nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản

Ngược lại, phương pháp CE lại sử dụng lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3-4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.Ở Việt Nam đã

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

PHẠM NHO

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP

ĐIỆN DI MAO QUẢN

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 1.04.03

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Ri

Hà nội-2011

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam 2

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 6

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 8

1.3.1 Phương pháp quang học 8

1.3.2 Phương pháp điện hóa 9

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 12

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 13

2.1.1 Đối tượng 13

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2 Giớ i thiê ̣u chung về phương pháp Điê ̣n di mao quản 13

2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 13

2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản 14

2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu 14

2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất 15

2.2.3 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) 17

2.2.4 Mao quản và ử lý mao quản trước khi tách 24

2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu 26

2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản 27

2.2.7 Phân loại các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản 28

2 2.8Phân tích định lượng bằng phương pháp điện di mao quản 28

2.3.1 Kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu sinh học 29

2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extration-SPE) Thực nghiệm 29

2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu

sinh học 32

2.4 Thực nghiêm 31

2.4.1 Máy móc dụng cụ 34

2.4 Hóa chất 35

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 36

3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất 36

3.1.2 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di 37

3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm 40

3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm 41

3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS 43

3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 47

3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di 49

3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ mao quản 52

3.1.12 Tổng kết điều kiện tối ưu 54

3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 55

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 55

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn 58

3.2.3 Độ chính xác của phép đo 59

3.2.4 Độ lặp lại của phép đo 62

3.3 Phân tích mẫu thực 64

3.3.1 Khảo sát điều kiện SPE mẫu nước tiểu thêm chuẩn 64

3.3.1.1 Chọn cột chiết pha rắn các β-lactam trong mẫu nước tiểu 64

3.3.1.2 Khảo sát lực rửa giải của hệ các dung môi 64

3.3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 66

3.3.1.4 Khảo sát pH rửa giải 67

3.3.2 Phân tích mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện 70

3.4 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MECC) 71

3.5 Hướng phát triển của đề tài 72

CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN 73

1 Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy điện di 73

2 Đánh giá phương pháp phân tích 73

3 Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

Phụ lục 79

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe β-lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y

từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay Tuy nhiên sử dụng loại kháng sinh này không đúng liều lượng và cách dùng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết

để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng

Hai phương pháp dùng thường dùng để phân tích các β-lactam là HPLCvà phương pháp Điện đi mao quản (CE) Phương pháp HPLC làphương pháp tách có

độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi trong quá trình phân tích, vì vậy làm cho giá thành phân tích cao Ngược lại, phương pháp CE lại sử dụng lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3-4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường bằng kỹ thuật HPLC nhưng với kỹ thuật điện di mao quản thì chưa nhiều

Với những lý do nêu trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu luận văn là: “Nghiên cứu

điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản”

2

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,35]

Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin

Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA)

Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên

Cấu trúc và phân loại:

O

CO R

COOM

2 3 4 1

5 6 7

Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là:(2S,5R,6R3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid

Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau Với M là gốc cation thường là: K, Na, H

Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau

Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin

3

Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin

C-CH3

6-[(5- carbonyl)amino]

methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4-Là các Penicillin bán tổng hợp Phổ hẹp như nhóm I Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β-lactam được Cloxacillin

(CLO)

Cl N O

C-CH3

chloropheny )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino}

CH- amino-2-phenylacetyl]amino)

6-([(2R)-2-Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-) Không kháng β-lactamase và penicilliiase Amoxicillin

(AMO)

NH2NH2

CH-HO amino-2-(4-hydroxyphenyl)-

6-{[(2R)-2-acetyl]amino}

4

* Các cephalosporin

Các cephalosporin có cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R Khác nhau bởi các gốc R

N H

O

CO R1

N S

R3 R2

COOM

1 2 3 4 5

6 7 8

Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là:(6R,7R)

Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosprin

H2

-H -CH=CH2

Tính chất:Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan

trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH2

Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ)

Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5–2,8 tùy vào cấu trúc phân tử Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân

Tên kháng sinh pk a1

Tác dụng:

Cơ chế

Các penicillin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện Sinh tổng hợp vách tế bào bị

6

ngừng lại Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-) Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng

Kháng thuốc

Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là các enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi

là kháng methicillin)

Độc tính

Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định

dị ứng với thành phần của thuốc

1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R Gonzales [4,29], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không

7

điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [14] năm 2003, tỷ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus

sẽ đề kháng penicillin Tỷ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ D.P Raymond [18] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người bị nhiễm trùng

vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến 10 tỉ đô la Mỹ

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [6], năm

2005 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới 5 ngày) Theo [7] Qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất, dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện.Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên hiệp vì sự Sử dụng Kháng sinh Hợp lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam

1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm

Các β-lactam hấp thụ UV nhưng độ hấp thụ không cao, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các β-lactam được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp huỳnh quang có thể dùng xác định các β-lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

Fernández-González và cộng sự [13] dùng Cu2+

thủy phân và tạo phức với AMP, với bước sóng kích thích 343nm, phát xạ 420nm có giới hạn phát hiện thu được 4.10-7M (0,16mg/l) Phương pháp này kết hợp phương pháp dòng chảy cho

9

hiệu quả và tốc độ phân tích cao, sử dụng để phân tích AMP trong thuốc uống, huyết thanh

Theo [23], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống bằng

phương pháp phổ hấp thụ phân tử Phương pháp cải tiến sự thủy phân của kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335nm Khoảng tuyến tính từ 8-40mg/l và giới hạn phát hiện của AMP là 0,73mg/l, AMP 0,76mg/l

