ĐỀ TÀI: Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh Protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng

PHẦN MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và protease là một trong ba nhóm enzyme thủy phân lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) [43]. Protease có thể được thu từ cỏc nhúm sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật trong đó nguồn enzyme từ vi sinh vật là phong phú nhất. Động vật và thực vật chỉ có khả năng sinh ra một trong hai loại enzyme protease là endoprotease hoặc exoprotease, trong khi vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên. Do đó, protease của vi khuẩn có phổ ứng dụng rộng, hiệu suất sử dụng cao, có khả năng phân hủy triệt để các liên kết peptide trong phân tử protein [66]. Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease thuộc loài Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số loài thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Tuy nhiên, các vi khuẩn đất hoặc vi khuẩn nước ngọt thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính hoặc kiềm yếu và kém chịu mặn do đó việc ứng dụng còn hạn chế. Việc nghiên cứu các chủng Bacillus chịu mặn và sinh protease kiềm chưa được nghiên cứu nhiều. Lần đầu tiên các chủng này được nghiên cứu là vào năm 1968, các chủng ưa kiềm phát triển thuận lợi nhất ở điều kiện pH 9 và có thể ở pH 10 – 12, chúng không phát triển hoặc phát triển rất kém ở điều kiện pH 6.5 [44]. Những phát hiện ban đầu về những chủng ưa mặn và ưa kiềm trên là vô cùng quan trọng, đã mở ra các hướng ứng dụng lớn trong nhiều lĩnh vực như sản xuất như: chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp… 1 Việt Nam có đường bờ biển dài trên 3.000 km và khoảng 3.000 hòn đảo ven bờ, do vậy các loại hình đất ngập nước ven bờ rất phong phú (như rừng ngập mặn, bãi triều lầy, vịnh, ven đảo, cửa sông, rạn san hô ) và có tính đa dạng sinh học cao. Theo báo cáo của Cục Môi trường (Bộ TNMT, 2007), trong tổng số 621.162 ha đất ngập nước (ngập mặn) ven biển của Việt Nam có 209.741 ha RNM, 226.111 ha nuôi trồng thủy sản và 185.310 ha đất ngập mặn chưa có rừng (2008) [90], kèm theo đó, nghiên cứu khu hệ vi sinh vật rừng ngập mặn đã và đang được tiến hành tại bộ môn Công nghệ sinh học, vi sinh, với bộ sưu tập hơn 600 chủng Bacillus phân lập được. Một số nghiên cứu về Bacillus từ RNM đã được tiến hành nhưng chưa có nghiên cứu mang tính hệ thống về khả năng sinh protease kiềm của các chủng Bacillus phân lập được từ RNM Việt Nam. Xuất phát từ tình hình thực tế nghiên cứu và vai trò ứng dụng quan trọng của protease kiềm chúng tôi chọn đề tài: “Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng ” Nội dung cụ thể của đề tài gồm: 1. Hoạt hóa lại các chủng Bacillus rừng ngập mặn. 2. Tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzime protease kiềm. o Xác định khả năng sinh protease kiềm (pH 9) của các chủng Bacillus. o Tuyển chọn các chủng có hoạt tính protease kiềm đầu dòng. 3. Nghiên cứu đặc tính lý hóa của dịch enzyme thô đã loại bỏ sinh khối: như ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl đến độ bền và hoạt tính của enzyme. 4. Xác định môi trường thích hợp cho Bacillus sinh protease kiềm. 5. Lên men thu chế phẩm thô, xác định hoạt tính. 6. Bước đầu xác định khả năng tẩy lông của protease trên da bò. 2 PHẦN NỘI DUNG Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Các enzyme thủy phân protein Protease thuộc enzyme nhóm 3 (enzyme phân giải) và phân nhóm 3.4 (phân cắt các liên kết peptide). Dựa vào vị trí cắt đứt liên kết trong chuỗi liên kết peptide, người ta chia protease làm 2 nhóm: Endopeptidase và Exopeptidase [65]. Protease xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptide (-CO-NH 2 -) trong phân tử protein và cơ chất tương tự. Nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin [2]. Hình 1.1. Sơ đồ enzyme protease thủy phân phân tử protein 3 Hình 1.2. Sơ đồ phân loại protease [65] 1.1.1. Exopeptidase Exopeptidase chỉ tác dụng ở gần điểm kết thúc của chuỗi polypeptide, tại đầu N hoặc đầu C. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại: a/ Aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide. Trong quá trình aminopeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide, 4 Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine protease (trypsin, chymotrypsin, subtilisin) Cysteine protease (papain, cathepsin B) Aspartic protease (pepsin, chymosin) Metallo protease (themolysin, carboxypeptidase A) Exopeptidase (E.C. 3.4.11.17) Endopeptidase (E.C. 3.4.21.99) Peptidase (Protease) (E.C.3.4) nếu giải phóng một amino acid gọi là aminopeptidase, giải phóng một dipeptide được gọi là dipeptidyl-peptidase và giải phóng một tripeptide được gọi là tripeptidyl-peptidase. b/ Carboxypeptidase xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide. Trong quá trình exopeptidase tác dụng tại đầu C, nếu giải phóng một amino acid gọi là cacboxyl-peptidase hoặc giải phóng một dipeptide gọi là peptidyl-dipeptidase. 1.1.2. Endopeptidase Endopeptidase tác động ở vùng bên trong của chuỗi liên kết peptide, cách xa 2 đầu C và N. Dựa vào cơ chế tác động của endopeptidase, người ta chia chúng thành 4 nhóm: serine protease, cysteine protease, aspartic protease và metallo protease. a/ Serine protease (EC.3.4.21) là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus. Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính [23]:  Bước 1, acyl hóa: hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử các bon trong nhóm cacboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine. Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amin (phản ứng khử).  Bước 2, khử acyl hóa: phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2 O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhúm amin để tái sinh lại enzyme. 5 Serine protease có 1 serine ở trung tâm hoạt động, nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN. Serine protease có mặt trong rất nhiều loài của Aspergillus và Bacillus. Các enzyme này bị ức chế bởi Phenylmethylsulgonyl fluorid (PMSF) hoặc diisopropyl fluorophosphat (DFP). Phần lớn enzyme này hoạt động tối thích trong khoảng pH từ 7 – 11 và có trọng lượng phân tử khoảng 20000 – 35000 dalton. b/ Cysteine protease (EC.3.4.22) có 1 cysteine ở trung tâm hoạt động. Cysteine protease bao gồm các protease thực vật như papayin, bromelin, một vài protease động vật và ký sinh trùng và ít thấy ở nấm. Phần lớn các enzyme này hoạt động tối thích ở pH từ 5 – 8, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Chúng mẫn cảm với các chất chứa sulphydryl như là P-chloromercuri benzoate. c/ Aspartic protease (EC.3.4.23) có 2 axit aspartic ở trung tâm hoạt động, là enzyme quan trọng thứ 2 trong số các protease công nghiệp, sau serine protease. Chúng chủ yếu là các protease axit với một axit aspartic được coi như chìa khóa phân giải trong vùng tác động. Enzyme này hoạt động tốt nhất ở khoảng pH từ 3 – 4, với trọng lượng phân tử từ 30000 – 45000 dalton. Aspartic protease rất phổ biến ở nấm và không ổn định ở pH 7.0. d/ Metallo protease (EC.3.4.24) sử dụng ion kim loại trong trung tâm hoạt động, enzyme này hoạt động tốt nhất ở pH 5 – 9, mẫn cảm với các EDTA nhưng không bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế của serine protease hoặc thuốc thử sulphydryl. Kẽm, Coban hoặc Canxi, Mangan hoạt hóa trở lại khi bị EDTA làm bất hoạt [83]. Phần lớn các metallo protease là enzyme có chứa Kẽm và cấu trúc phân tử protein luôn ổn định bởi sự có mặt của Canxi. Đáng chú ý ở các enzyme này là phần lớn ưa nhiệt và rất phổ biến ở Bacillus thermoproteolyticus [56]. 