nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất azometin oxim và hydrazon

Các base azometin, các oxim và các hydrazon đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ lâu, không chỉ được sử dụng như một chất trung gian để tổng hợp mét sè hợp chất dị vòng c

Lời cảm ơn.

Trong thời gian 3 tháng làm thực nghiệm, được sự hướng dẫn trực tiếp hết sức nhiệt tình của : Thầy giáo - GS TS Trần Mạnh Bình

Cô giáo - TS Phạm Thị Minh Thuỷ

Cùng sự chỉ bảo và giúp đỡ về mọi mặt của các thầy cô giáo còngnh các thầy cô kĩ thuật viên trong bộ môn Hoá Hữu Cơ, tôi đã hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của mình theo đúng thời gian quy định.

Có được kết quả ngày hôm nay, tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo - GS TS Trần Mạnh Bình, cô giáo - TS Phạm Thị Minh Thuỷ cùng toàn thể các thầy cô kĩ thuật viên.

Tôi còng xin chân thành cảm ơn sự tận tình giúp đỡ của thầy giáo

-TS Đỗ Ngọc Thanh ( Phòng nghiên cứu trung tâm ) và cô giáo - -TS Chu Thị Lộc ( Tổ môn Vi nấm - Kháng sinh ) cùng các bộ môn, phòng ban, bạn bè trong trường đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận.

Hà Nội ngày 27/5/2002 Sinh viên

Nguyễn Quyết Chiến.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, nhu cầu thuốc phòng và điều trị bệnh là rất lớn, đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn nên việc tìm ra các thuốc mới càng cấp thiết hơn

Giữa cấu trúc hoá học và tác dụng dược lý thường có mối quan hệ mật thiết,

do đó người ta đã tìm tòi và lựa chọn ra những khung và nhóm chức có tác dụng sinh học để tổng hợp, bán tổng hợp ra thuốc mới

Các base azometin, các oxim và các hydrazon đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu từ lâu, không chỉ được sử dụng như một chất trung gian để tổng hợp mét sè hợp chất dị vòng chứa N hay tổng hợp - aminoceton mà chính bản thân nó cùng có mét sè tác dụng sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, điều trị lao, hủi, lợi tiểu Nhiều chất trong số đó đã được dùng làm thuốc

Tetracyclin là một kháng sinh trong họ kháng sinh Tetracyclin, là những dẫn chất của octahydronaphtacen 4 vòng có tác dụng trên nhiều loại cầu khuẩn và trực khuẩn Gram(+), Gram(-) Hiện nay tetracyclin Ýt được sử dụng cho trẻ em vì dễ tạo phức chelat với canxi do đó làm vàng răng trẻ em, hơn nữa nó có vị rất đắng

Với định hướng kết hợp cấu tróc azometin (- CH = N - ), oxim ( = N - OH ), hydrazon ( - HC = N - NH - ) với tetracyclin nhằm hy vọng tổng hợp ra mét sè hợp chất mới có tác dụng sinh học và ứng dụng được vào thực tế điều trị lâm sàng Trong khoá luận này chúng tôi tiến hành tổng hợp mét sè dẫn xuất ngưng tụ chứa

N của tetracyclin gồm : Mét hợp chất oxim, mét hợp chất azometin và 3 hợp chất hydrazon sau đó sơ bộ thăm dò tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của những chất tổng hợp được

PHẦN 1: TỔNG QUAN

1.1 Sơ lược về lịch sử nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất Azometin, Oxim

và Hydrazon [15].

1.1.1 Azometin.

Các azometin ( base Schiff ) là những hợp chất hữu cơ trong phân tử có chứa nhóm imin ( - CH = N - ), chóng đã được nghiên cứu từ lâu và là sản

phẩm trung gian để tổng hợp mét sè hợp chất có tác dụng sinh học (-aminoceton, các hợp chất dị vòng chứa N như quinolin, pyrazol, thiazol ), bản thân chóng còng có tác dụng sinh học

Vào khoảng năm 1850 khi trộn một hỗn hợp đồng phân tử benzadehyd và anilin thì Laurent và Gerhard thu được một hợp chất có công thức C13H11N gọi là benzoylanilid (Sau này người ta tìm ra công thức cấu tạo là CH - CH = N - CHvà

gọi tên là benzylidenanilin hay benzalanilin ) Đây là chất đầu tiên thuộc dãy anilin thế

Tõ năm 1864 đến nay, nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục nghiên cứu một cách có hệ thống phản ứng của các aldehyd với amin bậc 1, bậc 2 thuộc dãy béo, dãy thơm và dị vòng

Ví dụ: Amin bậc 1 ( 1 mol )

Tại Việt Nam còng đã có mét sè công trình nghiên cứu về vấn đề này (GS -Đặng Như Tại và cộng sự)

Tại Trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã có mét số luận án PTS nghiên cứu tổng hợp các azometin tõ các aldehyd thơm và amin thơm làm chất trung gian tổng hợp các dẫn chất thuộc dãy -aminoceton

1.1.2 Mét sè azometin - oxim và hydrazon dùng làm thuốc:

Bảng 1 Mét sè Azometin - Oxim - Hydrazon dùng làm thuốc

ST

( 3 methoxy 4 -hydroxy benzaldehyđ

Isonicotinoylhydrazon

Chống lao

( p acetamidobenzal

-dehyd thiosemicarbazon)

Chống lao

3 Nitrofuran, furacin

(5 nitro 2 -furfuraldehyd Semicarbazon

Kháng khuẩn

4 Nifuroxim

(Anti - 5 - nitro furaldoxim

Kháng nấm 5

Sulfacinamin

Kháng khuẩn

6

Ampecloral

Điều trị chứng biếng ăn 7

tiểu

8

Terizidone

Thuốc chống lao

1.2 Sơ lược về Tetracyclin [2]

Tetracyclin là mét trong những dẫn xuất của octahydronaphtacen 4 vòng Đây là một kháng sinh trong nhóm kháng sinh có tên là tetracyclin Các tetracyclin được chia thành 2 nhóm:

+ Các tetracyclin thiên nhiên có nguồn gốc từ Streptomyces

+ Các tetracyclin bán tổng hợp

Các kháng sinh trong nhóm này có khung cấu tróc chung nh sau:

Các tetracyclin đều ở dưới dạng bột kết tinh màu vàng, vị đắng Dạng base rất Ýt tan trong nước, tan trong ethanol và các dung môi hữu cơ Ýt phân cực Dạng muối hydroclorid tan được trong nước Là những hợp chất lưỡng tính có thể tạo muối với acid và kiềm Đặc biệt các tetracyclin tạo ra những chelat bền vững với mét sè kim loại nh Ca, Mg, Fe do đó răng trẻ em bị nhuộm vàng khi dùng tetracylin lâu ngày ( 2  3 tuần ) Theo mét sè tác giả các tetracyclin đọng lại ở trong răng trong những giai đoạn đầu của sù calci hoá, có ái lực với Ca của xương,

do đó trẻ em dưới 8 tuổi có thể bị hỏng men răng, phụ nữ có mang dùng tetracyclin thì có thể giảm sự phát triển của xương dài và các nụ răng của thai người Nói chung các tetracylin có hoạt phổ tác dụng rộng, bao gồm nhiều loại cầu khuẩn và

trực khuẩn Gram(+) và Gram(-), xoắnkhuẩn,Rickettsia, Trichomonas,Amip, giun

kim, Chlamydia, Mycoplasma, không có tác dụng trên trực khuẩn mủ xanh, trực

khuẩn lao, Proteus, Candida albicans Tuy vậy các tetracyclin có tác dụng mạnh

yếu khác nhau trên mét sè vi khuẩn Ví dụ nh với tụ cầu, lậu cầu, màng não cầu thì clotetracyclin có tác dụng tốt hơn tetracylin, oxytetracyclin nhưng đối với trực khuẩn lỵ thì nguợc lại

Các tetracyclin khác nhau còng có thời hạn bán huỷ khác nhau, có mức độ liên kết với protein của huyết thanh khác nhau do đó có liều dùng và mục đích điều trị cũng khác nhau Ví dụ như doxycyclin hấp thụ nhanh và gần như trọn vẹn, bài xuất lại rất chậm nên duy trì nồng độ trong máu khoảng 24 (h),

trong khi đó tetracyclin lại bài xuất rất nhanh trong nước tiểu, do đó khi dùng doxycyclin chỉ nên dùng ngày 1 lần với liều lượng thấp và không nên dùng

trong trường hợp nhiễm khuẩn đường niệu và bệnh nhân bị thiểu năng thận Hai trường hợp này thì nên dùng tetracyclin có tác dụng ngắn hạn do bài xuất nhanh

1.3 Tính chất chung của các Oxim - Hydrazon - Azometin.

1.3.1 Tính chất vật lí [15].

* Oxim.