Wei Liu và cộng sự [35], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn nối trực tiếp đãphân tíchmột

số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN

là 0,5mg/l, cefradine 0,04mg/l, cefadroxil là 0,08mg/l, 0,1mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0,1mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các β-lactam nhưng không phổ biến nhiều Theo [19], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92μM (0,39mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M, pH=5,2

1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất

là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định các kháng sinh β-lactam trong các

Theo [36], WJBlanchflower và cộng sự dùng HPLC-MS phân tích penicillin

V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện chạy sắc ký: cột Inertsil ODS2(4,6mm×150mm, 5μm); pha động: ACN-(C2H5)3N 0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10μg/kg, trong thịt 25-100μg/kg

J.M Cha và cộng sự [19] dùng phương pháp HPLC-MS để phân tích β-lactam trong nước sông và nước thải Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C18 (2,1mm×50mm, 2,5μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C

=Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25ml/phút; nhiệt độ cột

450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin

có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8-10 ng/l với nước bề mặt, 13-18ng/l với nước thải trước xử lý, 8-15ng/l với nước thải sau xử lý

Một detector quan trọng trong phương pháp HPLC là detector huỳnh quang, với ưu điểm tăng độ nhạy, độ chọn lọc cao Như trong [33] C.Y.W Ang và cộng sự dùng cột Spherisorb ODS2 (250mmx4,6mm, 5μm) phân tích AMO trong sữa bò(pha động: ACN/đệm photphat 10mM pH 5,6-24/76; detector huỳnh quang: 346-422nm) đạt giới hạn phát hiện lần lượt 0,5μg/kg và 0,3μg/kg Tuy vậy, do các β-lactam ít tạo phức phát huỳnh quang và cơ chế phát quang dựa trên phản ứng quang hóa [18, 28] nên chỉ áp dụng với số ít chất hoặc phân tích riêng từng chất chứ không

áp dụng phân tích đồng thời nhiều kháng sinh cùng lúc được

11

Tác giả Ngô Quang Trung [11] đã xây dựng quy trình phân tích đồng thời 6 kháng sinh β-lactam gồm: AMO, CEP, AMP, CLO, CEF, PENG trong nước thải bệnh viện tại khu vực Hà Nội Tác giả sử dụng cột tách Supelcosil ODS 250mm x 4,6mm, 5µm, pha động gồm đệm axetat 12mM pH 4, 70%; ACN 20%, MeOH 10% Detector UV-VIS đo ở bước sóng 212nm Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0,1-1mg/l, hệ số tương quan R >0,99 Giới hạn phát hiện LOD và LOQ là 0,4 và 9,1mg/l

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn…

để phân tích các β-lactam

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu

và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ

1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillaryelectrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [23] sử dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịchđệmđiện di gồm 40mM đệm Borat, 100mM SDS, pH 8,5 Tiến hành phân tích tại thếđiện di 10

kV, nhiệtđộ 200C, thời gian bơm mẫu 10s Phương pháp cho phép tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện từ 0,14mg/l-0,27mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 - 0,86%, diện tích pic 1,3 - 4,15% Độ thu hồi trên 96%

Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp

và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

Phương pháp MECC cũng được M.I Bail´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez,

C Cruces-Blanco [24] xác định 9 loại kháng sinh β-lactam gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25kV Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến 1,42mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1,5 đến 1,7% Độ thu hồi từ 91 - 95,6%

Nhìn chung, phương pháp quang học và phương pháp điện hóa rất dễ tiến hành, đơn giản nhưng chỉ xác định từng chất riêng rẽ, điều này rất khó cho việc phân tích các mẫu có đa thành phần Với phương pháp HPLC kết quả tách tốt, độ chính xác, độ nhạy cao nhưng giá thành chi phí phân tích một mẫu lớn Vì vậy phương pháp CE sẽ là bước phát triển mới khắc phục những nhược điểm của phương pháp quang, điện, HPLC mà kết quả đáng tin cậy Trong bản luận văn này, chúng tôi nghiên cứu theo hướng của tác giả L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [23], M.I Bail ´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [24] trong mẫu dược phẩm và sinh học

2.1.2Nội dung nghiên cứu

Nội dung đề tài cần giải quyết là:

- Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản mixen (MECC) với detector Diod Array (DAD) có độ nhạy cao

- Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách một số kháng sinh -lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…

- Nghiên cứu điều kiện chiết pha rắn; tách và làm giàu-lactam từ nước tiểu

- Đánh giá thống kê phương pháp phân tích

- Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu

- Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp

2.2Giơ ́ i thiê ̣u chung về phương pháp Điê ̣n di mao quản [5,8,22]

Để thực hiện được nhiệm vụ của luận văn, kỹ thuật tách được chọn là phương pháp điện di mao quản điện động học mixen (MECC)

2.2.1Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản

- Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển - mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25-100m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E nhất định được cung cấp bởi một

14

nguồn thế cao một chiều (V: 10-30 kV) đặt vào hai đầu mao quản Nghĩa là CE là

kỹ thuật tách được thực hiện trong mao quản nhờ lực từ trường điện E điều khiển sự tách của các chất Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, như tốn ít mẫu và các hoá chất khác phục vụ cho sự tách, nhưng số đĩa hiệu dụng Nef lớn, sự tách các chất

xẩy ra nhanh và hiệu quả cao

- Cơ chế điện di: Dưới tác dụng của lực điện trường E (Electric Field Force: EFF) và dòng điện di thẩm thấu (Electro-Osmotic Flow: EOF), các phân tử chất tan

sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau vìđiện tích, kích thước và độ linh động của chúng khác nhau

