nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của triterpenoit khung lupan ’’ thành “ nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường glibenclamide và metformin hydrochloride

Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được... Glucovance thuốc tổ hợp của glibenclamide và metformin dùng để chữa bệnh tiểu đường c

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



NGUYỄN HOÀNG MINH HUỆ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ 4-FORMYLSYDNONE TETRA-O- ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL

THIOSEMICARBAZON THẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

GS TS Nguyễn Văn Tuyến

Hà Nội-2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn

GS.TS Nguyễn Văn Tuyến và T.S Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận

tình hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Hóa Dược, cử nhân

Nguyễn Bích Thuận, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Thị Phương đã giúp đỡ em rất

nhiều trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên, các em sinh viên phòng

Hóa Dược, các bạn học viên lớp K22- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ

tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè tôi -

những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian

học tập và thực hiện luận văn này

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DM1 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH DM2 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DM3 MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1.Khái quát về bệnh tiểu đường 3

1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đường 3

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết 3

1.1.2.1.Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin: 3

1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin 4

1.1.2.3.Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym -glucosidase) 4 1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường 5

1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường 5

1.2 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Glibenclamide 5

1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride 7

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 7

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 8

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM 11

2.1.Hóa chất và thiết bị 11

2.1.1.Hóa chất và dung môi 11

2.1.2 Thiết bị xác định cấu trúc 11

2.1.3 Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được 12

2.2.Tổng hợp Glibenclamide 12

2.2.2 Tổng hợp chất trung gian (4) 13

2.2.3 Tổng hợp Glibenclamide (5) 14

2.2.4 Phân tích hàm lượng sản phẩm glibenclamide (5) theo tiêu chuẩn dược điển châu Âu 2002 15

2.3.Tổng hợp Metformin hydrochloride 15

2.3.1 Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride 16

2.3.1.1 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton 16

2.3.1.2 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH 17

2.3.1.3 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH 17

2.3.2.Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride 17

2.3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 18

2.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.2.3 Kết quả nghiên cứu 18

2.3.3.Nghiên cứu hàm lượng metformine hydrochloride theo phương pháp HPLC-MS) 19

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Tổng hợp Glibenclamid 22

3.2 Tổng hợp metformine hydrochloride 28

3.2.1 Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride 29

3.2.2 Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride 30

3.2.3 Hàm lượng metformin hydrochloride theo phương pháp HPLC 31

KẾT LUẬN 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

PHỤ LỤC 38

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13C- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic

Resonance) DMSO Dimethyl sulfoxide

1H- NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic

Resonance) HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS Phổ khối lượng va chạm điện tử ( Electron Impact-Mass

Spectrometry)

H, C Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm Phần triệu ( parts per million )

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 2.1 Kết quả thử đô ̣c tính cấp của metformine hydrochloride 19

Hình 2 1 Biểu đồ về mối tương quan giữa liều dùng và số chuô ̣t chết 19

Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4) 23

Hình 3.2: : Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4) 24

Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide (5) 25

Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) 26

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride 28

Hình 3.7: : Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride 29

Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride 32

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamide 7

Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidin 8

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride 8

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro 9

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi 9

Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin 9

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin 10

Sơ đồ 3.1 Tổng hợp glibenclamide 22

Sơ đồ 3.2: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride……… 27

MỞ ĐẦU

Tiểu đường là căn bệnh nguy hiểm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm trọng sức khoẻ con người và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu đường tuýp II (chiếm tới 90-95%) Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đường, tử vong của bệnh này đứng hàng thứ tư ở các nước phát triển, bệnh có thể gây nhiều tai biến nguy hiểm như: mù loà và giảm thị lực ở người trưởng thành; đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn người bình thường từ 15-40 lần; suy thận giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những biến chứng tim mạch nguy hiểm Theo ước tính, hiện thế giới có 194 triệu người mắc bệnh tiểu đường chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ước tính đến năm

