nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM NHO NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN Chuyên ngành: Hóa Phân tích Mã số: 1.04.03 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Hà nội-2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I – TỔNG QUAN 2 1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam 2 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 6 1.3 Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam 8 1.3.1 Phương pháp quang học 8 1.3.2 Phương pháp điện hóa 9 1.3.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 9 1.3.4 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 12 CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng 13 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 13 2.2 Giơ ́ i thiê ̣ u chung về phương pha ́ p Điê ̣ n di mao qua ̉ n 13 2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 13 2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản 14 2.2.2.1 Độ linh động điện di và độ linh động điện di thẩm thấu 14 2.2.2.2 Dòng điện di thẩm thấu (EOF) và tính chất 15 2.2.3 Phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) 17 2.2.4 Mao quản và ử lý mao quản trước khi tách 24 2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu 26 2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản 27 2.2.7 Phân loại các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản 28 2 2.8Phân tích định lượng bằng phương pháp điện di mao quản 28 2.3.1 Kết hợp kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu sinh học 29 2.3.1 Tổng quan chiết pha rắn (solid phase extration-SPE) Thực nghiệm 29 2.3.2 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE) dùng trong phân tích các đối tượng trong mẫu sinh học 32 2.4. Thực nghiêm 31 2.4.1 Máy móc dụng cụ 34 2.4. Hóa chất 35 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Nghiên cứu khảo sát tối ưu điều kiện tách β-Lactam 36 3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện chất 36 3.1.2 Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di 37 3.1.6 Ảnh hưởng của thành phần dung dịch đệm 40 3.1.7 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm 41 3.1.8 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất tạo mixen SDS 43 3.1.9 Khảo sát ảnh hưởng thời gian bơm mẫu 47 3.1.10 Khảo sát ảnh hưởng thế điện di 49 3.1.11 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ mao quản 52 3.1.12 Tổng kết điều kiện tối ưu 54 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích 55 3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩn 55 3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của đường chuẩn 58 3.2.3 Độ chính xác của phép đo 59 3.2.4 Độ lặp lại của phép đo 62 3.3 Phân tích mẫu thực 64 3.3.1 Khảo sát điều kiện SPE mẫu nước tiểu thêm chuẩn 64 3.3.1.1 Chọn cột chiết pha rắn các β-lactam trong mẫu nước tiểu 64 3.3.1.2 Khảo sát lực rửa giải của hệ các dung môi 64 3.3.1.3 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 66 3.3.1.4 Khảo sát pH rửa giải 67 3.3.2 Phân tích mẫu nước tiểu lấy từ người tình nguyện 70 3.4 Ưu nhược điểm của phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu mixen (MECC) 71 3.5 Hướng phát triển của đề tài 72 CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN 73 1. Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy điện di 73 2. Đánh giá phương pháp phân tích 73 3. Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu nước tiểu 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Phụ lục 79 1 MỞ ĐẦU Ngày nay, khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khỏe của con người ngày càng được chú trọng đặc biệt là các sản phẩm liên quan trực tiếp đến sức khỏe. β-lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu trên thị trường vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Tuy nhiên sử dụng loại kháng sinh này không đúng liều lượng và cách dùng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa trị bệnh càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có các bệnh do virut không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc chẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng sức khỏe của người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh trong máu gây ra các bệnh về thận, đặc biệt ở người cao tuổi. Vì vậy kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Hai phương pháp dùng thường dùng để phân tích các β-lactam là HPLCvà phương pháp Điện đi mao quản (CE). Phương pháp HPLC làphương pháp tách có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có nhược điểm là phải sử dụng một lượng lớn dung môi trong quá trình phân tích, vì vậy làm cho giá thành phân tích cao. Ngược lại, phương pháp CE lại sử dụng lượng hóa chất không đáng kể, tiết kiệm chi phí từ 3-4 lần, lượng mẫu bơm nhỏ hơn trong HPLC hàng trăm lần, cỡ nl, cho độ tin cậy cao.