2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản

2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu

Độ linh động tuyệt đối của cấu tử trong dung dịch điện ly chuyển động trong điện trường được biểu diễn bằng công thức:

μef = q

6πɳr cm2V−1s−1 (1) Trong đó: q - điện tích của hạt tích điện (culong)

15

Trong dung dịch chất điện ly, mỗi ion luôn chịu ảnh hưởng bởi lực tác động của nhiều ion khác nhau xung quanh, đặt biệt là các ion đối làm cho tác động của điện trường tới ion sẽ giảm đi Mặt khác, điện trường chỉ tác động tới các cấu tử mang điện tích, mà điều này còn phụ thuôc nhiều yếu tố, đó là hằng số phân ly của chất điên ly, pH của dung dịch và nồng độ của nó Như vậy, độ linh động điện di của một ion khi bị tác động của các yếu tố kể trên nên khác với độ linh động điện di tuyệt đối.Độ linh động điện di của ion tương ứng với phần ion bị ảnh hưởng của điện trường đó gọi là độ linh động điện di hiệu quả, kí hiệu là µ’

𝜇, = 𝜇𝑖 𝑖 𝑛𝑖 4 ; trong đó µi là độ linh động ion, ni là phần mol

2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất

Nguyên nhân xuất hiện dòng điện di thẩm thấu

Dòng điện di thẩm thấu (EOF) trong mao quản xuất phát từ lớp điện kép trên thành mao quản và chất điện ly chứa trong nó Sự phân li của các nhóm chức trên

bề mặt mao quản tạo nên lớp điện tích trái dấu từ đó hình thành lớp điện kép, phía trong là các ion cửa và phía ngoài của nó là lớp khuếch tán Nếu lớp ion cửa mang điện tích âm, thì lớp phía ngoài sẽ mang điện tích dương và ngượclại

Hình 2.1 Cấu trúc các lớp điện trong thành mao quản

16

Trong bề mặt mao quản silica, các nhóm silanol (–SiOH) bị deproton thành –SiO- khi tiếp xúc với dung dịch chất điện li và hình thành một lớp điện tích âm Để trung hòa các điện tích âm trên, cần có các điện tích dương, và do đó hình thành một lớp điện kép, tiếp theo là các lớp khuếch tán Ở pH=9 thì các nhóm silanol hầu như ion hóa hoàn toàn, lớp điện kép hình thành một cách tốt nhất Lớp điện kép này lại liên quan mật thiết với dòng điện di thẩm thấu EOF Bản chất của dong EOF là

sự di chuyển có hướng của các điện tích trong môi trường Trong dung dịch đệm, các ion tích điện dương sẽ di chuyển về phía cực âm còn các ion tích điện âm sẽ di chuyển theo chiều ngược lại về phía cực dương

Trong dung dịch nước và các hệ đệm khác nhau, các ion không tồn tại độc lập

mà bị hyđrat hóa, đặt biệt là các ion dương từ đó khi các ion di chuyển trong điện trường kéo theo sự di chuyển của cả nước Khi ta đặt một thế vào hai đầu mao quản(cỡ 25-100µm) thì dòng dung dịch trong mao quản đã xảy ra Ví dụ, vận tốc dòng đạt 4nl/s với mao quản có đường kính 50µm Đây chính là dòng điện di thẩm thấu, EOF Chiều của dòng điện di thẩm thấu đi từ cực dương sang cực âm

Sự di chuyển của ion dương về cực âm mang theo nước hydrat tạo thành dòng dung dịch mang theo cả phân tử trung hòa và cả ion âm (bị cuốn theo dòng dung dịch vì không vượt qua dòng EOF) Trong dòng chảy về phía cực âm đi đầu là các ion mang điện tích dương tiếp theo là các phân tử trung hòa, đi sau cùng là các ion mang điện tích âm

Hình 2.2 Lớp điện kép trong mao quản silic

17

Tính chất của dòng EOF

Dòng EOF di chuyển trong mao quản được điều khiển bằng điện trường cho nên tính chất khác so với dòng EOF được điều khiển bằng áp suất Lực tác động lên các chất điện li trong dung dịch nền rất đồng đều, hơn nữa mao quản không có chất nhồi nên mặt cắt tiết diện trong mao quản rất phẳng, chỉ có một phần nhỏ nơi tiếp giáp với bề mặt của thành mao quản có sự kéo dài của chân Điều này có thể giải thích do sự ma sát, tuy nhiên so sánh với mặt cắt khi điều khiển bằng áp suất thì trong trường hợp điều khiển bằng điện trường tốt hơn rất nhiều

a) b)

Đường kính của mao quản cũng ảnh hưởng nhiều tời dòng EOF, người ta thấy rằng đối với mao quản nhỏ trong vùng 25-50µm, sự thay đổi đường kính mao quản không ảnh hưởng tới dòng EOF Tuy nhiên khi đường kính mao quản lớn hơn 50µm thì khi tăng đường kính mao quản sẽ làm giảm dòng EOF, thậm chí d > 200µm dòng EOF có thể mất hẳn

2.2.3 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC)

Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) là kỹ thuật tách điện di có sử dụng kết hợp cả tính chất của kỹ thuật điện di mao quản (Capillary Electrophoresis) và sắc ký lỏng (LC) có pha tĩnh Nó là một trong các

Hình 2.3:a) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng điện áp và píc tương ứng

b) Mặt cắt dòng EOF điều khiển bằng áp suất và píc tương ứng

18

kiểu tách sắc ký (separation mode) của kỹ thuật CE được ứng dụng rộng rãi trong sinh học, y học và dược MECC là một kiểu kỹ thuật điện di mao quản có sức mạnh, tiện lợi và được ứng dụng cho việc tách cả các chất phân tử trung hoà và các chất mang điện tích (hợp chất liên kết ion)

