Báo cáo thực hành môn sinh học phân tử kỹ thuật di truyền

MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM 1.1 Mục đích Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử.. 7 D

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊN

KHOA CNSH &CNTP - -

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ KỸ - THUẬT DI TRUYỀN

Giảng viên: ThS Dương Hữu Lộc

Sinh viên: Đỗ Thị Hào

Lớp: CNSH43

Thái Nguyên, 2013

Bài 1 TÁCH CHIẾT DNA TỔNG SỐ

I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

1.1 Mục đích

Tách chiết DNA tổng số nhằm mục đích thu nhận DNA ra khỏi cấu trúc bao bọc của tế bào, để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân

tử Điều quan tâm là thu nhận được các phân tử DNA ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy

1.2 Đối tượng : Lá đậu tương

II VẬT TƯ – HÓA CHẤT

1 Cồn tuyệt đối 1 lít

2 Dụng cụ dạng thìa nhựa 2

3 Ống fancol 10 chiếc

4 Bộ micropipet 2 bộ Kèm 30 đầu côn các loại

5 Ống eppendorp loại 2 ml 30 chiếc Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu

6 Ống eppendorp loại 1,5 ml 30 chiếc Ghi sẵn thứ tự theo số mẫu

7 Máy ổn nhiệt 1 máy

8 Máy lắc (votex) 1 máy

10 Máy spindown 1 máy

11 Tris HCl 1M, pH = 8 6 ml

13 EDTA 0,5 M, pH = 8 1,2 ml

15 NaH2PO4 0,16 gam

16 Sorbitol 2M 7 ml

19 Isopropannol 100% 15 ml

21 Nước cất đã khử ion 6 ml

Cách pha hóa chất

1) Đệm CTAB 100 ml gồm:

- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam

- β - Mercapto ethanol : 250 µl

- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml

- Tris HCl (pH= 8,0) : 15 ml

- Dung dịch đệm CTAB có tác dụng phá màng tế bào , bào quan, giải phóng ra DNA

- EDTA có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme DNase, bảo vệ DNA, phá vỡ liên kết hóa trị II và do đó làm giảm tính bền vững của lớp màng ngoài tế bào vi khuẩn

2) Đệm TE (Tris - EDTA) pH=8,0 gồm:

- Tris HCl (pH=8,0) :10 mM

4) Cồn tuyệt đối lạnh : 50 ml

5) NaCl 5M : 20 ml

6) Dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1)

- Chloroform không tan trong nước, do đó khi bổ sung vào dịch nuôi tế bào sẽ làm cho dịch này phân thành 2 lớp( pha) Hỗn hợp ly tâm mạnh để phân tách lớp Protein bị kết tủa sẽ nằm ở pha giữa

- Isoamylancohol là 1 ancohol với sự có mặt của cation hóa trị I ( Na+, K+,

NH4+) có tác dụng làm kết tủa DNA

7) Dung dịch phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1)

8) Dung dịch rửa mẫu là ethanol 70%:

- Sử dụng cồn tuyệt đối để loại bỏ một số muối lẫn tạp trong dung dịch mà

chúng kết tủa theo DNA

III CÁCH TIẾN HÀNH

3.1 Nguyên tắc

Nguyên tắc tách chiết DNA từ tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn là như nhau Tuỳ từng loại mẫu phẩm sinh học, tuỳ từng mục đích nghiên cứu và điều kiện phòng thí nghiệm có thể sử dụng các kỹ thuật tách chiết với các loại hoá chất và dung môi khác nhau

Các phương pháp tách chiết DNA thường được dùng gồm:

1 Phương pháp CTAB

2 Phương pháp PVP

3 Phương pháp phenol/chloroform

4 Phương pháp Silica

5 Phương pháp Guanidine-chloroform

Trong phạm vi bài giảng thực hành này sẽ giới thiệu cách tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB (Cetyl threemetyl amomnium bromide) -

phương pháp 1 Do tác giả Gawel và cộng sự đưa ra năm 1991 và đã có sự cải

tiến

Nguyên tắc của phương pháp dựa trên cơ sở sử dụng kết hợp cơ học là nghiền và các hóa chất để phá vỡ vật liệu ban đầu là màng nhân, tạo thành hỗn

hợp đựng trong các ống Ependorp Đồng thời kết hợp ly tâm để tách, các hóa chất và loại bỏ những thành phần không mong muốn, từ đó thu nhận DNA

3.2 Quy trình tách DNA (Gồm 10 bước)

- Bước 1: Tiến hành thu mẫu (mẫu lá), gói bằng giấy bạc để ngay vào trong nitơ lỏng đến khi tách chiết DNA

- Bước 2: Nghiền 0,2 - 0,3 gam lá đậu tương trong trong nitơ lỏng tành bột mịn

- Bước 3: Chuyển bột mịn vào ống eppendof 2 ml Thêm 1ml đệm CTAB đã ủ

ở 650C trong 10 phút

- Bước 4: Ủ các ống mẫu trên ở 650C trong 90 phút, trong quá trình ủ tiến hành đảo nhẹ 20 phút/ lần

- Bước 5: Ly tâm 12.000 vòng/phút, ở 40C Hút phần dịch nổi ở phía trên sang ống mới Thêm 0,8 ml dung dịch chloroform:isoamylalcohol (24:1), lắc nhẹ trong 10 phút Tiến hành ly tâm trong 10 phút, tốc độ 10.000 vòng/phút ở 40C (lặp lại 2 lần)

- Bước 6: Hút lớp dịch nổi sang ống eppendof mới, bổ sung (25:24:1) theo tỉ lệ 1:1

và lắc nhẹ trong 10 phút Tiến hành ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, 40C

- Bước 7: Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung isopropanol vào theo tỉ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3 µl NaCl 5M Đảo đều trong 57 phút Để mẫu trên ở tủ

-200C qua đêm

- Bước 8: Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa

- Bước 9: Rửa tủa với ehanol 70% Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút (lặp lại 2 lần)

- Bước 10: Tiến hành loại bỏ dịch lỏng, thu lấy tủa DNA Làm khô bằng máy ly tâm chân không trong 20 phút ở 300C

- Bước 11: Bổ sung 20 µl H2O cùng với 2 µl Rnase để hòa tan tủa DNA Ủ mẫu DNA ở tủ 370C trong 30 phút Đem cất giữ ở -200C

IV Kết quả:

Kết quả điện di sản phẩm tách chiết:

Hình 1.3 Kết quả điện di tách chiết DNA tổng số từ đậu tương

Nhận xét:

Tách chiết DNA tổng số tương đối thành công, chấp nhận được , có DNA bị đứt gãy, tuy nhiên lượng DNA thu được ít nên vạch không sáng rõ, còn mờ, ngoài ra vẫn còn tạp chất như protein, bị lẫn RNA nhiều Hầu hết các mẫu đều có DNA, mẫu 8,9, 10 tách khá thành công, mẫu số 6 DNA không hiện có thể do trong quá trình thao tác làm mất DNA hoặc tra mẫu điện di

- Giếng số 1: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, có DNA bị đứt

gãy Lẫn tạp protein và RNA nhiều

- Giếng số 2: Tách chiết DNA tổng số khá thành công, tuy nhiên mẫu

bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu được ít, RNA lẫn tạp khá nhiều

- Giếng số 3: Bị lẫn tạp protein, lượng DNA thu được ít hơn, có đứt

gãy

- Giếng số 4: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt

gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng

vir ) và RNA

- Giếng số 5: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, tuy nhiên lẫn

tạp protein còn dính tại miệng giếng và RNA cuối đường điện di

- Giếng số 7 : Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, tuy nhiên lẫn

tạp protein còn dính tại miệng giếng và RNA cuối đường điện di

- Giếng số 8: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng

vir ) và RNA

- Giếng số 9: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, DNA bị đứt gãy, vạch sáng mờ, không rõ, lẫn tạp protein ( tạo thành dải vệt sáng

vir ) và RNA

- Giếng số 10: Tách chiết DNA tổng số chấp nhận được, tuy nhiên lẫn

tạp protein còn dính tại miệng giếng và RNA cuối đường điện di

V Giải thích:

Nguyên lí của quá trình tách chiết phá vỡ tế bào lá đậu tương :

- Phá vỡ tế bào , màng tế bào và mô

- Loại bỏ tạp chất không phải DNA ( Protein, lipid, đường…)

- Phá vỡ tế bào bằng cách xử lí nhiệt, dung lực mạnh hơn để phá vỡ liên kết, lực cơ học đảo trộn bằng máy vortex

- CTAB : Chất tẩy rửa thường dùng để phá vỡ màng tế bào, bào mòn màng tế bào Màng tế bào là lớp kép phospholipid, CTAB làm biến tính protein, phospholipid bị hòa tan

Trong dung dịch đệm có các thành phần:

- Tris- HCl: ổn định pH

- EDTA: Có ái lực cao với ion kim loại hóa trị II hấp thụ kim loại nặng, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme DNase, enzyme nội bào hấp thụ Ca+ , Mg+ canh tranh với enzyme làm enzyme không hoạt động

- Khi bổ sung CTAB thì ủ ở 65ºC trong 1h và 10 phút đảo trộn

1 lần

- CTAB hoạt động mạnh hiệu quả ở nhiệt độ khoảng 60- 70ºC, mạnh hơn khi có ái lực cơ học tác động vào ( CTAB hoạt động trong trường hợp có NaCl)

- CIAA bổ sung để tách chiết DNA, loại bỏ protein và các thành phần khác không mong muốn, chloroform không kết tủa DNA, có tác dụng biến tính CTAB, kết tủa CTAB

- Isoamyalcohol: Loại bỏ, giảm khả năng tạo bọt, đồng thời giúp tăng cường hỗ trợ khả năng kết tủa protein, hỗ trợ sự phân pha Sau khi bổ sung CIAA ly tâm thì có hiện tượng phân pha ( 3 pha)

+ Pha trên : Là DNA

+ Pha giữa: Chứa protein

+ Pha dưới: Chứa xác cặn tế bào và dung dịch chloroform

- CH3 COONa 3M pH 5.5 : ion Na+ vào trung hòa DNA triệt tiêu khả năng hòa tan DNA, bổ sung isopropanol sẽ kết tủa được DNA, phân tách và thu được DNA ( CH3 COONa,

CH3 COOK, NaCl : hỗ trợ kết tủa nhanh hơn)

- Rửa tủa bằng cồn 70%, không sử dụng nước cất để rửa để rửa tủa vì DNA bị hòa tan trong nước không hòa tan trong cồn Nếu tủa lẫn muối : Muối hòa tan trong cồn 70%, cồn 100% muối không tan, cồn kết tủa cả protein vì cậy khi rửa tủa bằng cồn xong thì hút hết hết cồn và làm bay hơi hết cồn Nếu còn cồn sẽ làm biến tính enzyme không thực hiện được các phản ứng sinh học phân tử tiếp theo

- Hòa tan DNA bằng TE 1X hoặc nước khử ion, nước khử ion

và TE 1X đều có thể hòa tan tủa DNA nhưng ít khi sử dụng nước khử ion vì rửa tủa bằng TE 1X hiệu quả hơn có thể bảo quản được lâu, TE bảo quản tốt nhất vì có chứa EDTA ái lực với ion kim loại hóa trị II, bảo vệ DNA khỏi sự phân hủy của enzyme giúp bảo quản được lâu

Hạn chế của TE là khi có sự có mặt của EDTA ức chế các enzyme các phản ứng sinh học phân tử sau này Cho nên sử dụng TE ở nồng độ loãng, nếu không sẽ ức chế các phản ứng sinh học sau này