6 Hình 1.3. Sơ đồ vị trí tác động của enzyme thủy phân trên phân tử protein Endopeptidase là một trong những thành phần quan trọng nhất của nhóm enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 60% tổng số enzyme đã được sử dụng rộng rãi [59], [26], [32]. Trong số các loại protease từ vi sinh vật, protease vi khuẩn là đáng kể nhất. Trong số các vi khuẩn thì Bacillus là sinh vật đặc trưng sinh protease ngoại bào. Protease có một số đặc điểm rất lý tưởng đối với công nghệ sinh học, vì vậy chúng trở thành một trong những enzyme quan trọng nhất trong sản xuất công nghiệp. Những protease này được ứng dụng rộng rãi trong các nghành công nghiệp như dược phẩm, thuộc da, tẩy rửa, thực phẩm và công nghiệp xử lý rác thải [80]. 1.2. Protease từ vi sinh vật Protease được tìm thấy ở nhiều nhóm vi sinh vật như động vật nguyên sinh, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và cả virus. Động vật 8%, thực vật 4%, nấm mốc và nấm men 50%, vi khuẩn 30%. Protein bị phân giải bởi nhiều vi sinh vật. Những vi sinh vật này sử dụng cơ chất protein làm nguồn cung cấp nitơ, các bon và năng lượng cho sinh trưởng và phát triển. Sự phân giải protein được bắt đầu bởi protease được tiết ra từ vi sinh vật tiếp sau đó là peptidase ở bên trong hay bên ngoài tế bào. Số lượng và thành phần protease được tiết ra từ vi sinh vật phụ thuộc vào từng loài, từng chủng vi sinh vật, thậm chí các protese khác 7 NH 2 – CH(R 1 ) – CO – NH - … … - CO – NH – CH(R X ) – COOH Cacboxypeptidase Endopeptidase Aminopeptidase Exopeptidase nhau cũng có thể được sinh ra từ cùng một chủng dưới các điều kiện nuôi cấy khác nhau [15]. 1.2.1. Protease từ nấm men và nấm mốc Nấm là nhóm có khả năng tạo ra nhiều loại protease hơn vi khuẩn. Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, ví dụ như: Aspergillus oryzae, Aspergillus tericola, Aspergillus fumigatus, Penicillium chryfogenum,…Đặc biệt Aspergillus oryzae là loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả 3 loại protease: protease axit, protease kiềm và protease trung tính. Tỷ lệ cấu tử enzyme có thể thay đổi tùy thành phần môi trường, ví dụ: Aspergillus oryzae khi nuôi trong điều kiện bình thường thì sinh tổng hợp chủ yếu protease kiềm, còn khi nuôi trong môi trường giảm bớt gluxit thì chủ yếu tạo protease axit [2], [41]. Các loại nấm mốc thuộc chi Rhizopus có khả năng tổng hợp chủ yếu các protease axit có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3.0 [2]. Một số nấm khác như Aspergillus cadidates, Penicillium camberti, Penicillium roqueforti, cũng có khả năng tổng hợp protease làm đông tụ sữa, được sử dụng trong làm pho mát. Bên cạnh đó, nguồn enzyme trong nấm men cũng rất phong phú và đa dạng, là đối tượng được con người biết đến từ rất sớm. Một số loại nấm men sinh enzyme như: Candida albicans và Candida tropicalis là những vi sinh vật khi nhiễm vào cơ thể vật chủ, gây nhiều bệnh cơ hội khi hệ thống miễn dịch của cơ thể vật chủ bị tổn thương. Enzyme ngoại bào của chúng (aspartic protease) được xem giống như yếu tố virus [89]. 1.2.2. Protease từ xạ khuẩn Sự tổng hợp protease của xạ khuẩn ít được nghiên cứu hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên người ta đã tìm được 1 số chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp protease cao như Streptomyces griceus, S. fradiae, S. rimosus,… [3], [12]. 8 Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là Pronase (Nhật) được tách chiết từ Streptomyces grieus. Enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amino acid. Ở Liờn Xụ (cũ), người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ Streptomyces grieus có tên là Protelin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Protease từ Streptomyces fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. 