2025 số người bị bệnh tiểu đường sẽ là 333 triệu người Theo thống kê năm

2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5 triệu người) và 7,2% tại các thành phố lớn TP Hồ Chí Minh có hơn 800.000 người mắc bệnh Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, glibenclamide và metformin là một trong hai thuốc tiểu đường duy nhất sử dụng theo đường uống chữa bệnh tiểu đường tuýp II Glibenclamide và metformin được dùng riêng rẽ hoặc dùng tổ hợp với nhau Glucovance (thuốc tổ hợp của glibenclamide và metformin) dùng để chữa bệnh tiểu đường có đường huyết cao Glibenclamide kích thích tuyến tụy tiết insulin còn metformin làm chậm hấp thụ đường trong ruột non; ngăn cản gan chuyển đường dự trữ vào trong máu và giúp cơ thể sử dụng insulin tự nhiên hiệu quả hơn Vì vậy, sử dụng glucovance rất hiệu quả và ít gây phản ứng phụ.Như vậy nếu tổng hợp được glienclamide và metformin thì chúng ta có thể chủ động sản xuất được hai loại thuốc thiết yếu nhất để chữa bệnh tiểu đường túyp II, làm tăng thêm sự lựa chọn, tăng tính hiệu quả của việc chữa bệnh tiểu đường và chủ động sản xuất thuốc generic chữa bệnh tiểu đường giá rẻ ở Việt nam

Vì vậy,chúng tôi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường glibenclamide và metformin hydrochloride” có

ý nghĩa rất lớn về khoa học và thực tiễn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1.Khái quát về bệnh tiểu đường

1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường được chia thành hai loại như sau:

Tiểu đường tuýp 1: Tiểu đường túyp 1 là một bệnh tự miễn trong đó hệ

thống miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin của đảo tuỵ Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thường dẫn đến các biến chứng mãn tính

Tiểu đường túyp 2: Bệnh tiểu đường túyp 2 được đặc trưng bởi kháng

insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose máu bình thường

Các túyp tăng đường huyết đặc hiệu khác:

- Đái tháo đường thai kỳ

- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào 

- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin

- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết

1.1.2 Các thuốc điều trị bệnh tăng đường huyết

Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đường được chia thành 3 nhóm chính như sau:

- Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin

- Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

- Các thuốc chống tăng đường huyết sau bữa ăn

1.1.2.1.Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:

+ Insulin:

Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trò chủ yếu trong cơ chế điều hoà đường huyết của cơ thể Insulin là một trong những hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng

lượng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống Tác dụng của insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hưởng cuối cùng là trên chuyển hoá glucid, lipid và protid

+ Thuốc kích thích bài tiết insulin

Các sulfonylurea

Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đường huyết của dẫn suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thương hàn Từ phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của các sulfonylurea đã được tiến hành Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của thuốc Nhiều thuốc thuộc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II (Glyburide, Glypizide) Các thuốc này đang được sử dụng rộng rãi trên lâm sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho người bệnh

1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin

1.1.2.3.Thuốc chống tăng đường huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase)

-Acarbose:

Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột

Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm quá trình hấp thụ tinh bột, dextran và các disaccharide ở ruột non, tránh được tình trạng tăng đường huyết sau ăn Thuốc có tác dụng tốt cho cả 2 tuýp bệnh

1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đường

Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều

1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường

Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đường chủ yếu là các thuốc có

nguồn gốc từ dược liệu như sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch, Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mướp đắng (Momordica charantia L.Cucurbitaceae), hoàng kỳ (Astragalus

membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,

Scrophulariaceae)

1.2 Thuốc chữa bệnh tiểu đường Glibenclamide

Glibenclamide là thuốc chữa bệnh tiểu đường thuộc vào nhóm sulphonylure Các hợp chất thuốc thế hệ một của loại thuốc này được phát hiện từ những năm 1950 như: tolbutamide (1956), acetohexamide (1964), tolazamide (1961), chlopropamide (1959) Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai phải kể đến như: glibenclamide (1971), glipizide, glimepiride(1999)

Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai có hiệu quả ở liều thấp nhờ sự tăng sự hấp thụ qua màng tế bào beta Sulphonylure được liên kết với thụ thể của nó trong

tế bào beta của tuyến tuỵ Hoạt tính chống bệnh tiểu đường của các chất này phụ thuộc vào ái lực của các thuốc sulphonylure với thụ thể của nó Cơ chế hoạt động của lớp thuốc này chủ yếu được giải thích bới sự kìm hãm của các kênh KATP khởi xướng sự tiết insulin Sự thành công của việc phát hiện ra những chất sulphonylure có ái lực cao và chọn lọc vào thụ thể của sulphonylure như là glibenclamide mất 27 năm sau khi phát hiện ra chất đầu

tiên có hoạt tính hạ đường huyết và phải tổng hợp khoảng 12000 dẫn chất của

nó để sàng lọc, nghiên cứu mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc

Ngoài glibenclamide, một số thuốc thế hệ thứ hai như đã đề cập ở trên cũng được phát hiện Tiếp đó đã có một số nhóm nghiên cứu tổng hơp các chất trên cơ sở khung sulphonylure để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học Một số dẫn của nhóm diarylylsulphonylure có hoạt tính chống ung rất mạnh Có rất nhiều nghiên cứu về quan hệ hoạt tính chống ung thư và cấu trúc của lớp chất này Tuy nhiên, hoạt tính chống bệnh đái tháo đường của lớp chất diarylylsulphonylure không thể hiện rõ Ngoài việc nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính của các dẫn chất glibenclamide thì những nghiên cứu về cơ chế và tìm hiểu sâu sắc về bản chất của thụ thể của nó cũng được nghiên cứu nhiều

Năm 1995, 26 năm sau khi phát hiện glibenclamide có ái lực cao với thụ thể của nó ở tuyến tuỵ người ta đã nhân dòng và phát hiện ra thụ thể của nó là thành phần của protein ABC vận chuyển liên họ Gần đây người ta đã phát hiện rằng thụ thể của nhóm sylphonylure điều tiết hoạt động của protein 38-KDa (Kir 6.2) mà thụ thể đó cùng với protein được tách ra và cùng có chức năng như kênh KATP

Thuốc glibenclamide hầu như chủ yếu được nhập ngoại Việc nghiên cứu tổng hợp thuốc này ở Việt Nam chưa thấy đề cập trong tài liệu.Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu tổng hợp glibenclamide để làm thuốc chữa bệnh tiểu đường với hi vọng kết quả này sẽ được đưa vào áp dụng trong thực tiễn sản xuất thuốc chữa bệnh tiểu đường để đưa vào sử dụng trong điều trị bệnh tiểu đường ở Việt Nam

1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đường Metformin hydrochloride

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Cho đến nay, ở trong nước có duy nhất một công trình nghiên cứu tổng hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin Quá trình tổng hợp được được tiến hành qua 3 bước [5]:

* Bước 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid

Calci cyanamide được tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản ứng Theo tác giả Ngô Quốc Huy, quá trình phản ứng thực hiện theo 2 giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC

- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC

*Bước 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine :

Từ calci cyanamide đã được tổng hợp trong bước 1, đem đun nóng trong dung môi H2O nhận được 1-cyanoguanidin được mô tả trong sơ đồ sau:

1-cyanoguanidine

Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidine

Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ

70 oC trong khoảng thời gian 30 phút Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ thuộc nhiều vào điều kiện phản ứng 1-Cyanoguanidine được tổng hợp từ nguyên liệu rẻ như CaO và ure rất có ý nghĩa, tuy nhiên quá trình phản ứng phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 7500C nên khó kiểm soát và ít có ý nghĩa thực tiễn

NH CN NH CH3

CH3 HCl(CH3)2NH.HCl

+

metformin hydrochloride

Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride

Mặc dù phương pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền như: CaO, ure và dimethylamin nhưng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy

mô lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide)

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Metformin được mô tả năm 1957 như chất có hoạt tính hạ đường huyết và năm 1979 được đưa ra thị trường ở Pháp nhưng đến tận 1994 mới được

Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide

hydrochloride) được tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [31] bằng cách cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ

140oC (sơ đồ 1.4) Bằng con đường này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp được hàng trăm dẫn chất biguanid Các dẫn chất này đã được nghiên cứu hoạt tính

H3C

H3C N

Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro

Năm 2008, Anvar Shalmashi [32] đã đưa ra phương pháp mới để tổng hợp metformin hydrochloride Phản ứng điều chế metformin được thực hiện trên bản mỏng điều chế và được đặt trong thiết bị microwave ở bước sóng 540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%