Sử dụng TE 1X là được

Bài 2 ĐIỆN DI TRONG GEL AGAROSE

I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

Mục đích

Điện di DNA trong gel agarose là kỹ thuật dùng để kiểm tra chất lượng

và hàm lượng DNA Kỹ thuật dựa trên nguyên tắc: dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường

II THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

2.1 Thiết bị, dụng cụ

- Bộ điện di DNA: Nguồn điện di (80 - 120V), giá và bể điện di, lược tạo giếng điện di, khay thăng bằng nhờ giọt nước đổ bản gel

- Cân điện tử

- Bình chịu nhiệt để đun agarose

- Lò vi sóng

- Ống eppendorp loại 2 ml

- Khay nhựa có nắp kín kích thước (10 x 20 x 30 cm) để nhuộm bản gel

- Máy lắc

- Máy soi gen

- Máy chụp ảnh (nếu có)

2.2 Hóa chất và cách pha hóa chất

- Agarose

- TAE 1X TAE 1X được pha từ TAE 50X stock bao gồm:

+ 242 gam Tris base (FW = 121) + 57,1 ml glacial actic axit (axit axetic băng) + 100 ml EDTA (pH = 8)

+ Bổ sung nước cất lên thể tích 1lít

Khi pha 1X sẽ cần 1 ml dung dịch 50X stock + 9 ml nước cất

- Ethydium Bromide Solution nhuộm ở nồng độ 0,5% (0,5 μl/ml)

- Dye 6X Dye 6X được pha loãng từ Dye 10X Trong đó 10X sample buffer stock bao gồm: 50% glycerol, 0,25% bromophenol, 0,25% xylene cyanole

FF và pha trong 1 x TAE buffer Ví dụ: Để pha được 10 ml Dye 10X cần:

+ 5ml glycerol + 0,25% x 10 gam bromophenol + 0,25% x 10 gam xylene

+ Còn lại là 1 x TAE

10 ml Dye 6X sẽ được pha từ 6 ml Dye 10 X + 4 ml nước cất

III NỘI DUNG THÍ NGHIỆM

3.1 Nguyên lý

Dựa vào đặc tính cấu trúc của axít nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường chúng sẽ

di chuyển về cực dương của điện trường

3.2 Các bước tiến hành

- Bước 1: Pha 0,8 gam agarose trong 100 ml TAE 1X, đun sôi bằng lò vi sóng Lưu ý khi đun bằng bình chịu nhiệt có nắp không được đậy nắp kín, hoặc đun bằng cốc thủy tinh chỉ nên đổ khoảng 2 phần 3 thể tích cốc nhằm tránh tràn khi sôi Đun sôi để nguội đến 60oC (khi có thể dùng tai cầm được bình đựng agarose là được) mới tiến hành đổ bản gel

- Bước 2: Trước khi đổ bản gel cần lau sạch giá đổ bằng giấy thấm mềm

dễ hút nước sau đó mới cài lược Lược tạo giếng được đặt ở phía cực âm của bể điện di Tiến hành cân bằng mặt phẳng của giá bể bằng giọt nước trên giá

Đổ bản gel, bản gel trong bài thực hành này có kích thước dài 10 cm, rộng 6,5 cm và cao 0,4 cm Mỗi giếng sâu 0,3 cm, thể tích giếng chứa được 0,8

μl mẫu Do vậy mỗi bản gel cần đổ 50 ml Đợi khoảng 1 giờ cho khô và tháo lược

- Bước 3: Đổ khoảng 150 ml dung dịch TAE 1X vào bể điện di, dung tích TAE

có thể linh động thay đổi để phù hợp khi đặt bản gel trong bể

- Bước 4: Đặt bản gel vào bể điện di, lưu ý có thể thêm hay bớt dung dịch TAE 1X, để được bản gel ngập 0,1 cm (1mm) so với bề mặt dung dịch điện di