1.2.3. Protease từ vi khuẩn Serine protease là nhóm enzyme được dùng nhiều nhất trong thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm, được sinh ra từ các vi khuẩn thuộc chi Bacillus, đại diện của nhóm này là Bacillus subtilis [41]. Ngoài ra các serine protease cũng được sinh ra từ cỏc nhúm vi khuẩn khác nhau như: Thermus caldophilus, Aeromonas, Escherichia và 1 số giống thuộc Chlostridium. Các protease trung tính hoạt động trong giải pH hẹp (từ 5 đến 8) ít bền nhiệt. Sản phẩm phân giải của các protease này ít bị đắng hơn so với các protease động vật do tốc độ cắt trung bình, vì thế rất có giá trị trong công nghệ thực phẩm [3]. Các protease trung tính từ vi khuẩn có tính đặc hiệu cao với mối liên kết giữa hai axit amin kỵ nước. Nhiệt độ tối ưu thấp rất có lợi cho việc phân giải thức ăn. Một số metallo protease cần có các ion kim loại cho quá trình hoạt động. Các protease kiềm của vi khuẩn hoạt động trong môi trường có pH cao, tính đặc hiệu cơ chất rộng, nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 60 o C, vì thế rất thích hợp cho công nghiệp chất tẩy rửa. 1.2.4. Protease từ virus Protease từ virus có vai trò quan trọng trong quá trình lắp ráp các thành phần của virus. Chúng có thể là serine protease, aspartic protease, cysteine protease nhưng không có metallo protease. Tất cả các protease của virus đều là 9 endoprotease. Aspartyl protease của Retrovirus tham gia vào quá trình lắp ráp hạt virus, tạo ra các đơn vị đồng nhất thể hiện như tiền thân của các protein vỏ. Ngày nay người ta nghiên cứu rất nhiều về protease của virus, cũng như các chất ức chế hoạt động của chúng nhằm chữa các bệnh nguy hiểm do virus gây ra như ung thư và AIDS… 1.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tổng hợp protease của vi sinh vật 1.3.1. Chất cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Những enzyme được tạo thành do tế bào vi sinh vật không chỉ phụ thuộc vào đặc tính riêng của từng loài vi sinh vật, mà còn phụ thuộc vào thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Những bằng chứng đầu tiên chỉ ra rằng, các protease ngoại bào có thể là enzyme cảm ứng được tìm thấy trong công trình nghiên cứu của Castaneda Agullo năm 1956 [28] và sau đó là công bố của một số tác giả khác. Theo Drucker, 1972 [31], khi nuôi chủng Neurospora crassa-74A trên môi trường Vogel chứa huyết thanh bò (BSA) như là nguồn các bon chính trong việc tạo thành các protease, Ông thấy rằng: nếu chỉ có mình BSA thì bào tử sẽ không nảy mầm, khi bổ sung 0.1% đường vào canh trường nuôi cấy là rất cần thiết cho sự phát triển của các bào tử và việc sản xuất protease sẽ bắt đầu vào giờ thứ 5 hoặc thứ 6 của quá trình nuôi cấy. Nếu nồng độ đường cao (0.5-2%) sẽ ức chế sự tổng hợp protease. Theo Wiersma và cs, sự tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế khi môi trường chứa các chất dễ chuyển hóa. Cụ thể là khi nuôi cấy Vibrio SA1 trên môi trường pepton và môi trường tối thiểu chứa các axit amin thì sẽ tạo thành hai loại enzyme là endopeptidase và aminopeptidase, nhưng khi nuôi cấy trên môi trường hỗn hợp glucose, lactate và succinate thì enzyme sẽ bị ức chế. Tuy nhiên, có một khám phá thú vị, người ta đã xác định được một loại axit amin là 10 [...]... của vi sinh vật ưa kiềm trong việc ứng dụng vào công nghệp 1.5.2 Phân lập và phân loại vi sinh vật ưa kiềm (Alkalophiles) Vi sinh vật ưa kiềm bao gồm hai nhóm sinh lý chính; vi sinh vật ưa kiềm và vi sinh vật ưa muối và ưa kiềm Vi sinh vật ưa kiềm (alkalophiles) đòi hỏi pH 9.0 hoặc cao hơn cho sự phát triển của chúng và phát triển cực thuận vào khoảng pH 10 Trong khi đó, vi sinh vật ưa kiềm và ưa muối... loại học, sinh học phân tử và di truyền học của các chủng vi sinh vật ưa kiềm mới được phân lập này Không những thế, việc ứng dụng công nghiệp của các chủng vi sinh vật ưa kiềm cũng đã được áp dụng rộng rãi, một số emzyme, chẳng hạn như protease kiềm, amylases kiềm và cellulases kiềm, đã được đưa vào sử dụng trên quy mô công nghiệp Rõ ràng vi sinh vật ưa kiềm, trong quá trình tiến hóa của mỡnh đó tích... đường kính khuẩn 31 lạc) Các chủng có vòng phân giải lớn và ổn định sẽ được nuôi trong môi trường I Dịch nuôi cấy được sử dụng để xác định hoạt tính enzyme protease trên cơ chất gellatin và casein theo phương pháp vòng thủy phân trên môi trường thạch và phương pháp Anson cải tiến (Mục 2.2.2.3) để xác định chủng có khả năng tổng hợp protease kiềm mạnh nhất, tuyển chọn chủng đầu dòng 2.2.1.3 Phương pháp... Horikoshi và cs vào năm 1971 [47] Thời đó alkalphiles cũn ớt được chú ý và chưa có một ứng dụng công nghiệp nào [48] Horikoshi và cs đã đóng góp công sức rất lớn trong việc phân lập, và tuyển chọn một 17 lượng lớn các vi sinh vật ưa kiềm [46] Hơn hai thập kỷ sau đó Horikoshi và cs đã tập trung nghiên cứu về các vấn đề như enzyme học, sinh lý học, sinh thái học, phân loại học, sinh học phân tử và di truyền... những protease kiềm khác Giải pháp bổ sung ion canxi 5mM đã làm tăng 70% hoạt động của enzyme ở nhiệt độ tối ưu 60 oC [45] Sau đó việc sản xuất protease kiềm của hai chủng Bacillus là AB42 và PB12 đã được báo cáo, các chủng này thích ứng với giải pH rộng từ 9.0 tới 12.0 cung với nhiệt độ tối ưu là 60oC đối với AB42 và 50oC đối với PB12 [21] Từ những báo cáo này mà rất nhiều protease kiềm đã được tách từ. .. tách từ các vi sinh vật ưa kiềm [60], [77], [78] Fujiwara và cs đã tinh sạch một protease chịu nhiệt từ Bacillus sp chủng B18 với pH tối ưu là 12-13, nhiệt độ thủy phân casein tối ưu là 85 oC, đây là mức pH và nhiệt độ khá cao so với các protease trước đó [34] Vào năm 1998, Han và Damodaran đã công bố báo cáo về đặc tinh và tinh sạch của một loại endopeptidase ngoại bào từ một chủng của Bacillus pumilus... ở mức dao động từ 7.0 đến 8.5 [48] 1.6 Tình hình nghiên cứu protease kiềm 1.6.1 Vấn đề nghiờn cứu protease kiềm trên thế giới 21 Nghiên cứu các vi sinh vật ưa kiềm, ưa muối đã dẫn tới việc khám phá ra rất nhiều những loại enzyme với các đặc điểm thú vị Bài báo đầu tiên về một enzyme ngoại bào ưa kiềm được xuất bản vào năm 1971, mô tả việc sản xuất một loại protease ưa kiềm từ chủng Bacillus- 221 Cú... [17], sử 24 dụng protease trong sản xuất bia hoặc thử nghiệm thay thế protease- K trong kỹ thuật gen [18], sử dụng protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày, tận dụng một số phế liệu thủy sản và một số sản phẩm khác [16], và mới đây, sử dụng protease biến đổi cấu trúc protein nhằm tạo ra các tính chất mới thông qua phản ứng plastein [10] Về lĩnh vực protease kiềm, đó cú một số nghiên cứu Vào năm 2006,... lần lượt là 8.5 và từ 10.5 đến 11.5 Năm 1998, Zaghloul và cs cũng đã báo cáo về phân lập, nhận dạng và hoạt tinh keratine của một số vi khuẩn phân hủy lông được phân lập từ Ai Cập [88] 1.6.2 Cấu trúc của protease kiềm Về cấu trúc các protease kiềm cũng đã được nghiên cứu khá kỹ và có nhiều công trình đã được công bố Theo Baumann U và cs [25], mô hình cấu trúc tinh thể protease kiềm từ Pseudomonas aeruginosa... hiện sự ổn định và hoạt tính cao trong Na 2SO4 10% (w/v) và Ure 8 M [42] Một số trong các enzyme trờn đó được thương mại hóa như là phụ gia trong chất tẩy rửa Takami và cs [71] tình cờ tách được một protease kiềm mới từ chủng Bacillus 22 AH-101 Trên cơ chất là casein, enzyme này thể hiện hầu hết hoạt tính tại pH 12 đến 13 và ổn định trong 10 phút ở 60 oC tại pH từ 5-13, với nhiệt độ tối ưu vào khoảng . Tuyển chọn chủng Bacillus từ rừng ngập mặn sinh mạnh protease kiềm và bước đầu định hướng ứng dụng ” Nội dung cụ thể của đề tài gồm: 1. Hoạt hóa lại các chủng Bacillus rừng ngập mặn. 2. Tuyển chọn. Tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzime protease kiềm. o Xác định khả năng sinh protease kiềm (pH 9) của các chủng Bacillus. o Tuyển chọn các chủng có hoạt tính protease kiềm đầu dòng. 3. Nghiên. tính hoặc kiềm yếu và kém chịu mặn do đó việc ứng dụng còn hạn chế. Việc nghiên cứu các chủng Bacillus chịu mặn và sinh protease kiềm chưa được nghiên cứu nhiều. Lần đầu tiên các chủng này