Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride

Metformine hydrochloride đƣợc làm sạch bằng cách kết tinh trong các dung môi khác nhau: aceton, metanol, etanol.

Sản phẩm thô metformine hydrochloride (50g) lần lƣợt đƣợc hoàn tan trong các dung môi nóng aceton, MeOH và EtOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc kết tinh trong tủ lạnh 24h, lọc bỏ dung môi, hút khô nhận đƣợc tinh thể

metformine hydrochloride màu trắng với hiệu suất kết tinh trong aceton là 30%, trong MeOH là 82% và trong EtOH là 48%. Nhƣ vậy, metformine hydrochloride đƣợc kết tinh trong dung môi MeOH cho hiệu suất kết tinh đạt 82% và độ tinh khiết khoảng 99,8%.

3.2.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride

Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. Kết quả nghiê n cƣ́u cho thấy sau khi uống thuốc , ở những lô dùng thuốc với liều thấp dƣới 900mg/kg thể trọng, chuô ̣t có giảm hoa ̣t đô ̣ng, run nhƣng sau khoảng 30 phút lại ăn uống và hoạt động bình thƣờng , đi ngoài phân khô . Ở những lô chuột uống thuốc thƣ̉ liều cao, chuô ̣t giảm vâ ̣n đô ̣ng , run rõ rê ̣t , tai và đuôi tím tái , phân nhão. Tƣ̀ liều 1100mg/kg trở lên có chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ. Số lƣợng chuô ̣t chết trong vòng 72 giờ đƣợc trình bày nhƣ bảng 3.1

Bảng 3.1:Bảngkết quả thử độc tính cấp của metformin hydrochloride

Từ bảng kết quả , xây dƣ̣ng đƣợc đồ thi ̣ về mối tƣơng quan giƣ̃a liều dùng và số chuột chết nhƣ sau:

LST

T Liều dùng (mg/kg) Số chuô ̣t/lô Số chuô ̣t chết Tỷ lệ %

1 900 10 0 0 2 1100 10 1 10 3 1300 10 2 20 4 1500 10 4 40 5 1700 10 7 70 6 1900 10 8 80 7 2100 10 10 100

Hình 3.8: Đồ thị về mối tƣơng quan giữa liều dung và số chuột chết Với R2 = 0,9776 đã cho thấy hai đa ̣i l ƣợng này có mối tƣơng quan tuyến tính, do đó ta có thể sƣ̉ du ̣ng phƣơng trình y = 0,0088x – 8,5536 để tính đƣợc LD50 = 1540mg/kg.

Nhƣ vật,độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride là: 1540mg/kg

3.2.3. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC

Định lƣợng metformin hydrochloride bằng HPLC sử dụng hệ thiết bị HPLC Agilent 1100, Detector DAD, bƣớc sóng 254nm. Pha động H2O: MeOH= 35:65. Hệ Pha động đƣợc cài đặt nhƣ sau:

Time(min) %B (MeOH) Flow (ml/min)

0,00 65 0,01

4,00 65 0,01

5,00 65 0,3

30 65 0,3

Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên phần mềm excel nhƣ chỉ ra ở hình sau đây.

Liều (mg/kg)

Số chuô ̣t

0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 2000 4000 6000 Dtich n o n g d o (m g /m l) nongdo(mg/ml) Predicted nongdo(mg/ml) Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y= 0.000372*X

Trong đó: Y là Nồng độ metformin hydrochloride (mg/ml); X là diện tích pic metformin hydrochloride (mg/ml).

Xác định nồng độ Metformin: Cân 0,8mg chất cần phân tích, hòa tan trong 1ml MeOH. Kết quả đo diện tích pic (X)= 2115,1(mg/ml).Thay vào phƣơng trình đƣờng chuẩn ta đƣợc Y= 0,8mg/ml. Nhƣ vậy, mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.

KẾT LUẬN

1.Đã nghiên cứu tổng hợp đƣợc glibenclamide từ axit 5-chloro-2- methoxybenzoic với hiệu suất là 82,11%.

2. Đã đánh giá đƣợc hàm lƣợng sản phẩm glibenclamide theo tiêu chuẩn dƣợc điển châu Âu với hiệu suất 99,95%

3.Đã nghiên cứu tổng hợp metfomine hydrochloride bằng phƣơng pháp của Shapiro:Ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimetyl amine hydrochloride, kết quả cho thấy khi ngƣng tụ trực tiếp dicyano diamide và dimethyl amine ở nhiệt độ 1400C trong khoảng thời gian 6h nhận đƣợc metfomin hydrochloride với hiệu suất cao 70%.

4. Đã nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride trong các dung môi aceton, metanol, etanol. Kết quả cho thấy kết tinh trong metanol cho hiệu suất cao nhất 82%.

5. Đã tiến hành nghiên cứu xác định độc tính cấp LD50 của metformine hydrochloride, cho giá trị LD50= 1540mg/kg.

6.Đã phân tích đƣợc hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC kết quả cho thấy mẫu phân tích chứa 100% metformin hydrochloride.

TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt

1. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Dịch tễ học bệnh đái tháo đường, các yếu tố nguy cơ và các vấn đề liên quan đến quản lý bệnh đái tháo đường tại khu vực nội thành 4 thành phố lớn năm 2001", Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr.173-199.

2. Tạ Văn Bình, Hoàng Kim Ƣớc và cộng sự (2004), "Kết quả điều tra đái tháo đường và rối loạn dung nạp đường huyết ở đối tượng có nguy cơ cao tại Phú Thọ, Sơn La, Thanh Hoá và Nam Định năm 2003"- Một số công trình nghiên cứu khoa học tiêu biểu của các dự án quốc gia thực hiện tại bệnh viện nội tiết 1969-2003, NXB Y Học,tr. 353-373.

3. Tạ Văn Bình, Stephen Colargiuri và cộng sự (2004), Phòng và quản lý bệnh đái tháo đường tại Việt Nam-Phần 2 , NXB Y Học,tr. 8-9, 12-13,17. 4.Đỗ Trung Đàm ( 1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc,

Nhà xuất bản Y học, Hà Nội .

5.Trƣơng Phƣơng và Ngô Quốc Huy (2006), “ Tạp chí Dƣợc học ”,tr. 264, 11-13.

6. Thái Hồng Quang (1997), Bệnh đái tháo đường, Bệnh nội tiết

, NXB Y Học,Hà Nội, tr. 257-358.

7. Lê Đình Sáng (2010),Y học cổ truyên, NXB Y Học,Hà Nội.

8.Nguyễn Đình Triệu (2006), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.

9. Mai Thế Trạch và cộng sự ( 1994), "Dịch tễ học và điều tra cơ bản về bệnh tiểu đường ở nội thành thành phố Hồ Chí Minh". Tạp chí Y Học, chuyên đề nội tiết học, Trường Đại Học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh,tr. 25-28.

10.Nguyễn Đình Thành (2011),Cơ sở phương pháp phổ ứng dụng trong hoá học,

11. Nguyễn Minh Thảo (2001), Tổng hợp hữu cơ, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội.

Tiếng Anh.

12.Alimova IN, Liu B, Fan Z, et al (2009), “ Metformin inhibits breast cancer cell growth, colony formation and induces cell cycle arrest in vitro’’ , Cell Cycle 26:8 .

13.Ashcroft SJH, Niki I, Kenna S, Weng L, Skeer L, Coles B, Ashcroft FM (1993), “ The -cell sulfonylurea receptor ‟‟, Adv Exp Med Biol. ; 334: 47- 61.

14. Barelli, Giulio; De, Regis Massimo (1997), “ A glibenclamide-metformin combination for the treatment of diabetes mellitus type II. PCT Int. Appl ‟‟ , 24 pp. CODEN: PIXXD2 WO 9717975 A1 19970522.

15.Bentefrit, F. và các cộng sự (1997) , “ J. Inorg. Biochem ’’, 68, 53-59. 16.Dipalma J. R (1971), “ Diabetes mellitus, Drill's pharmacology in medicine’’, McGraw-Hill, 1492-1525.

17.Gaines KL, Hamilton S, Boyd AE III.(1988) , „„ Characterization of the sulfonylurea receptor on beta cell membranes’’, J Biol Chem ;263: 2589–92. 18.Hokfelt B, Jonsson A (1988), “ Hypoglycemic activity in relation to chemical structure of potential oral antidiabetic substances ‟‟, I. 1-Sulfonyl- 3-alkylureas. J.

19.http://www.fda.gov/bbs/topics/ANSWERS/ANS00627.html "FDA Approves New Diabetes Drug "

20.Hadad SM, Appleyard V, Thompson AM (2009) “ Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ‟‟ , Breast Cancer Res Treat 114:391.

21.Hadad SM, Fleming S, Thompson AM ,Targeting AMPK (2008), “ A new therapeutic opportunity in breast cancer ‟‟, Crit Rev Oncol Hematol 67:1–7 . 22.Kristiina, M. và các cộng sự (2009), “ J. Med. Chem’’, 52, 4142-4118. 23.Lara Ochoa, Jose Manuel Francisco; De la Torre Garcia, Juan Antonio; Franco Andrade, Fidencio ( publication date 25-01-2001), “ Improved process for the preparation of benzenesulfonylureas used as second- generation oral hypoglycemic agents’’, PCT patent W 0015354 (A2).

24.Meyer M, Chudziak F, Schwanstecher C, Schwanstecher M, Panten U (1999), „„Structural requirements of sulphonylureas and analogues for in- teraction with sulphonylurea receptor subtypes’’, Br J Pharmacol ; 128:27– 34.

25.Niki I, Welsh M, Berggren PO, Hubbard P, Ashcroft SJ.(1991), „„

Characterization of the solubilized glibenclamide receptor in a hamster pan- creaticbeta-cell line’’, HIT T15. Biochem J ;277:619–24.

26.Pamela, A. và các cộng sự (2009) , “ Metformin in breast cancer: time of action ’’, J. Clin. Oncology, 27, 1-3.

27.Phoenix KN, Vumbaca F, Claffey KP (2009), “Therapeutic metformin/AMPK activation promotes the angiogenic phenotype in the ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model ‟‟, Breast Cancer Res Treat 113:101–111.

28.Proks P, Reimann F, Green N, Gribble F, Ashcroft F (2002), Sulfonylurea stimulation of insulin secretion. Diabetes, ; 51(suppl 3):368–76.

29.Panten U, Schwanstecher M, Schwanstecher C (1992), “ Pancreatic and extrapancreatic sulfonylurea receptors’’, Horm Metab Res ;24:549– 54. 30.Rao, N. K. và các cộng sự (2007) , “ JASA ’’, 3, 43-45.

31.Shapiro, S. L.; Parrino, V. A.; Freedman (1959) , “ L. J. Am. Chem. Soc ’’,

32.Shalmashi A (2008) ,“ New Route to Metformin Hydrochloride (N, N- dimethylimidodicarbonimidic diamide hydrochloride) Synthesis‟‟, Molbank , M564.

33.Stambolic V, Woodgett JR, Fantus IG, et al (2009) , “ Utility of metformin in breast cancer treatment, is neoangiogenesis a risk factor ’’ , Breast Cancer Res Treat 114:387–389.

34.Zakikhani, M. và các cộng sự (2006), “ Metformin is an AMP kinase- dependent growth inhibitor of breast cancer cells ’’, Cancer Res, 66, 10269- 10273.

Phụ lục 1.1. Phổ 1H-NMR của chất trung gian 4

Phụ lục 2.1. Phổ 1H-NMR của glibenclamide

Phụ lục 3.1. Phổ 1H-NMR của metformin hydrochloride