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử Mixen (tiểu phân Mixen - pha tĩnh giả) trong ống mao quản và các tiểu phân này

sẽ dẫn dắt và đóng góp vào khả năng của quá trình tách sắc ký điện di các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện ly trong ống mao quản Sự tách sắc

kí của các phân tử chất tan trung hòa bằng kỹ thuật MECC được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt nằm trong dung dịch điện di Khi chất hoạt động bề mặt ở nồng độ cao hơn nồng độ ngưỡng của Mixen (giới hạn hình thành Mixen, CMC - Critial Micellary Concentration), ví dụ chất hoạt động bề mặt SDS (Sodium Dodecyl Sulfat), có CMC= 9mM, thì một tổ hợp của các phần tử tiểu phân của chất hoạt động bề mặt được tích tụ lại và chúng hình thành trong ống mao quản các tổ hợp của các tiểu phân SDS tạo thành các Mixen (pha tĩnh giả) Các Mixen này có đầu kị nước hướng vào trung tâm của Mixen và đầu ưa nước hướng ra ngoài dung dịch và sẽ tương tác với ion chất đệm, hay ion chất tan Cấu trúc tiêu biểu của Mixen được mô tả trong hình 2.6 Các Mixen ở đây hoạt động như một pha tĩnh Các phân tử của chất mẫu (chất phân tích) được phân bố vào trong cả Mixen và cả ở ngoài Mixen (trong pha động) theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố kixácđịnh, trong những điều kiện nhất định đãđược chọn để chạy điện di và mỗi chất tan xisẽ có một hằng số phân bố kinhất định trong điều kiện đó Nếu các ki của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt

Phương pháp MECC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích Đối với các chất có điện tích, các Mixen loại này chuyển động hoặc là cùng chiều hoặc là ngược chiều với dòng EOF tùy thuộc vào điện tích của chất hoạt động bề mặt và cấu trúc của Mixen Các chất hoạt động bề mặt Anionic, ví dụ như SDS, sẽ di chuyển về Anốt (cực dương), nghĩa là ngược chiều với hướng của dòng EOF Trong dung dịch đệm điện di có pH trung tính và kiềm, khi dòng EOF di

19

chuyển nhanh hơn tốc độ của Mixen , thì sự điện di thực (net movement) của Mixen

là theo hướng của dòng EOF Trong khi di chuyển như thế, các Mixen có thể tương tác với các phần tử chất tan (chất phân tích) như kiểu phân bố của sắc ký cột lỏng rắn (R-LC) theo cả tương tác ưa nước, tương tác kị nước và tương tác tĩnh điện, để tạo ra quá trình sắc ký của các chất mẫu, khi chạy qua cột mao quản trong quá trình điện di

Đối với các phần tử chất tan trung tính, nó chỉ là sự phân bố của chất tan vào trong Mixen và ở ngoài Mixen (pha động điện di) theo một cân bằng động học có hằng số phân bố ki nhất định trong điều kiện đã chọn Chính sự phân bố theo kiểu cân bằng động học này gây ra sự lưu giữ khác nhau giữa các chất tan, và tạo ra sự tách sắc ký các chất phân tích theo kiểu Mixen Vì thế các Mixen trong ống mao quản của kỹ thuật tách này được gọi là pha tĩnh giả Nhiều chất tan tương tác với Mixen khá bền, nó tồn tại trong Mixen dài hơn (lâu hơn) sự di chuyển của nó, khi các Mixen mang nó (các chất tan trung tính) một phần đi ngược chiều của dòng EOF

Đối với các chất tan không tương tác với các Mixen, chúng được dòng EOF mang một cách đơn thuần cùng với dòng EOF Nhiều hợp chất kị nước tương tác rất

Hình 2.4 Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MECC

hệ sắc kí cột LC, và có bổ sung thêm một số yếu tố cho thích hợp và đúng đắn hơn cho hệ pha MECC

Hệ số lưu giữ:

Tỷ số giữa tổng số mol của chất tan (total moles of solute) ở trong Mixen (pha tĩnh giả) và tổng số mol của chất tan ở trong pha động (dung dịch đệm điện di) cũng được xem như là dung lượng của cột mao quản, và nó được biểu diễn theo công thức sau

ti - thời gian lưu của chất tan

t0 - thời gian không lưu giữ của chất

tmc - thời gian lưu của Mixen

ki - hệ số phân bố nhiệt động của chất tan giữa hai pha

Vmc - thể tích của pha Mixen

Vmp - thể tích của pha động

Và tỷ số q = Vmc

Vmp cũng được gọi là tỷ số pha của hệ MECC

Từ biểu thức (1) chúng ta cũng rút ra được thời gian lưu của chất tan tRnhư sau:

Nếu (tmc << t0*k’) thì chúng ta có:

21

ti = tmc 1 + ki′

ki′ (6) Nghĩa là thời gian lưu tRcó quan hệ chặt chẽ với hệ số dung tích ki’ Khi hệ số ki’lớn, thì thời gian lưu ti cũng lớn Mặt khác, trong MECC, tỷ số pha q phụ thuộc vào nồng độ của chất hoạt động bề mặt trong mao quản, và quan hệ này được biểu diễn bởi công thức sau đây

q = V ∗ Csp − Cmc

1 − Vmc ∗ Csp − Cmc (7) Trong đó:

V - điện thế sử dụng để tạo ra điện trường E của sự điện di

Csp - nồng độ của Mixen (mol/l)

Cmc - nồng độ giới hạn chuẩn của Mixen (mol/l)

Vmc - Tốc độ trung bình của Mixen

ki - hệ số phân bố của chất thứ i ở trong và ngoài Mixen

Khi nồng độ Mixen không lớn, thì hệ số dung tích ki’, và tốc độ của dòng EOF, được tính như sau:

ki′ = Ki ∗ Vmc Csp − Cmc (8)

VEOF = µe + µmc ∗ E (9) Cùng với các tham số tR, ki’, Rijđã nói ở trên, hệ số phân bố nhiệt động ki của chất tan trong hệ MECC cũng là một đại lượng quan trọng có liên quan đến các quá trình xảy ra trong mao quản và được xác định theo biểu thức sau:

lnki = ∆H0

RT +

∆S0

R (10) Trong đó: H0, S0 là Entanpi và Entropi tiêu chuẩn của chất tan R là hằng số khí,

và T là nhiệt độ (oK) của cột mao quản Biểu thức này cho chúng ta thấy hằng số phân bố Ki luôn luôn phụ thuộc vào nhiệt độ Nó cũng là một hằng số nhiệt động

Nhìn chung, chúng ta thấy khi nhiệt độ tăng thì hệ số phân bốkiđều giảm dần ở tất cả các chất Với các chất khác nhau, thì hệ số ki này cũng thay đổi rất khác nhau,

ký bị giảm Mặt khác với các ống mao quản có đường kính nhỏ (từ 25 - 100m), việc sử dụng từ trường điện thế V càng cao sẽ càng làm nóng mao quản Vì thế cần tránh dùng thế quá cao và cần phải điều nhiệt cho mao quản

Các chất hoạt động bề mặt dùng trong MECC có thể tương tác với thành ống mao quản và cũng có thể ảnh hưởng nhất định đến dòng EOF, làm thay đổi sự tương tác hấp phụ giữa chất tan và thành ống mao quản Hướng di chuyển của chất tan và của các Mixen cũng bị thay đổi trong sự phụ thuộc vào điện tích của Mixen

và tốc độ của dòng EOF Nói chung các hệ đệm điện di có pH tương đối cao, thường được sử dụng để duy trì dòng EOF có tốc độ đủ lớn và đảm bảo hướng di chuyển ổn định của các Mixen

Độ điện di và độ điện di hiệu dụng

Trong kỹ thuật MECC chất tạo Mixen có vai trò rất quan trọng, nó quyết định đến độ phân giải của quá trình tách Các hạt Mixen hình thành trong dung dịch điện

di đóng vai trò như pha tĩnh giả Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dung loại Natri dodecyl sunphat (SDS), tức là Mixen được hình thành bởi các phân tử SDS Theo lý thuyết, độ điện di tổng (toàn phần) của chất tan [5, 8]

μtot (i) = μef − μeof =L ∗ L1

ti∗ V (11)

23

Thời gian lưu của chất tan i là:

ti = L ∗ L1

μtot (i)∗ V (12) Trong đó:

V - điện thế được dùng đặt vào hai đầu ống mao quản (kV)

L1 - chiều dài hiệu dụng (68cm)

L - chiều dài tổng cộng của mao quản (73cm)

E - điện trường trong mao quản do thế V tạo ra Điện trường E này do thế V

(kV) đặt vào hai đầu ống mao quản và nó là lực chính điều khiển quá trình điện di của các chất và cả dòng EOF trong ống mao quản

Độ điện di hiệu dụng riêng µefcủa chất tan được tính theo công thức sau:

2.2.4 Mao quản và xử lý mao quản trước khi tách

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột mao quản silic nung chảy không phủđể tách các cấu tử chất kháng sinh β-lactam

Cột mao quản silic trần có các nhóm chức silanol đóng vai trò như axit yếu, có

pH = 6,8 ± 0,5, vì vậy nó có khả năng trao đổi ion Do khả năng trao đổi thấp, k’nhỏ, tương tác của chất tan và thành mao quản yếu nên tương tác này không ảnh hưởng nhiều đến phép phân tích điện di, đặc biệt là khi dung dịch đệm có nồng độ ion trung bình Tuy nhiên, khi chất phân tích là các chất hữu cơ có nhiều nhóm chức

có khả năng trao đổi đáng kể (thí dụ các protein), thì tương tác giữa chúng với thành mao quản trở nên đáng kể, thậm chí thuận nghịch

Trong kỹ thuật điện di việc sử dụng mao quản silica đường kính trong nhỏ hơn

100 µm sẽ làm mất ảnh hưởng của nhiệt jun sinh ra trong ống mao quản và do vậy mới cho phép áp vào hai đầu mao quản điện thế cao tới 20 - 30kV Hơn nữa kích thước mao quản sẽ rất thuận lợi khi phân tích những mẫu có hàm lượng nhỏ như mẫu huyết thanh Tuy nhiên, nếu mao quản có đường kính quá nhỏ thì thể tích mẫu

25

nạp cũng bị giới hạn, điều này lại ảnh hưởng đến độ nhạy phát hiện Khoảng đường kính trong của mao quản thường là 25 - 150µm Tốt nhất nên dùng mao quản cóđường kính trong từ 25 - 75µm Vì mao quản có ID lớn hơn 75µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên

cứu này có đường kính trong là 50µm

Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ lớn Về mặt lý thuyết, thế áp vào mao quản thông thường đảm bảo từ 200 - 600 V/cm là thích hợp Việc chọn chiều dài mao quản chỉ có tính chất định tính phụ thuộc vào khoảng cách từ lọ mẫu đến detector và từ detector đến lọ đệm và tùy thuộc vào hỗn hợp chất mẫu cần tách Mao quản của chúng tôi sử dụng là loại mao quản trần, có tổng chiều dài là 73cm, chiều dài hiệu lực là 68cm, high sense cell (có độ nhạy cao gấp 3 -5 lần so với cell thông thường) của hãng HP Để tạo flowcell trên mao quản, tại chiều dài 68cm tính

từ đầu mao quản loại bỏ lớp poliamit bằng cách đốt nóng một đoạn mao quản dài 2mm Sau đó dùng giấy mềm tẩm axeton hoặc etanol lau sạch và lắp vào hệ điện di Mao quản lần đầu tiên sử dụng được rửa lần lượt với NaOH 1M 10 phút, nước deion 10 phút và rửa với đệm chạy 30 phút Sau khi chạy từ 3-4 lần thì hoạt hóa lại cột, rửa với NaOH 0,1M 3 phút, nước deion 3 phút và đệm chạy 10 phút

2.2.4.1 Số đĩa lý thuyết của cột mao quản

Chúng ta biết rằng tốc độ của hạt có điện tích tỷ lệ với độ linh động điện di và điện trường ngoài, E

u = μ ∗ E (16) Như vậy, để di chuyển hết chiều dài (hiệu dụng) mao quản L1, từ đầu mao quản tới detector, hạt tích điện phải mất thời gian t như sau:

ti = L1

μi+ μeof ∗ E (17)

𝐍 = 𝛍𝐢 + 𝛍𝐞𝐨𝐟

𝟐𝐃𝐋 ∗ 𝐕 ∗ 𝐋𝟏 (𝟐𝟎) Trong đó: L là chiều dài của toàn bộ mao quản, L1 là chiều dài hiệu quả của mao quản từ đầu đến detector;E =VLlà điện trư ờ ng trong mao quản, trong đó V là điện áp cấp cho mao quản; µi là độ linh động của cấu tử i trong dung dịch vô cùng loãng

2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu

Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa mẫu vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động học (hydrodynamic) và phương pháp Xiphong (siphon) Trong đó phương pháp điện động học và thủy động học được dùng rộng rãi Nguyên tắc của phương pháp điện là đặt một thế nhất định trong một thời gian nhất định vào đầu của hai điện cực, một điện cực nhúng trong lọ mẫu và một điện cực kia nhúng trong lọ đệm Trong khi đó hai đầu của mao quản cũng được nhúng vào hai lọ mẫu và đệm nói trên Như thế những ion mẫu sẽ di chuyển vào mao quản tạo thành vùng mẫu đầu mao quản Ion nào có kích thước nhỏ, điện tích lớn sẽ được dẫn vào mao quản nhiều hơn Trong mẫu nếu có hai chất phân tích có cùng nồng độ nhưng điện tích khác nhau thì lượng ion của những chất này được dẫn vào mao quản khác nhau Do vậy nồng độ chấtphân tích được nạp vào mao quản sẽ khác so với nồng độ mẫu thực Sự sai khác này sẽ lớn nếu thời gian bơm mẫu dài Trong thực tế điều này không đáng ngại vì người ta có thể loại trừ bằng cách bơm mẫu trong thời gian ngắn

và ở những điều kiện như nhau trong mọi thí nghiệm nghiên cứu, thời gian bơm

27

mẫu ngắn ảnh hưởng đến độ nhạy Ngoài ra lượng mẫu bơm còn phụ thuộc vào độ dẫn của dung dịch mẫu, đặc biệt ở những mẫu có nồng độ muối cao mà ta không thể

biết trước được như những mẫu nước tiểu

Trong phươngpháp bơm mẫu thứ hai là bơm mẫu theo kiểu thủy động lực học bao gồm trong kiểu bơm mẫu này là bơm bằng áp suất hoặc xiphong Nguyên tắc của phương pháp xiphong dựa trên sự chênh lệch độ cao của hai đầu ống mao quản được đặt cao thấp khác nhau một khoảng H, một đầu nhúng vào lọ chứa mẫu và đầu kia nhúng vào lọ chứa đệm để mẫu tự xiphong vào ống mao quản trong thời gian nhất định Như thế mẫu nạp vào được đặt ở đầu mao quản cao Phương pháp này đơn giản nhưng khi nạp một lượng mẫu nhỏ cỡ vài nl thì khó chính xác và áp dụng cho những hệ điện di tự tạo đơn giản, độ lặp lại kém Vì vậy ít được dùng Phương pháp bơm mẫu bằng áp suất là dùng một áp suất thích hợp để nén vào

lọ chứa mẫu và tạo chân không phía đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định Do lực áp suất đẩy và hút mà một lượng mẫu sẽ được bơm vào đầu mao quản

Áp suất hay được dùng từ 50 - 300mbar Mẫu được bơm vào sẽ có nồng độ đều và giống với nồng độ của chất tan trong mẫu phân tích Trong phương pháp này chúng tôi chọn bơm mẫu theo phương pháp thủy động lực học với áp suất là 50mbar và cách bơm mẫu này sẽ được dùng trong suốt quá trình thí nghiệm

2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản

Trang thiết bị của hệ: Theo nguyên tắc, để thực hiện điện di, hệ thống máy phải có các bộ phận chính như sau:

1 Buồng điện cực, bình điện di và các điện cực trơ (Au hay Pt),

2 Cột tách sắc ký (cột mao quản hay gọi tắt là mao quản),

3 Nguồn cấp thế cao một chiều (15- 40kV), tạo lực điện trường E, để điều khiển quá trình điện di (sắc ký) của các chất,

4 Bộ phận nạp mẫu vào mao quản (cột tách),

5 Bộ phâ ̣n phát hiê ̣n các chất sau khi tách (detector),

6 Bộ phận điều nhiệt cho mao quản (thường làm mát bằng không khí),

7 Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách của các chất trong hỗn hợp mẫu

28

2.2.7 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản

Sắc kýđiện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từđơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy

ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân biệt và

sử dụng chúng cho thích hợp Cụ thể các kiểu đó là:

1 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE)

2 Điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF)

3 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP)

4 Điện di mao quản Gel (Capillary Gel Electrophoresis - GCE)

5 Sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (Micellar electrophoresis capillary chromatography - MECC)

2.2.8 Phân tích định lượng trong phương pháp điện di mao quản

Theo lý thuyết sắc ký, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất Còn chiều cao H của pic sắc ký hay diện tích S của pic là có liên quan chặt chẽ đến nồng độ

Cxcủa chất Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta luôn có biểu thức xác định mối quan hệ đó là:

Hi = ki∗ Ci (21)

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

29

và Si = k2 ∗ Ci (22)

Trong đó: Hi, Si - chiều cao và diện tích của pic sắc ký của chất i

Ci - nồng độ của chất ứng với thời gian lưu tRi

k1, k2 - hằng số điều kiện thực nghiệm

Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật CE, chúng ta dựa theo phương

trình cơ bản trên và có thể dùng một trong hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm tiêu chuẩn để xác định nồng độ chất

phân tích trong mẫu

2.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng cho các đối tƣợng mẫu sinh học

2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extraction-SPE)[8]

Chiết pha rắn (SPE) là một phương pháp chuẩn bị mẫu để làm giàu và làm sạch chất phân tích từ dung dịch bằng cách hấp phụ lên một cột pha rắn, sau đó chất phân tích được rửa giải (giải hấp) bằng một dung môi thích hợp Cơ chế của quá trình lưu giữ gồm pha đảo, pha thường và trao đổi ion Ưu điểm của phương pháp SPE là hiệu suất thu hồi cao, khả năng làm sạch chất phân tích lớn, dễ tự động hóa, lượng dung môi sử dụng ít và có thể kết hợp tốt với phương pháp điện di mao quản (CE) SPE ra đời từ những năm 1970 và dần dần thay thế phương pháp chiết lỏng-lỏng

Quá trình chiết pha rắn gồm 4 bước chính như sau:

B1.Hoạt hóa cột B2 Nạp mẫu B3. Rửa giải B 4 Rửa chiết

30

Hình 2.6 Sơ đồ các bước trong quá trình chiết pha rắn

Bước 1: Hoạt hóa chất hấp phụ pha rắn Cho dung môi chảy qua chất hấp phụ

để làm ướt vật liệu nhồi và solvat hóa các nhóm chức của chất hấp phụ, đồng thời đẩy không khí ra khỏi cột Dung môi điển hình cho quá trình hoạt hóa là methanol, sau đó được thay bằng nước hoặc dung dịch đệm Nước và dung dịch đệm được sử dụng để hoạt hóa cột với mục đích làm cho cơ chế hấp phụ hoạt động có hiệu quả đối với các mẫu là dung dịch nước

Bước 2: Nạp mẫu vào cột chiết, cho một thể tích mẫu nhất định vào cột Tùy

theo kích thước cũng như loại mẫu, có thể áp dụng phương pháp chảy bình thường hay sử dụng áp suất Trong quá trình nạp mẫu, chất phân tích có thể cùng với một vài chất khác được giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt

Cơ chế lưu giữ chất ở đây là theo lực Van de walls, liên kết hydrô, tương tác lưỡng cực-lưỡng cực, trao đổi cation, trao đổi anion

Bước 3: Loại bỏ tạp chất gây ảnh hưởng đồng thời giữ lại chất phân tích Nếu

nền mẫu là dung dịch nước, cần phải sử dụng dung dịch đệm hoặc hổn hợp dung môi hữu cơ Nếu mẫu bị hòa tan trong dung môi hữu cơ thì khi rửa giải có thể

nước-sử dụng chính dung môi hữu cơ đó

Bước 4: Là bước giải hấp chất phân tích khỏi cột bằng dung môi thích hợp,

dung môi được chọn phải đặc trưng để phá vỡ tương tác giữa chất phân tích và chất

.Rửa giải các tạp chất

Chất phân tích

31

hấp phụ với mục đích rửa giải được chất phân tích Dung môi sử dụng rửa giải càng

ít chất (các chất này cũng bị hấp phụ trên cột) càng tốt Về nguyên tắc không nên sử dụng dung môi có khả năng chiết tách quá mạnh vì có thể lôi kéo theo cả những chất không mong muốn trong quá trình giải hấp Ngược lại nếu khả năng chiết tách của dung môi quá yếu thì sẽ phải sử dụng một lượng dung môi lớn mới có thể giải hấp hết các chất phân tích trên cột

Chọn cơ chế chiết SPE theo mẫu phân tích [12]

Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu trong dung môi nước:

Với các mẫu nước, việc quyết định sử dụng hợp chất hấp phụ nào là dựa vào đặc tính phân cực và đặc tính ion của chất phân tích quan tâm Nếu chất phân tích là ion và phân cực thì nên sử dụng chất hấp phụ có tính trao đổi ion Trong trường hợp chất phân tích phân cực mà không có tính ion thì tốt nhất nên sử dụng chất hấp phụ theo nguyên tắc pha đảo (ví dụ C18) Còn nếu chất phân tích không phân cực, thì việc chọn pha đảo với chất hấp phụ C8 hoặc C18 là phương án tối ưu

