Báo cáo thực hành môn Virus học

Báo cáo thực hành môn Virus học Báo cáo thực hành môn Virus học trình bày về: kỹ thuật tiêm trứng và kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch, tham quan công ty navetco, phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu, qui trình tách chiết DNA tổng số và chạy PCR, phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

3 Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị trứng gà đã ấp từ 9 – 11 ngày tuổi

Muối sinh lý 10-20%

Hình 2: Trứng 9 – 11 ngày tuổi

Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng ở nồng độ 10-3, liều lượng là 0.1-0.2ml/trứng

Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ

Pha vắc xin với nước muối sinh lý ở nồng độ 10-1, 10-2, 10-3

Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước khi đem pha

Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý

Hình 9: Soi trứng, xác định buồn hơi thật, vị trí phôi và làm dấu vị trí phôi

Hình 10: Xác trùng vỏ trứng bằng cồn và Iod

Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau đó xác trùng lại lần nữa

Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng)

Lưu ý : Tiêm về phía đối diện phôi không tiêm trực tiếp lên phôi

Hình 13: Dùng parafin hơi nóng bịt kín lỗ khoan sau đó tiến hành ủ ở 37 0 c

Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su…

3 Chuẩn bị nguyên liệu

Chuẩn bị trứng gà đã ấp 9 – 11 ngày tuổi

Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành các nồng độ 10-1,10-2,10-3 Sử dụng nồng

độ 10-3, liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng Cách pha loãng thực hiện tương tư như trên

4 Quy trình thực hiện

Hình 15: Chuẩn bị trứng đã ấp 9-11 ngày tuổi

Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng hơi giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ

Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút không khí ở buồn hơi giã ra, cho màng cam tuột khỏi

vỏ lụa

Hình 18: Đục lỗ trên vỏ

Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch một góc 30 - 45 0 III KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH

Hình 20: Đun môi trường trên bếp cách thủy

Dùng vải lượt, lọc môi trường vừa nấu xong

Hình 21: Môi trường được lọc xong cho vào chai

Chú ý : Môi trường rất mao đông đặc lại, cần nên tiến hành ngay sao khi lọc xong

Dùng pipet hút 4 - 5 ml thạch nhỏ vào lame, đặt pipet vuông góc với lame, cho thạch chảyxuống từ từ chảy đều trên lame không được có vết nhăn và lồi lỗm chỗ nào, độ dày khoảng 3mm

Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày 3 mm trên Lame

Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu những vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ

Cho kháng nguyên( kháng thể gà) và kháng thể( kháng thể thỏ) vào những vị trí đã đục lỗtheo quy định như sau : lỗ trung tâm là kháng thể thỏ, 4 lỗ xung quanh là kháng thể gà, từ20µl - 50µl cho mỗi lỗ trên thạch

Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào 4 lỗ còn lại, đặt những

miếng bông gòn để giữ độ ẩm

Thực hiện xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ ở 370c, sau 48h để quan sát kết quả

Bài 2 THAM QUAN CÔNG TY NAVETCO

I Mục đích

Học hỏi tìm hiểu thêm về quy trình sản xuất Vắc xin của công ty, và một số vấn đề liên quan

về công ty Một số thiết bị và những ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin đượcanh Tú nhiệt tình hướng dẫn

Hai điểm mới và nỗi bật nhất , đáng quan tâm nhất đó là : cách nuôi Virus dùng để sản xuất vắc xin, và kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin Điều thiệt thòi nhất là chỉ được ngồitrên giảng đường, mà không được chứng kiến tận mất do công ty tan ca làm việc

II Một số vắc xin sản xuất được tại công ty

Vắc xin heo tai xanh

Vắc xin cúm

Vắc xin viêm não nhật bản

Vắc xin uốn ván…

III Quy trình sản xuất vắc xin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấmmen, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin

II Quy trình ly trích ARN cho b nh PRRS, DNA cho b nh Porcine ệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine ệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine

Circovirus Type 2 (PCV2) và ch y PCR ạy PCR

1.Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất

Mầu phổi, thận, lách, hạch của heo ngi ngờ mắt bệnh

Hình 25: Mô heo ngi ngờ mất bệnh PRRS(a), PCV2(b)