H2N

C

H2N N C N

H3C NH.HCl

H3C

H3C N

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi

Gần đây đã có một số công trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đường Kristiina và các cộng sự [22] đã tổng hợp được một số tiền chất của metformin như mô tả trong sơ đồ 6 và sơ đồ 7 Các chất này có khả năng tan tốt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột

N

NH N

NH2N H

S R

N

NH N H

NH

NH 2

Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin

N-Br O

O

N-S-R O

O

NH N

NH2N H

S R +

R=cyclohexan R=Ph

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin

Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni Các phức này đã được nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết Kết quả nghiên cứu cho thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [30]

Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro(metformin)platin (IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dòng tế bào ung thư P388 tương

tự như Cis-platin [15]

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất metformin không chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đường tuýp 2 rất hiệu quả mà cũng có khả năng chống ung thư tuyến tụy, ung thư vú [12,20,21,26,27,33,34]

Từ các tư liệu đã có có thể thấy rằng con đường tổng hợp metformin từ dicyano diamide là khả thi Tổng hợp theo con đường này chỉ có một bước phản ứng không cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực hiện được ở quy mô pilot

CHƯƠNG II THỰC NGHIỆM

2.1.Hóa chất và thiết bị

2.1.1.Hóa chất và dung môi

Các hoá chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi được mua của hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và thuộc loại phân tích dùng cho phân tích

Bột silica gel cho sắc ký cột 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký silica gel đế nhôm Art 5554 DC – Alufolien Kiesel 60F254 (Merck)

- Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR của các chất nghiên cứu được ghi trên máy Impact 410 – Nicolet, tại phòng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-NMR (500MHz) và 13C-NMR (125MHz) của các chất nghiên cứu được đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO và TMSlà chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân – Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Phổ khối lượng (MS)

Phổ khối của các chất nghiên cứu được ghi trên LC – MSD – Trap – SL tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

2.1.3 Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của các sản phẩm tổng hợp được

Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng được xác định nhờ các phương pháp phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR,phổ hồng ngoại ( IR)

Các sản phẩm phản ứng được kiểm tra độ sạch bằng các phương pháp sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nối khối phổ (LC/MS)

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sản phẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc và sự phát quang khác nhau Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng đã xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chưa kết thúc là dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tương ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm được dung môi hay hỗn hợp dung môi để tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết

loại dung môi và SOCl2 rồi thêm dần 300ml nước và chiết với CH2Cl2 Pha hữu cơ được rửa với nước cho đến môi trường trung tính, làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm nhận được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải

Hexan:EtOAc (7:3) thu được 9,4g chất 2 với hiệu suất 85,71%, và làm ngay

bước tiếp theo mà không cần phải tinh chế

2.2.2 Tổng hợp chất trung gian (4)

Hoà tan 10g (49,03mmol) chất 2 và (7,07ml) pyridin trong dung môi

dichloromethan, sau đó làm lạnh đến 00C và cho (9,8g)

4-(2-aminoethyl)benzenesulfonamide (3) vào hỗn hợp phản ứng Phản ứng được

tiến hành khuấy ở nhiệt độ 600C, trong khoảng 8h Khi kết thúc phản ứng, hỗn hợp được thêm 500ml nước rồi chiết với dichloroethan Pha hữu cơ được rửa bằng nước, làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dưới áp suất giảm nhận được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạch bằng sắc ký cột silica

gel với hệ dung môi rửa giải Hexan:EtOAc (6:4) thu được 16,2g chất 4 với hiệu suất 90%

1 H-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 8,25 (1H, m, N-H); 7,76 (2H, d,

J=8,5Hz, H-9 và H-13); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-18); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz và 9Hz, H-20); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-10 và 12); 7,28 (2H, bs, NH2); 7,16 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,81 (3H, s, OMe); 3,55-3,51 (2H, m, H-15); 2,93-2,90 (2H, m, H-14)

13 C-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 163,56 (C-9); 155,65 (C-15);

143,58 (C-4); 142,09 (C-1); 131,45 (C-13); 129,45 (C-11); 129,12(C-3 và 5);

