu nhiệt Termamyl đƣợc cố định theo bốn cách khác nhau: Cố định bằng hấp phụ lên celite, silica gel, kết hợp hấp phụ lên celite, silica gel và bọc