Bộ kit thương mại để tiến hành phân lập

Hình 26: Bộ kít Promega dùng để trích ly RNA, bộ kít Việt Á dùng để trích ly DNA

2.Dụng cụ và thiết bị

Máy chạy PCR

Máy ly tâm có tốc độ cao

Vortex

Máy homogenizer hay chày cối

Pipette, đầu col

Tube

Máy chạy điện di

Eppendorf

3.Cách th c hi n ực hiện ệnh PRRS, DNA cho bệnh Porcine

3.1 Trích ly RNA c a b nh heo tai xanh(PRRS) ủa bệnh heo tai xanh(PRRS) ệnh heo tai xanh(PRRS)

Bước 1: xử lý mẫu

Lấy 5gr mẫu đã chuẩn trước đó, cắt nhỏ cho vào cối giã nhiễn ra

Hình 27: Cắt mẫu và giã nhiễn

Cho 5ml dung dịch PBS vào mẫu đã giã nhiễn và trộn điều

Hình 28: Hút dd PBS cho vào mẫu đã giã nhiễn

Hút mẫu mô cho vào eppendorf, bỏ cặn Đem ly tâm 6000 vòng/5 phút

Hình 29: Hút mẫu vào eppendorf và đem ly tâm

Bước 2: Cho 200µl mẫu vào eppendorf chứa sẵn 1000µl RNA Lysis Buffer trộn đều, để yên

30 phút, sau đó ly tâm 13000 vòng/1 phút Phá vỡ tế bào, phóng thích RNA

Hình 30: Cho mẫu vào eppendorf chứa sẵn RNA Lysis Buffer sau đó trộn đều mẫu

Bước 3: Cho 175µl hỗn hợp dung dịch trên vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer,trộn đều, ủ 65oc trong 3 phút, ly tâm 13000 vòng/ 10 phút  Tủa protein tạp và các tạp chất

Hình 31: Cho hỗn hợp vào eppendorf chứa 350µl RNA Dilution Buffer sau đó đem ly

tâm

Bước 4: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 960 Cho tất cả vàoeppendof lọc, ly tâm 13000 vòng/1 phút  Giữ RNA trên màng lọc

Hình 32: Hút 300µl dịch nổi cho vào eppendorf chứa sẵn 200µl cồn 96 0 và Cho tất cả vào

4 Thu hoạch trứng tiêm ở màng CAM

Cắt đầu quả trứng hút hết nước lấy phôi quan sát Cắt đầu quả trứng chỉ lấy màng CAM xem nốt pock

5 Thu hoạch trứng tiêm ở xoang niệu mô

Cắt đầu quả trứng

Hút hết nước trong ở xoang niệu

môThử nghiệm phản ứng

HA trên kính

Xác định kích thước của virus Newcastle

- Trước tiên lấy huyễn dịch nước trứng với HA (+) đem li tâm

- Dùng kim tiêm hút lấy phần nước phía trên

- Bơm kim tiêm đã hút nước huyễn dịch vào màng lọc có kích thước 0.45 µm và 0.22 µm

- Thu dịch lọc

Thử nghiệm phản ứng HA trên kính và ghi nhận kết quả

Lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.45µm thực hiện kiểm tra bằng phản ứng HA trênkính, có 2 trường hợp xảy ra:

+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễn dịch cókích thước lớn hơn 0.45µm

+ Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch

có kích thước nhỏ hơn 0.45µm Ở trường hợp HA dương tính ứng với dịch nước đã lọc được ở màng lọc0.45µm, tiếp tục lấy dịch nước đã lọc được ở màng lọc 0.22µm thực hiện kiểm tra phản ứng HA trên kính

* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả âm tính, tức virus trong huyễndịch có kích thước lớn hơn 0.22µm

* Nếu mẫu làm phản ứng HA trên kính cho kết quả dương tính, tức virus trong huyễn dịch cókích thước lớn hơn 0.22µm

6 Kết quả và thảo luận

 Quan sát phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM màu đỏ tươi do virus Đậu gâyxuất huyết phôi nhưng không làm chết phôi (Hình 1)