- Bước 5: Lấy 10 μl ở các mẫu DNA đã tách chiết trộn với 2μl Dye 6X bằng các ống eppendorp mới (đã ghi thứ tự), vẩy nhẹ tay để mẫu DNA được trộn đều với Dye 6X Cho cẩn thận hỗn hợp 8μl ở ống vào giếng điện di bằng micropipet Ghi chép lại thứ tự của ống mẫu tương ứng với thứ tự của giếng Mỗi ống mẫu

được dùng một đầu côn hút riêng Khi tra mẫu vào giếng, một tay tỳ lên thành giá của điện di làm điểm dựa, tay kia đưa micropipet sao cho đầu côn vừa sát miệng giếng rồi bơm từ micropipet ra Cần lưu ý thao tác này nếu không cẩn thận sẽ làm tràn ra ngoài giếng hoặc vỡ miệng giếng

Chạy điện di ở điện thế 100V trong 30 phút Lúc này quan sát bằng mắt thường

có thể thấy hỗn hợp mẫu trong giếng điện di dịch chuyển chậm từ phía cực âm sang cực dương

- Bước 7: Lấy bản gel từ bể điện di ra nhuộm trong ethydium bromid 0,5μl/ml trong 10 phút, thao tác nhuộm được thực hiện trên máy lắc, tốc độ chậm, chỉ khoảng 50-70 vòng/phút Lưu ý khi mang bản gel nhuộm cần cẩn thận vì ethydium bromid rất độc hại với người và môi trường Do đó, để giảm thiểu việc tiếp xúc trực tiếp, cần dùng bằng thìa to, dạng bản, có cán dài (hình 13) để đưa bản gel vào khay nhuộm, lấy ra khỏi khay, mang rửa lại bằng nước sạch, đến khi đưa bản gel lên máy soi

- Bước 8: Soi bản gel trên máy tia tử ngoại, khi đó các axít nucleic trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) có bước sóng λ ≈ 300 nm nhờ ethydium bromid Chất này có khả năng xen gắn vào giữa các bazơ của axít nucleic làm chúng phát sáng dưới dạng những vạch màu đỏ cam, dễ quan sát và chụp ảnh

Hình 4.9 Ảnh bản gel agarose

IV Nhận xét:

- Điện di xác định độ tinh sạch, nguyên vẹn của DNA nhưng chỉ định tính ( có hay không, nhiều hay ít, sáng hay mờ) Băng sáng thì nhiều, băng mờ thì ít

- Xác định độ tinh sạch: Lẫn tạp protein, RNA, protein điện tích không rõ ràng thường bám vào DNA

- Độ nguyên vẹn hoàn toàn không có nghĩa là toàn bộ đoạn DNA mà

là các dải đứt gãy lớn đảm bảo nguyên vẹn ( băng sáng)

Bài 3

KỸ THUẬT PCR

I MỤC ĐÍCH THÍ NGHIỆM

Mục đích

PCR (Polymerase Chain Reaction) lần đầu tiên được Karl Mulis mô tả năm

1984 Phản ứng chuỗi polymerase là một kỹ thuật đơn giản cho phép nhân bản nhanh một trình tự DNA lên rất nhiều lần trong vài giờ PCR được thực hiện khi có khuôn, Taq-polymerase, các mồi chuyên biệt gồm, bốn loại deoxy-ribonucleotide triphotphate (dNTP), dung dịch đệm và ion Mg2+ PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích gen, vì nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu

từ bất kỳ cơ thể nào

II DỤNG CỤ HÓA CHẤT

2.1 Dụng cụ

- Lò vi sóng

- Cân điện tử

- Bình chịu nhiệt 500 ml

- Ống PCR

- Máy ly tâm

- Máy lắc

- Máy PCR

- Bộ điện di

- Máy soi gen

2.1 Hóa chất và các thành phần của phản ứng PCR

- Enzyme Taq polymerase

- Buffer PCR

- MgCl2 PCR

- Nước cất đã khử ion

- Đoạn DNA làm mồi (primer) gồm: Hai đoạn mồi chuyên biệt mồi xuôi

“sens primer” hay “forward primer” và mồi ngược “antinsens primer” hay