- Cơ chế SPE cho phép phân tích mẫu không phải mẫu nước:

Hình 2.7 Cơ chế SPE phân tích các mẫu nước

32

Với các mẫu này, việc quyết định sử dụng chất hấp phụ nào hơi ngược lại cho với trường hợp trên Nếu chất phân tích là phân cực và là ion thì hiệu suất thu hồi tốt nhất là sử dụng chất hấp phụ trao đổi ion (tương tự trường hợp trên) Nếu chất phân tích mang tính phân cực nhưng không phải là ion thì chất hấp phụ sử dụng trên

cơ sở pha đảo hoặc pha thường Sự lựa chọn này tùy thuộc vào dung môi hữu cơ phân cực hay không phân cực tương ứng và cuối cùng, nếu chất phân tích không phân cực thì chất hấp phụ lựa chọn theo nguyên tắc pha đảo

2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) sử dụng chochấtphân tích trong các đối tƣợng mẫu sinh học[34]

Chiết pha rắn (SPE) với pha tĩnh kết hợp giữa cơ chế chiết pha đảo và tương tác ưa nước (hydrophilic-lypophilic water-wettable revered phase)đã được áp dụng rất hiệu quả trong phân tích các đối tượng mẫu sinh học nói chung và mẫu nước tiểu nói riêng

Hình 2.8 Cơ chế SPE phân tích các mẫu không phải mẫu nước

33

Hình 2.9Cấu trúc của pha tĩnh cột SPE dùng cho các mẫu sinh học

Oasis® HLB (hydrophilic-lipophilic balance) là một chất hấp phụ kết hợp cơ chế tương tác pha đảo và tương tác ưa nước Pha tĩnh này được trùng hợp từ hai monomer có tỷ lệ bằng nhau là N-vinylpyrolidone có tính ưa nước và divinylbenzen

có tính kỵ nước Chất hấp phụ Oasis có cấu trúc không gian lớn (thể tích lổ rổng là 1,3 cm2/g), có diện tích bề mặt trên một đơn vị khối lượng pha tĩnh cao(810 m2/g) Các nhóm chức phân cực của monomer N-vinylpyrolidone đã tạo ra các hốc phân cực nên pha tĩnh Oasis có hệ số lưu giữ đối với các chất phân tích phân cực cao hơn

3 lần so với cột C18 truyền thốngđồng thời có khả năng làm việc trong khoảng pH rộng

Hình 2.10 So sánh yếu tố lưu giữ (K ’ ) giữa cột C 18 và cột Oasis ® HLB

34

Pha tĩnh Oasis có khả năng lưu giữ tốt các thành phần phân cực, các hợp chất acid, bazơ và cả trung tính, rất thích hợp để chiết và làm giàu các đối tượng thuốc trong mẫu máu và mẫu nước tiểu như kháng sinh β-lactam, các sulfonamids, các quinolones

- Máy trắc quang UV – 1601PC của hãng Shimadzu

- Máy đo pH TITROLINE của hãng SCHOTT – Đức

- Bể siêu âm, máy ly tâm, hệ thống bơm chân không, cân phân tích, giấy lọc 0,45μm; 0,2μm của hãng Millipore (USA)

- Các dụng cụ thí nghiệm thông dụng khác của Phòng thí nghiệm phân tích

Hình 2.11 Sơ đồ tổng quát chiết SPE với cột Oasis ® HLB với các mẫu sinh học

35

2.4.2 Hóa chất

- Các chất chuẩn PENG (Na), AMP.3H2O, AMO.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O,

OXA do Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế (48 Hai Bà Trưng – Hà Nội) cung cấp

- Sodiumdodecylsulfat (SDS), axít Boric H3BO3, muối amonium format (HCOONH4), muối natri tetraborat Na2B4O7.10H2O, natridihydrophosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O), natrihydrophosphat (Na2HPO4)… của hãng Merk (Đức)

- Nước deion được lọc qua giấy lọc 0,45µm của hãng Millipore (USA)

- Đệm Borat được pha từ axit boric H3BO3, muối natri tetraborat

Na2B4O7.10H2O với nước deion Dung dịch được siêu âm 10 phút, lọc qua giấy lọc kích thước lỗ 0,2μm và định mức tới thể tích mong muốn Điều chỉnh pH bằng dung dịch NaOH và H3BO3, giá trị pH thay đổi cho phép ± 0,05 Dung dịch được bảo quản ở nhiệt độ thường

- Dung dịch chuẩn được pha trong nước deion từ các chất chuẩn sau đó đem siêu âm 15 phút được dung dịch nồng độ 1000mg/l Dung dịch 1000mg/l được pha loãng 10 lần thành 100mg/l(1000mg/l bảo quản trong 2 tháng và 100mg/l bảo quản

1 tháng) Các dung dịch nồng độ thấp được pha từ dung dịch 100mg/l và sử dụng trong ngày Dung dịch được bảo quản trong tủ lạnh 40C, tránh ánh sáng trực tiếp

6,8 Phổ thu được thể hiện hình 3.1

Hình 3.1 Phổ hấp thụ của các β-Lactam (nồng độ 10mg/l )

Các hệ đệm đa axit hay đa bazơ có nhược điểm là có hấp thụ quang trong vùng

UV hay UV-VIS gây khó khăn phát hiện chất.Vì thế phải quét phổ các chất đệm,

xem xét sóng đo thích hợp để hạn chế ảnh hưởng