Hình 1 : Phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM

 So sánh phôi của trứng tiêm bệnh phẩm ở màng CAM và tiêm ở xoang niệu mô

- Khi tiêm virus Đậu ở màng CAM không gây chết phôi, nhưng gây xuất huyết, phôi có màu

đỏ tươi và virus này tạo nốt Pock trên màng CAM Còn tiêm virus Newcastle ở xoang niệu mô thì sau 24 giờ

ấp trứng (sau khi tiêm) virus làm chết phôi Phôi đã chết nên không có màu đỏ tươi (Hình 6)

Hình 2: Tiêm ở xoang niệu mô làm phôi chết

 Nốt Pock trên màng CAM: Bệnh tích gây thủy thủng, dày lên tạo thành nốt pock trên

Hình 4: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)

Bài 2: Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA: Haemagglutination)

1 Nguyên lý

Trên bề mặt virus Newcastle có cấu trúc kháng nguyên haemagglutine, có khả năng kết hợpvới các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của loài gà, vịt… nên nó làm ngưng kết các loại hồng cầu này lại vớinhau

Micropipette 1 đầu và 8 đầu

Cách chuẩn bị dung dịch hồng cầu gà 1%

Chọn gà trống khỏe mạnh, lấy máu có chất kháng đông ở tĩnh mạch cánh

Lấy máu gà vừa thu nhận trộn với nước muối sinh lý, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút,loại bỏ phần nước trong bên trên, giữ lại phần hồng cầu lắng dưới đáy Tiếp tục pha hồng cầu với nước muốisinh lý, ly tâm Thực hiện thao tác này đến khi nào hồng cầu được rửa thậtt sạch (thường thực hiện thao tác

ly tâm khoảng 3 – 4 lần) Lần cuối cùng loại bỏ phần nước trong bên trên, phần hồng cầu pha với nước muốisinh lý để được hồng cầu 1%

Hình 5: Hồng cầu 1%

 Tiến hành

Cho nước muối sinh lý vào các hàng từ lỗ 1 đến 12, mỗi lỗ 50µlCho thêm 50µl huyễn dịch virus vào lỗ thứ 1, trộn đều sau đó lấy 50µl huyễn dịch từ lỗ 1 chovào lỗ 2, trộn đều và cứ tiếp tục làm cho đến lỗ thứ 11, hút 50µl huyễn dịch từ lỗ thứ 11 bỏ ra ngoài Lỗ thứ

 Phản ứn HA dương tính: xảy ra ngưng kết hồng cầu ở:

Hàng I: từ vị trí thứ 1 - 6 (n = 6), đóng nút tại vị trí thứ 7 Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đóvirus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 64

Hàng II: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”

Hàng III: từ vị trí thứ 1 - 8 ( n = 8), đóng nút tại vị trí thứ 9 Vậy hiệu giá pha loãng mà ở đóvirus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 512

Hàng IV: từ vị trí thứ 1- 10 ( n =10), đóng nút tại vị trí thứ 11 Vậy hiệu giá pha loãng mà ở

đó virus còn khả năng gây ngưng kết hồng cầu là 1/ 1024

Hàng V: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”

Hàng VI: xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc”

 Kết quả: Xảy ra hiện tượng “ nhảy cóc” có thể do sai sót thao tác không cho huyễn dịch

virus vào lỗ nên không thể ngưng kết hồng cầu gà tạo hiện tượng đống nút

Hình 6: Kết quả phản ứng HA

Bài 3: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: Haemagglutination inhibition)

3 Tiến hành

Cho nuớc muối sinh lý vào hàng thứ nhất từ lỗ thứ 1 đến 12, mỗi lỗ 50 µl

Cho thêm 50 µl huyết thanh gà vào lỗ 1, trộn đều Sau đó lấy 50 µl huyễn dịch từ lỗ 1 cho vào

lỗ 2, trộn đều lên và cứ tiếp tục như thế cho đến lỗ thứ 10, hút 50 µl huyễn dịch ở lỗ thứ 10 bỏ ra ngoài Lỗ