Ở Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu tách và xác định đồng thời các kháng sinh β-lactam trong các mẫu dược phẩm, sinh học, thực phẩm và môi trường bằng kỹ thuật HPLC nhưng với kỹ thuật điện di mao quản thì chưa nhiều. Với những lý do nêu trên, tôi chọn đề tài nghiên cứu luận văn là: “Nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản” 2 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,35] Là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng β-Lactam. Gồm các nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin. Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA). Các cephalosporin tự nhiên được phân lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các kháng sinh thiên nhiên. Cấu trúc và phân loại: * Các penicillin Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin, vòng β- Lactam N S CH 3 CH 3 N H O CO R COOM 2 3 4 1 56 7 Tên gọi chung công thức của các penicillin khi chưa có gốc R là:(2S,5R,6R3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Khi thay thế R bằng các gốc khác nhau, những cacbon bất đối có cấu hình 2S, 5R, 6R ta có các penicilin có độ bền, dược động học và phổ kháng khuẩn khác nhau. Với M là gốc cation thường là: K, Na, H. Nhóm kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với hoạt tính khác nhau. Hình 1.1 Công thức cấu tạo các kháng sinh penicillin 3 Bảng 1.1 Phân loại và cấu trúc một số penicillin Tên kháng sinh R Hoạt tính Nhóm penicillin tựnhiên Penicillin G (PENG) Benzathin CH 2 - Benzyl Gồm các Penicillin tự nhiên và dẫn xuất.Phổ hẹp: vi khuẩn gram(+). Không kháng β- lactamase Nhóm penicillin kháng penicilliiase Oxacillin (OXA) N C- O CH 3 6-[(5- methyl-3-phenyl-1,2-oxazole-4- carbonyl)amino] Là các Penicillin bán tổng hợp. Phổ hẹp như nhóm I. Kháng penicilliiase, không tác động vào vòng β- lactam được. Cloxacillin (CLO) Cl N O C- CH 3 6-{[3-(2- chloropheny )-5-methyl- oxazole-4-carbonyl]amino} Nhóm penicillin phổ rộng Ampicillin (AMP) CH- NH2NH2 6-([(2R)-2- amino-2-phenylacetyl]amino) Phổ rộng, tác dụng cả khuẩn gram (+) và (-). Không kháng β- lactamase và penicilliiase Amoxicillin (AMO) CH- NH2NH2 HO 6-{[(2R)-2- amino-2-(4-hydroxyphenyl)- acetyl]amino} 4 * Các cephalosporin Các cephalosporin có cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng β-lactam 4 cạnh gắn với 1 dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R. N H O CO R1 N S R3 R2 COOM 1 2 3 4 5 6 7 8 Tên gọi chung của các cephalosporin khi chưa có gốc R là:(6R,7R) 8-oxo-5- thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Khi thay các gốc R, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R được các cephalosporin có độ bền, tính kháng khuẩn và dược động học khác nhau. Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ. Các cephalosporin thế hệ trước tác dụng trên vi khuẩn gram dương mạnh hơn, nhưng trên gram âm yếu hơn thế hệ sau. Trong bản luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày thế hệ I (CEP) và thế hệ III (CEF). Bảng 1.2 Phân loại và cấu trúc một số cephalosprin Thế hệ Kháng sinh R 1 R 2 R 3 I: Phổ tác dụng trung bình, tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn gram (+), yếu nhất trên gram (-). Không bền và dễ bị β-lactamase phá hủy Cephalexin (CEP) CH- NH 2 -H -CH 3 Hình 1.2 Công thức cấu tạo các kháng sinh cephalosporin 5 III: Tác dụng tốt trên vi khuẩn gram (-), trên vi khuẩn gram (+) thì tác dụng kém penicillin và cephalosporin thế hệ I. Bền với β-lactamase Cefixim (CEF) S N N NH 2 HOOCCH 2 O -H -CH=CH2 Tính chất:Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước, dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –COOH và –NH 2 . Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ). Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pK a = 2,5–2,8 tùy vào cấu trúc phân tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng. Bảng 1.3 Hằng số axit của các kháng sinh nghiên cứu Tên kháng sinh pk a1 Tên kháng sinh pk a1 Tên kháng sinh pk a1 PEN 2,74 AMO 2,8 CLO 2,7 AMP 2,7 CEP 2,6 OXA 2,72 Tác dụng: Cơ chế Các penicillin có khả năng acyl hóa các D-alanin tranpeptidase, làm cho quá trình tổng hợp peptidoglycan không được thực hiện. Sinh tổng hợp vách tế bào bị 6 ngừng lại. Ít tác dụng trên vi khuẩn gram (-). Mặc khác, các penicillin còn hoạt hóa enzym tự phân giải murein hydroxylase làm tăng phân hủy vách tế bào, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt. Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của mang tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn. Các kháng sinh β-lactam có hoạt phổ rộng. Kháng thuốc Vi khuẩn sinh ra các β-lactamase, là các enzim có tác dụng mở vòng β-lactam, theo phản ứng ái nhân vào nhóm C=O, làm kháng sinh mất tác dụng. Tất cả các cách kháng không sinh ra β-lactamase để thực hiện gọi là kháng gián tiếp (được gọi là kháng methicillin). Độc tính Các kháng sinh β-lactam độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc: dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ. Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và trong thời kỳ cho con bú. Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc. 1.2 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách. Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales [4,29], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không [...]... 1 Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE) 2 Điện di mao quản điểm đẳng điện (Isoelectric focusing - IFF) 3 Điện di mao quản đẳng tốc độ (Isotachophoresis - ITP) 4 Điện di mao quản Gel (Capillary Gel Electrophoresis - GCE) 5 Sắc ký điện di mao quản điện động học kiểu micelle (Micellar electrophoresis capillary chromatography - MECC) 2.2.8 Phân tích định lƣợng trong phƣơng pháp điện. .. của toàn bộ mao quản, L1 là chiều dài hiệu quả của mao V L quản từ đầu đến detector; E = là điệ trưg trong mao quả, trong đó V là điện áp n ờ n n cấp cho mao quản; µi là độ linh động của cấu tử i trong dung dịch vô cùng loãng 2.2.5 Chọn phƣơng pháp bơm mẫu Trong kỹ thuật điện di mao quản có thể đưa mẫu vào mao quản bằng ba phương pháp là phương pháp điện động học (electrokinetic), phương pháp thủy động... theo một cân bằng động học, có hằng số phân bố ki xácđịnh, trong những điều kiện nhất định đãđược chọn để chạy điện di và mỗi chất tan xisẽ có một hằng số phân bố kinhất định trong điều kiện đó Nếu các ki của các chất tan là khác nhau rõ rệt thì sẽ có được kết quả sắc kí điện di tốt Phương pháp MECC dùng để tách các chất phân tích có điện tích và không có điện tích Đối với các chất có điện tích, các Mixen... chọn là phương pháp điện di mao quản điện động học mixen (MECC) 2.2.1Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di mao quản - Nguyên tắc của sự tách: là dựa trên cơ sở tính chất điện di (sự di chuyển mobility) của các phần tử chất tan (các ion chất tan, chất phân tích) trong mao quản (đường kính 25-100m ID) trên nền của dung dịch chất điện giải và có chất đệm pH thích hợp, dưới tác dụng của một từ trường điện E... của mao quản cũng ảnh hưởng nhiều tời dòng EOF, người ta thấy rằng đối với mao quản nhỏ trong vùng 25-50µm, sự thay đổi đường kính mao quản không ảnh hưởng tới dòng EOF Tuy nhiên khi đường kính mao quản lớn hơn 50µm thì khi tăng đường kính mao quản sẽ làm giảm dòng EOF, thậm chí d > 200µm dòng EOF có thể mất hẳn 2.2.3 Phƣơng pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MECC) Phương pháp điện di mao. .. hệ điện di mao quản 2.2.7 Sự phân loại hay các kiểu (mode) của phƣơng pháp điện di mao quản Sắc k điện di mao quản rất đa dạng, nhiều kiểu, từđơn giản đến hoàn chỉnh và phức tạp, nhưng tuỳ theo cơ chế, bản chất, và đặc điểm của sự tách (sự điện di) xảy ra trong ống mao quản mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu (mode) khác nhau, và gán cho mỗi kiểu một tên riêng, để dễ hiểu, hay phân. .. tượng phân tích mà chúng tôi chọn để nghiên cứu là penicillin(PENG), cloxacillin(CLO), oxacilin(OXA) ampicillin(AMP), amoxicillin(AMO) và cephalexin(CEP)là các kháng sinh β-lactam được sử dụng phổ biến hiện nay 2.1.2Nội dung nghiên cứu Nội dung đề tài cần giải quyết là: - Lựa chọn phương pháp nghiên cứu là phương pháp điện di mao quản mixen (MECC) với detector Diod Array (DAD) có độ nhạy cao - Nghiên cứu. .. nên dùng mao quản cóđường kính trong từ 25 - 75µm Vì mao quản có ID lớn hơn 75µm thường cho hiệu ứng nhiệt Iun lớn và khó khống chế nhiệt độ mao quản khi điện di Để phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này có đường kính trong là 50µm Chiều dài mao quản cũng là yếu tố quan trọng, vì muốn áp thế cao vào hai đầu mao quản thì chiều dài mao quản phải đủ... các ion mang điện tích dương tiếp theo là các phân tử trung hòa, đi sau cùng là các ion mang điện tích âm Hình 2.2 Lớp điện kép trong mao quản silic 16 Tính chất của dòng EOF Dòng EOF di chuyển trong mao quản được điều khiển bằng điện trường cho nên tính chất khác so với dòng EOF được điều khiển bằng áp suất Lực tác động lên các chất điện li trong dung dịch nền rất đồng đều, hơn nữa mao quản không có... nhạy cao - Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách một số kháng sinh -lactam như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ… - Nghiên cứu điều kiện chiết pha rắn; tách và làm giàu-lactam từ nước tiểu - Đánh giá thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích một số mẫu nước tiểu - Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp 2.2Giớ i thiêu chung về phƣơng pháp Điên di mao quản [5,8,22] ̣ ̣ Để thực . lý mao quản trước khi tách 24 2.2.5 Chọn phương pháp bơm mẫu 26 2.2.6Thiết bị của phương pháp điện di mao quản 27 2.2.7 Phân loại các kiểu (mode) của phương pháp điện di mao quản 28 2 2. 8Phân. nghiên cứu 13 2.2 Giơ ́ i thiê ̣ u chung về phương pha ́ p Điê ̣ n di mao qua ̉ n 13 2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp điện di mao quản 13 2.2.2 Các đặc trưng của phương pháp điện di mao quản. chọn đề tài nghiên cứu luận văn là: Nghiên cứu điều kiện phân tích β-lactam bằng phương pháp điện di mao quản 2 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh β-lactam [1,2,10,35]