Được hình thành do sù kết hợp của hydroxylamin với aldehyd hoặc ceton Oxim thường là các chất rắn kết tinh, có điểm chảy xác định, Ýt tan trong nước( Trừ acetoxim ), tan trong alcolethylic, ether, DMF Oxim của các aldehyd thơm và các ceton không đối xứng RCOR’ tồn tại dưới 2 dạng đồng phân syn và anti Dạng syn ( cấu hình cis ) là dạng có nhóm OH ở cùng phía với gốc R hoặc Ar liên kết với Cacbon trong nhóm còn dạng anti có cấu hình đối lập Điểm nóng chảy của oxim dạng anti cao hơn dạng syn

* Azometin

Là những chất có cấu tróc imin ( - CH = N - ) thường không bền do khuynh hướng polyme hoá, ngưng tụ hoặc thuỷ phân Dạng mạch hở thường không bền, không thể tách ra thành dạng tự do

Các azometin có cấu trúc thế thì bền vững hơn azometin có cấu trúc không thế

Với các azometin thế ở N ( dãy N alkyl hoá hoặc N aryl hoá ) cấu tróc R

-CH = N - R’ thì gốc R là mạch hở thường là chất lỏng và kém bền, trong đó cấu tróc CH2 = N - R’ tồn tại ở trạng thái trimer hoá song cấu trúc của nó là một dị vòng, các chất khác nhanh chóng bị trùng hợp hoá Với gốc R thơm thì azometin là những chất rắn kết tinh, tồn tại dưới dạng đơn phân tử,

có tính kiềm, Ýt tan trong nước, tan trong alcol, cloroform, benzen, DMF , không tan trong ether

* Hydrazon

Phần lớn hydrazon thơm là chất kết tinh

Các hydrazon vừa mới điều chế thường có mầu vàng nhạt hoặc không mầu

Xác định điểm nóng chảy là mét trong những cách để định tính các hợp chất carbonyl, tuy nhiên việc xác định điểm nóng chảy của các hydrazon có khó khăn

do nã dễ bị phân huỷ bởi nhiệt

1.3.2 Tính chất hoá học

* Oxim

+ Phản ứng thuỷ phân

Khi đun nóng oxim với dung dịch acid vô cơ trong nước nó bị thuỷ phân trở thành hợp chất carbonyl ban đầu và hydroxylamin

+ Phản ứng khử hoá

oxim bị khử hoá tạo sản phẩm là amin bậc 1 bởi các tác nhân khử thường dùng như LiAlH4, ZnCl2, Natri trong alcol, , không nên dùng chất khử acid để tránh thuỷ phân

Oxim của cyclohexanon khi hydro hoá với xúc tác đen platin trong dung dịch alcol - nước và hydrocloric tạo ra cyclohexyl hydroxylamin

- Tính base

- Phản ứng cộng hợp

- Sù dễ dàng cắt mạch mà điển hình là phản ứng thuỷ phân

a Tính base

Do trên nguyên tử N có cặp điện tử không chia sẻ nên N là mét trung tâm base Lewis Liên hợp (n,) có ảnh hưởng nhất định đến tính chất base của hợp chất azometin Ngoài ra, các nhóm thế trên nhân thơm của phần amin còng ảnh hưởng

rõ rệt đến tính base này

Kết hợp với acid tạo muối

R - CH = N - R’ + HCl

b Phản ứng cộng

- Cộng hợp hydro

R - CH=N - R’ + H2 R - CH2 - NH - R’

- Cộng hợp halogen

Sản phẩm cộng hợp halogen vào azometin làm bão hoà dây nối đôi

R - CH=N - R’ + Br2 R - CHBr - NBr - R’

- Cộng hợp các acid sulfurơ và các sulfit kiềm

C6H5 - CH = N - C6H5 + H2SO3 C6H5 - CH - N - C6H5

- Cộng hợp với acid cyanhydric : cho sản phẩm là nitril

R - CH = N - R’ + HCN R - CH - NH - R’

- Cộng hợp với các hợp chất cơ magie

Theo Busch và cộng sự, các hợp chất cơ magie có thể tham gia phản ứng cộng với các azometin là dẫn chất của aldehyd thơm với các amin thơm

Có 2 yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng

+ Mật độ điện tử trên B càng lớn ( càng có tính base mạnh ) thì tốc độ phản ứng càng lớn và ngược lại

+ Điện tích dương ở carbon của nhóm carbonyl càng lớn thì tốc độ phản ứng càng lớn và ngược lại

* Các yếu tố ảnh hưởng đến mật độ điện tử trên phân tử amin

+ Gốc B

Nếu gốc B có khả năng đẩy điện tử ( Hiệu ứng +I, + M ) sẽ làm tăng khả năng tham gia phản ứng Do vậy khả năng tham gia phản ứng cộng ái nhân của phân tử amin tăng dần khi mật độ điện tử trên B càng lớn

Nếu gốc B có khả năng hút điện tử sẽ làm giảm mật độ điện tử trên N nên khả năng phản ứng của hợp chất giảm

+ Sù có mặt và vị trí của các nhóm thế trên nhân thơm cũng ảnh hưởng đến khả năng phản ứng.

Nhóm thế loại I ( ankyl, -OH, - OCH3 ) gây hiệu ứng +I, + M làm tăng mật độ điện tử trên N nên tham gia phản ứng cộng ái nhân AN dễ hơn anilin Nhóm thế loại II ( -CHO, - NO2, - COOH ) cản trở phản ứng xảy ra

Ví dụ:

Các amin thơm sau được sắp xếp theo khả năng phản ứng tăng dần

* Xét yếu tố ảnh hưởng lên điện tích dương của carbon trên nhóm carbonyl

HB: Tác nhân ái nhân ( amin bậc 1 )

c Yếu tố xúc tác

Phản ứng tổng hợp có thể dùng xúc tác acid, base hoặc không cần xúc tác Điều này phụ thuộc vào tính ái nhân của tác nhân ái nhân Nếu tính ái nhân yếu ( tính base yếu ) thì cần xúc tác acid mạnh ( HCl, H2SO4 ) Ngược lại với các hợp chất của N có tính base mạnh hơn thì phản ứng cộng hợp có thể xảy ra trong môi trường acid yếu, trung tính, thậm chí base yếu

Cơ chế:

xúc tác base: B - NH2 + -OH B - -NH + H2O

xúc tác acid:

Vậy phản ứng xảy ra thuận lợi nhất tại mét pH nhất định chứ không phải trong môi truờng acid hay base mạnh Tại vị trí pH tối ưu này aldehyd được hoạt hóa mạnh đồng thời vẫn còn phần lớn thành phần ái nhân ở dạng tự do không bị proton hoá Nói chung thường trong vùng trị số pK của tác nhân ái nhân

Nhiệt độ tăng làm tốc độ phản ứng tăng, tuy nhiên chỉ nên duy trì ở nhiệt độ phù hợp vì nhiệt độ cao gây phân huỷ sản phẩm

* Dung môi là rất quan trọng đối với phản ứng Nếu các chất phản ứng là chất rắn phải hoà tan trong dung môi ( Hoặc hỗn hợp dung môi ) phù hợp để chúng có thể trộn đều Ngoài ra dung môi còn ảnh hưởng đến tính phân cực của liên kết cũng như tính ái nhân ( Mật độ điện tử ) trên N làm phản ứng thuận lợi hoặc khó khăn Phản ứng cộng hợp aldehyd với amin bậc I nếu chọn dung môi alcol sẽ làm sự phân cực của liên kết tăng giúp phản ứng được thuận lợi hơn

Phần 2 Thực nghiệm và kết quả

2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm

2.1.1 Nguyên liệu

a Hoá chất

Tetracyclin hydroclorid, natri carbonat

Hydroxylamin hydroclorid, semicarbazid, thiosemicarbazid, paranitroanilin; 2,4-dinitrophenylhydrazin

Ethanol tuyệt đối, methanol, cloroform, dimethylformamid

Acid acetic khan, acid sulfuric đậm đặc

b Dông cụ, máy móc

Bình cầu 3 cổ dung tích 250ml, bình cầu cổ mài 100ml, sinh hàn hồi lưu, nồi đun cách thuỷ, máy khuấy từ cú bộ phận nhiệt, cốc có má dung tích 100ml, 200ml, bản mỏng sắc ký Silicagel Kieselgel 60F254 ( MERCK )

2.1.2 Phương pháp thực nghiệm

a Nguyên tắc và sơ đồ phản ứng

Trong cốc có má 100ml cân chính xác khoảng 0, 7g hydroxylamin hydroclorid ( 0, 01 mol ) hoà tan trong 5ml nước cất, thêm từ từ khoảng 1, 06g atricarbonat cho đến hết sủi bọt, cho từ từ vào bình phản ứng dung dịch trên Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá, dùng đũa thuỷ tinh cọ thành bình để kết tinh oxim, lọc lấy tủa bằng phễu Buchner Tinh chế lại trong

ethanol tuyệt đối Sản phẩm mang sấy khô ở nhịêt độ 400C trong tủ sấy chân không

* Kết quả

Sản phẩm dạng bột màu vàng trắng, có khối lượng 1,55g

Hiệu suất: 65,11%

Nhiệt độ nóng chảy 192 - 1940C

2.3.2 Tổng hợp thiosemicarbazon của tetracyclin ( II )

* Tiến hành:

Trong bình cầu 3 cổ 100ml có lắp sinh hoàn hồi lưu hoà tan hoàn toàn 2, 2g tetracyclin base ( 0, 005 mol ) trong 10ml ethanol tuyệt đối nóng

Thêm từ từ vào bình phản ứng hỗn hợp gồm 0, 92g thiosemicarbazid (0, 01 mol ), 3g natriacetat đã hoà tan trong 5ml nước cất nóng Lắc đều hỗn hợp phản ứng, đun hồi lưu cách thuỷ có khuấy trong 60 phút, theo dõi phản ứng bằng SKLM Làm lạnh hỗn hợp bằng nước đá, xuất hiện kết tủa đặc, lọc

2.4.4 Phổ tử ngoại ( UV )

Các chất tổng hợp được cũng đã tiến hành phân tích phổ tử ngoại trên máy SP8 - 300 UV/ VIS trong vùng 200 - 400 nm tại phòng thí nghiệm trung tâm trường ĐH Dược Hà Nội Kết quả được ghi chi tiết trong bảng 5

Bảng 5 Kết quả phân tích phổ tử ngoại.

II

- B :

243; 265; 372

III

- B :

206; 230; 368

IV

- B

211; 242; 273; 440

V

- B :

229; 371

VI =N- B : = O 365; 272; 223

2.5 Sơ bộ thăm dò tác dụng sinh học của các chất tổng hợp

Đựoc sự giúp đỡ của tổ môn Vi nấm - Kháng sinh trường ĐH Dược Hà Nội, chúng tôi đã tiến hành thử mét sè tác dụng sinh học, cụ thể là khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, qua đó mong muốn tìm được mối liên quan giữa cấu trúc hoá học và tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được

2.5.1 Nguyên tắc

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng hợp được được xác định bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với các khoanh giấy tẩm chất thử Khả năng ức chế được đánh giá bằng đường kính vòng vô khuẩn

2.5.2 Thực nghiệm

a Chủng vi sinh vật sử dụng

* Gồm 4 chủng vi khuẩn Gram(+)

- Bacillus pumilus: NCTC 8241

- Bacillus cereus: ATCC 9946

- Staphylococcus aureus: ATCC 12228

- Sarcina lutea: ATCC 9341

* 5 chủng vi khuẩn Gram(-)

- Proteus mirabilis: BV 108

- Pseudomonas aeruginosa: VM 201

- Escherichia coli: ATCC 25922

- Salmonella typhi: DT 220

- Shigella flexneri: DT 112

* Mét chủng nấm.

- Candida albicans: ATCC 10231

b Môi trường.

* Gồm 3 môi trường

- Môi trường cao thịt, cao men

- Môi trường thạch thường

- Môi trường Sabouraud

c Nuôi cấy vi sinh vật kiểm định.

Các vi sinh vật kiểm định gồm có 4 chủng vi khuẩn Gram(+), 5 chủng vi khuẩn Gram(-) và một chủng vi nấm, trước khi tiến hành thí nghiệm được nuôi cấy

và nhân giống lên các môi trường dinh dưỡng thích hợp ( Thạch thường cho vi khuẩn, Sabouraud cho vi nấm ) ở nhiệt độ thích hợp trong 24 giờ Sau đó làm thành nhũ dịch VSV với nồng độ 107 - 108 tế bào/ 1ml trong NaCl 0,9% để tạo ra vùng ức chế có ranh giới rõ ràng

d Chuẩn bị chất thử

Các mẫu thử ( Gồm 5 chất I, II, III, IV, V ) được pha thành nồng độ 0, 5mg/ 1ml trong dung môi DMF, song song thử với các mẫu trắng ( Chỉ có dung môi ) Thấm dịch thử vào các khoanh giấy lọc đường kính N05, đường kính 7mm ( Đã tiệt