11 dùng làm đối chứng âm, lỗ 12 dùng làm đối chứng duơng

Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ thứ 11 mỗi lỗ 50 µl huyễn dịch virus đã pha loãng ở nồng độ 4đơn vị HA Để yên 10 – 15 phút

Cuối cùng cho 50 µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất cả các lỗ từ 1 đến 12, lắc đều, để yên

Hình 7: Phản ứng HI của Virus Newcastle

Bài 4: Qui trình tách chiết DNA tổng số và chạy PCR

1 Dụng cụ và thiết bị

Máy chạy PCRMáy ly tâm có tốc độ cao ( khoảng 13000 vòng/10 phút)Vortex

Máy homogenizer hay chày cốiPipette, đầu col

3 Các bước tiến hành

Bước 1: Xử lý mẫu (nghiền mẫu, ly tâm, thu dịch mô)

Nghiền mẫu: 1gram mô + 2ml PPS

Hút nước mô vào đầy 2 tube vô trùng

Bước 2: Đánh dấu các tube 1,5ml vô trùng bằng ký hiệu mẫu Bước 3: Cho 200µl mẫu vào một tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1, voxtex 30s,

để yên 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải

chuyển thành màu trắng đục Ly tâm 13000 vòng /10 phút

28

Hình 12: a) hút 900µl dung dịch pED1 vào tube vô trùng Hình b)

hút 200µl mẫu vào tube vô trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1

Bước 4: Thu 600µl dịch nổi có chứa DNA vào một tube vô trùng có sẵn 600µl dung dịch pEX3 Trộn đều để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút.

Bước 5: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng ( hoặc xanh) Cho từ từ 900µl dung dịch EX4

vào Ly tâm 13000 vòng /5 phút

Bước 6: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn Để khô ở 60oC trong 10 – 15 phút Cho vào 50µl dung dịch ED5.

Bước 7: Trước khi sử dụng, dung pipet trộn đều đến khi phần cặn tan hoàn toàn.

Bước 8: Bảo quản mẫu ở -20oC

Bước 9: Lấy mẫu cho vào eppendorf cho vào máy PCR và thiết lập chương trình chạy.

Hình 13: Chạy PCR

Hình 14: Chu trình chạy PCR

4 Kết quả thảo luận

Bài 4: Phản ứng kết tủa và khuếch tán trên thạch (Agar gel immunodiffustion test – AGID test)

1 Nguyên tắc

- Kháng nguyên và kháng thể khuếch tán trong thạch

- Khi gặp nhau sẽ kết hợp tạo thành đường kết tủa trắng mờ đục

Hình 15: Kết quả chạy điện di

2 Chuẩn bị

- Kháng nguyên: huyết thanh gà

- Kháng thể đưa kháng huyết thanh gà

- Đun cách thuỷ cho đến khi tan hết

3 Tiến hành

- Hút 3- 4ml thạch đã nung chảy cho vào lam thủy tinh, chú ý rải thạch theo hình ziczac đểthạch chảy đểu lên mặt lam

- Lam được để trên mặt bàn bằng phẳng cho đến khi thạch đông lại

- Thạch phải dày khoảng 3 mm

- Dùng ống kim loại đục 5 lỗ : 1 lỗ ở giữa thạch, 4 lỗ còn lại ðặt vuông góc với nhau

- Cho kháng nguyên vào 1 lỗ ở giữa thạch, cho kháng thể vào 4 lỗ còn lại hay có thể chongược lại cho kháng thể vào 1 lỗ ở giữa, cho kháng nguyên vào 4 lỗ còn lại

Chú ý: tùy vào độ lớn của mỗi lỗ mà ta tiêm vào 1 lượng thể tích tương ứng

- Đặt lam vào trong đĩa petri, đặt bông gòn có thấm nước xen kẽ giữa các lam nhằm tạo độ

ẩm cho đĩa

- Ủ ở 370C

- Đọc kết quả 2 lần: lần 1 là sau 24 giờ, lần 2 là sau 48 giờ

Hình 16: Các lam đã tiêm kháng nguyên – kháng thể

4 Kết quả

Lần I: sau 24 giờ chưa có vầng trắng đục như mẫu đối chứng

Kết quả: do không đủ thời gian nên chỉ có thể quan sát mẫu đối chứng dương đã được giảng

viên chuẩn bị từ trước

Bài 5: Phản ứng ELISA phát hiện kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro

1 Giới thiệu 1.1 Bệnh Gumboro

Bệnh Gumboro (Infections Brusal Disease) là bệnh thường xảy ra trên gà ở giai đoạn 1 - 12tuần tuổi, rõ nhất là giai đoạn 3 - 6 tuần tuổi

Hình 17: Phản ứng kết tủa khuếch

tán trên thạch

Tất cả các giống gà đều mắc bệnh Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệuchứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10-50% hoặc cao hơn nếukết hợp với các bệnh khác.

a Nguyên nhân: Do virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1.

b Phương thức truyền lây

- Bệnh có thể lây gián tiếp qua trứng, qua không khí, hoặc thức ăn, nước uống, dụng cụ chănnuôi nhiễm mầm bệnh

- Bệnh lây lan trực tiếp giữa gà mang mầm bệnh và gà khỏe do tiếp xúc

c Triệu chứng

- Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày.

- Sau khi nhiễm bệnh gà biểu hiện triệu chứng đầu tiên là cắn mổ vào hậu môn của nhau,biếng ăn, lông xù, lờ đờ, đi run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, loãng còn nhiều chất nhầy sau đóchuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu môn

d Bệnh tích

- Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô

- Cơ đùi, cơ ngực, cơ cánh xuất huyết đỏ thành vệt hoặc thâm đen

- Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết lấm tấm hoặc cả đám, thận sưngnhạt màu Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề), ruột sưng to có nhiềudịch nhầy bên trong

- Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5, 6, 7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thìchỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu

1.2 ELISA

ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) có nghĩa là hấp thụ miễm dịch liên kếtvới enzyme, là một phân tích sử dụng kháng thể để nhận diện protein Ở đây kháng thể đặc hiệu cho khángnguyên (thường là protein ta quan tâm) được gắn vào đáy giếng Chất mà ta quan tâm nằm trong mẫu thửđược trộn lẫn với chất chuẩn có liên kết enzyme Khi ta cho hỗn hợp này vào giếng thì giếng nào có chất của

với một giếng chuẩn chỉ có chất chuẩn ta sẽ biết lượng chất ta quan tâm trong mẫu thử của ta là bao nhiêu.ELISA được sử dụng nhiều trong y học, trong chẩn đoán (ví dụ có thai, ung thư v.v), trong chẩn đoán bệnhcho gia súc vật.

Ưu điểm của phương pháp ELISA là: độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏkháng nguyên- kháng thể, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mớixâm nhiễm Dùng để phát hịên nhiều loại Protein, nhận diện virut, vikhuẩn, và một số hợp chất phân tửlượng nhỏ trong nhiều mẫu sinh học khác nhau

2 Dụng cụ - hóa chất

- Vĩ phản ứng có phủ kháng nguyên virus gây bệnh Gumboro

- Đối chứng dương : có kháng thể

- Đối chứng âm : không có kháng thể

- Kháng kháng thể chế từ dê có gắn enzyme (Horseradish Peroxidase Conjugate)

- Dung dịch phát hiện màu (TMB Substrate): conzurat + chất hiện màu

- Dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution): dừng phản ứng tạo màu

- Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent) dùng để pha loãng mẫu huyết thanh

- Nước cất hoặc nước tiệt trùng: rửa mẫu

3 Chuẩn bị

- Bộ kit phải được để ở nhiệt độ phòng 1 giờ trước khi thực hiện phản ứng

Mẫu

- Dùng µl pipet hút huyết thanh từ ống chích sang các tube có nắp

- Chuẩn bị 10 tube có nắp chứa 1500µl dung dịch pha loãng

- Hút 3µl huyết thanh từ tube chứa huyết thanh sang các tube chứa dung dịch pha loãng

- Thực hiện pha loãng mẫu với dung dịch pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:500 (3µl huyết thanh +1500µl dung dịch pha loãng mẫu)

Chú ý :

- Thay đầu type ở mỗi mẫu

- Không pha loãng đối chứng