125,65 (C-2 và 6); 124,79 (C-12); 124,29 (C-10); 114,13 (C-14); 56,23 (OMe); 54,83 (C-8); 34,55 (C-7)

Sản phẩm là chất rắn màu trắng, điểm chảy: 169-1700C

1 H-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và 13);

7,83 (1H, s, 18); 7,52 (2H, d, J=8Hz, 10 và 12); 7,47 (1H, d, J=9Hz, 20); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,85 (3H, s, OMe); 3,73-3,70 (2H, m, H-15); 3,43-3,42 (1H, m, H-1); 3,066-3,038 (2H, t, J=7Hz, H-14); 1,78-1,17 (10H,

H-m, H-1, 2, 3, 4, 5, 6 vùng no)

13 C-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 166,6 (C-7); 159,9 (C-16); 157,7

(C-22); 144,1 (C-11); 133,4 (C-8); 131,5 (C-20); 129,9 (C-10 và 12); 128,1 (C-9, 13 và 18); 127,1 (C-19); 124,8 (C-17); 114,8 (C-21); 57,1 (OCH3); 41,8 (C-1); 36,0 (C-15); 34,7 (C-4); 26,7 (C-2); 26,7 (C-6); 26 (C-3); 25,9 (C-5)

EI-MS m/z: [M]+ 495

CTPT: C23H28ClN3O5S

2.2.4 Phân tích hàm lượng sản phẩm glibenclamide (5) theo tiêu chuẩn dược điển châu Âu 2002

a.Phương pháp thực hiện:

Hòa tan 0.400g Glibenclamide trong 100ml C2H5OH (gọi là dung dịch R) ở nhiệt độ 40-500C Thêm vài giọt phenolphthalein vào dung dịch R làm chất hiển thị Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M cho đến khi màu đỏ xuất hiện 1ml NaOH 0.1M tương ứng với 49.40mg của Glibenclamide

b Chuẩn bị mẫu phân tích:

Áp dụng công thức:

% 100 10

40

c.Kết quả trung bình sau khi phân tích

HL1 = 100.1 HL4 = 100.05 HL7 = 100.02 HL2 = 99.8 HL5 = 100 HL8 = 100.03 HL3 = 99.8 HL6 = 99.8 HL9 = 100

Sản phẩm là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 225-2260C

2.3.1 Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride

2.3.1.1 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu nhưng khó tan Dung dịch được lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) † (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch Tinh thể được lọc và hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 12g Dịch lọc aceton tiếp tục được cô bớt dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 3g sản phẩm Tổng hai lần kết tinh thu được là 15g sản phẩm với hiệu suất kết

2.3.1.2 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung môi MeOH Dung dịch được lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) † (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch Tinh thể được lọc bằng phễu lọc thủy tinh, hút khô sản phẩm thu được sản phẩm metformin hydrochloride 33g Dịch lọc MeOH được cô bớt dung môi tiếp tục được kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 8g sản phẩm Tổng hai lần kết tinh thu được là 41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%

2.3.1.3 Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi EtOH

Hòa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml), hỗn hợp được đun hồi lưu cho đến tan Dung dịch được lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất và sản phẩm chưa tan hết trong dung môi Dịch lọc được làm nguội tại nhiệt độ phòng, sau đó làm lạnh tại nhiệt độ âm (-10) † (-20oC) trong 24h để kết tinh sản phẩm Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng kết tinh xuất hiện trong dung dịch Tinh thể được lọc và hút khô thu được sản phẩm metformin hydrochloride 18g Dịch lọc EtOH tiếp tục được kết tinh lại sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình như trên thu thêm được 6g sản phẩm Tổng hai lần kết tinh thu được là 24g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 48% Như vậy, dung môi MeOH phù hợp để kết tinh sản phẩm metformin hydrocholoride Sản phẩm metformin hydrochloride được kết tinh lại trong MeOH 3 lần nhận được sản phẩm có độ sạch 99,8% ( được đánh giá bằng phương pháp HPLC-MS)

2.3.2.Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD 50 ) của metformine

hydrochloride

Liều độc LD50 được nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trường Đại học

Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội