xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong các loại thực phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Trong nhóm chấtbảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều trong thựcphẩm nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm.. Có thể p

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC HUẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HỒ THỊ HỒNG MY

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI AXIT BENZOIC VÀ AXIT SORBIC TRONG CÁC LOẠI THỰC PHẨM ĐÓNG GÓI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

CHUYÊN NGÀNH: HÓA PHÂN TÍCH

MÃ SỐ: 60440118

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS TS NGÔ VĂN TỨ

Huế, Năm 2014

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển dân số, kinh tế, xã hội, khoahọc và công nghệ đòi hỏi các mặt hàng thực phẩm phải ngày càng dồidào và phong phú về số lượng, chất lượng, cũng như chủng loại và thờigian sử dụng Để đáp ứng nhu cầu đó trong quá trình chế biến thựcphẩm các nhà sản xuất thường thêm các chất phụ gia vào thực phẩmnhằm cải thiện chúng Phụ gia thực phẩm là những chất không được coilà thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm, chúng có ít hoặckhông có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đápứng yêu cầu công nghệ trong quá trình sản xuất,chế biến, xử lí, bao gói,vận chuyển, bảo quản [2]

Trong đó khâu bảo quản thực phẩm không kém phần quantrọng Có nhiều cách để bảo quản thực phẩm như phơi, sấy khô, làmlạnh, đóng gói, muối, ngâm tẩm hóa chất Mỗi phương pháp có những

ưu điểm và nhược điểm riêng, trong đó việc sử dụng hóa chất bảo quảnlà một biện pháp hiện đại, tiện ích, nếu sử dụng đúng liều lượng, giúpbảo quản, làm chậm hư thối, giữ được phẩm chất và vẻ hấp dẫn củathực phẩm, đồ uống, trái cây đóng hộp, bánh mì vv Trong nhóm chấtbảo quản có axit benzoic và axit sorbic được sử dụng nhiều trong thựcphẩm nhằm mục đích ức chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc gây

hư hỏng thực phẩm

Vì lượng nhỏ axit benzoic và axit sorbic trên nền hữu cơ làkhó phân tích xác định Do đó phải lựa chọn phương pháp phân tíchhữu hiệu nhất Có thể phân tích hai axit này bằng nhiều phương phápkhác nhau như quang phổ uv-vis, sắc kí khối phổ, sắc kí lỏng hiệunăng cao… các phương pháp này cho độ nhạy, độ chính xác cao, nênnhững phương pháp nầy đã được áp dụng để xác định những thànhphần riêng lẽ của các chất Tuy nhiên, cho đến nay việc xác địnhđồng thời hai axit này trong cùng một đối tượng mẫu chưa đượcnghiên cứu

Để góp phần phục vụ công tác kiểm tra an toàn thực phẩm,đồng thời tiết kiệm chi phí, rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi

chọn đề tài: “ Xác định đồng thời axit benzoic và axit sorbic trong

các loại thực phẩm đóng gói bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao” với hai mục tiêu :

- Xây dựng được qui trình phân tích đồng thời axit benzoicvà axit sorbic trong một số thực phẩm đóng gói.

- Áp dụng qui trình phân tích vào thực tế kiểm tra một sốthực phẩm đóng gói đang được sử dụng rộng rãi

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Chất bảo quản

1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quản

1.1.1 Định nghĩa về chất bảo quản

1.1.2 Phân loại chất bảo quản

1.1.3 Giới hạn cho phép sử dụng một số chất bảo quản trong thực phẩm

1.1.4 Tác động bất lợi về việc sử dụng chất bảo quản

1.2 Tổng quan về axit benzoic và axit sorbic

1.2.1 Axit benzoic

1.2.2 Hoạt tính chống vi sinh của axit benzoic

1.2.3 Độc tính của axit benzoic

1.2.4 Axit sorbic

1.2.5 Hoạt tính chống vi sinh của axit sorbic

1.2.6 Độc tính

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

Mục đích của luận văn là nghiên cứu xác định đồng thời axitbenzoic và axit sorbic trong thực phẩm đóng bằng phương phápHPLC dùng detector DAD Những nội dung nghiên cứu cụ thể nhưsau:

1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng để tìm điều kiện thích hợp chophép xác định đồng thời hỗn hợp các chất nêu trên bằng phương phápHPLC dùng detector UV:

+ Xác định bước sóng phát hiện

+ Khảo sát tốc độ dòng pha động

+ Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động

2 Khảo sát các điều kiện thủy phân

+ Khảo sát nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân+ Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp khi phân tích đồngthời các chất thông qua độ ổn định, khoảng tuyến tính, giới hạn pháthiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

4 Xây dựng qui trình phân tích và áp dụng vào thực tế:+ Xây dựng qui trình phân tích

+ Kiểm soát chất lượng qui trình phân tích thông qua độđúng và độ lặp lại

+ Áp dụng qui trình đã xây dựng được để phân tích một sốthực phẩm đóng gói đang lưu hành trên địa bàn thành phố Huế

2.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất

2.2.1 Thiết và dụng cụ

2.2.2 Hóa chất

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

Chọn ngẫu nhiên các mẫu thực phẩm đóng gói trên thịtrường Thừa Thiên Huế, bảo quản theo qui định nhãn sản phẩm Tiếnhành xử lí theo quy trình thích hợp trước khi phân tích [9]

2.3.2 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời axit benzoic và axit sorbic.

1 Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC

Quá trình phân tích mẫu được tiến hành trên máy HPLC cột pha đảo C18, với hệ dung môi pha động phân cực, do vậy mẫu phân tích và mẫu chuẩn phải được hòa tan trong nước, dung dịch được lọcqua màng 0,45 µm

2 Khảo sát bước sóng phát hiện

Dựa vào tài liệu tham khảo [14], chúng tôi tiến hành khảo sátmẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, thể tích tiêm 20 µL,detector UV cho phép lựa chọn và xác định λmax của các chất phântích trên cùng một thí nghiệm

3 Khảo sát ảnh hưởng của pha động

Mục tiêu của khảo sát là tìm ra hệ pha động thích hợp nhất

có khả năng tách pic của hai axit benzoic và axit sorbic tốt hơn so với các pic liền kề

4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng

Dựa vào trọng lượng phân tử, cấu trúc hóa học, tính chất hòatan, tính phân cực của axit benzoic và axit sorbic, kết hợp với việctham khảo tài liệu của hai hoạt chất trên, chúng tôi sử dụng kỹ thuậtsắc ký pha đảo, kỹ thuật này tỏ ra khá hữu hiệu trong việc phân tíchaxit benzoic và axit sorbic

5 Khảo sát các điều kiện thủy phân

Tiến hành thủy phân mẫu trong môi trường kiềm, để lựachọn nhiệt độ và thời gian tốt nhất cho quá trình thủy phân vì hai yếutố này ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả phân tích [15]

2.3.3 Tính tương thích của hệ thống sắc kí

2.3.4 Thẩm định phương pháp

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết quả khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp định lượng hai thành phần.

3.1.1 Khảo sát bước sóng phát hiện

+ Axit benzoic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 210 ÷ 265 nm+ Axit sorbic hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 235 ÷ 274 nmỞ bước sóng 230 nm cả hai chất đều hấp thụ tốt Do vậy,chúng tôi chọn bước sóng 230 nm là bước sóng để khảo sát đồngthời hai axit

Hình 3.1: Phổ UV – Vis của axit benzoic và axit sorbic

3.1.2 Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách

Pha động lựa chọn là hỗn hợp: kali hyđrophosphat :methanol, với thời gian phân tích cho mỗi lần chạy 21 phút, cácthành phần được tách hoàn toàn, phân giải rõ rệt

xứngvà độ phân giải của quá trình tách hỗn hợp axit

benzoic và axit sorbic (n = 6)

Thời gian lưu t R

giải R

1,012(SD =0,011)

1,233(SD =0,019)

10,231(SD =0,021)Từ kết quả ở hình 3.1 và bảng 3.1, chương trình sắc ký đã khảo sát cho phép tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic hoàn toànriêng lẻ Tuy nhiên thời gian phân tích quá dài (tR2 = 19,978 >10 phút) , do đó chúng tôi chọn 2 hướng khắc phục nhược điểm trên là thay đổi tốc độ dòng và độ phân cực của pha động (tỉ lệ pha động)

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách

nhau (n=6)

Tốc độ dòng ml/phútCác thông số

Thời gian lưu tR1

Thời gian lưu tR2

Hệ số đối xứng Sa1

Hệ số đối xứng Sa2

Độ phân giải R

10,68813,2771,1681,24511,94

6,2116,9811,2011,14210,15

4,1125,1241,1251,1279,54

Hình 3.5: Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊)

và độ phân giải (■) vào tốc độ dòng

Chúng tôi chọn tốc độ dòng 1,5ml/phút để khảo sát ảnhhưởng độ phân cực của pha động tới quá trình tách hỗn hợp axitbenzoic và axit sorbic

3.1.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động tới quá trình tách

Khảo sát các tỷ lệ pha động: Tiến hành thử các tỷ lệ pha động kali hyđrophosphat: methanol [50:50], [70:30], [90:10] Tốc độdòng duy trì 1,5ml/phút

(a) (b)

(c) Hình 3.6 SKĐ hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic với tỷ lệ pha động

(a)[50:50], (b)[70:30], (c) [90:10].

Bảng 3.3 Gía trị trung bình các thông số cơ bản của

quá trình tách hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic ở tỷ lệ pha động

khác nhau (n=6)

Pha động [A:B]

Các thông số [90:10] [70:30] [50:50]Thời gian lưu tR1

Thời gian lưu tR2

Hệ số đối xứng Sa1

Hệ số đối xứng Sa2

Độ phân giải R

7,49110,6901,2451,13411,12

5,9708,2711,1321,15210,87

5,0315,7011,1251,2859,35

Hình 3.9 Sự phụ thuộc thời gian lưu của axit sorbic (◊) và độ phân

giải (■) vào độ phân cực của pha động

3.2 Khảo sát các điều kiện thủy phân

Trong đề tài nghiên cứu này,chúng tôi sử dụng phương pháp thủy phân bằng kiềm Trong quá trình thủy phân, yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất đến kết quả của mẫu phân tích là nhiệt độ thủy phân và thời gian thủy phân

3.2.1 Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Tiến hành khảo sát:để khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến khảnăng thủy phân của hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic chúng tôikhảo sát một dãy mẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axitsorbic và thêm 25 ml dung dịch NaOH 0,1N, và mẫu nước giải khátđược thêm chuẩn như nhau, nhưng nhiệt độ thủy phân khác nhau (300C,40; 500C; 600C; 700C; 800C; 900C ; 1000C)

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến kết quả thuỷ

phân của axit benzoic

102,04

100,7

101,52

102,16

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến kết quả thuỷ phân của

axit sorbic

Nhiệt độ

Hình 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến quá trình thủy phân

Kết quả khảo sát ở bảng 3.4 và 3.5 và hình 3.12 cho thấynhiệt độ từ 700C đến 1000C độ thu hồi đạt được cao nhất, nên chúngtôi chọn 700C làm nhiệt độ thủy phân mẫu

3.2.2 Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

Để khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng thủy phâncủa hỗn hợp axit benzoic và axit sorbic, chúng tôi khảo sát một dãymẫu với nồng độ hỗn hợp chuẩn benzoic và axit sorbic và thêm 25

ml dung dịch NaOH 0,1N và mẫu nước giải khát được thêm chuẩnnhư nhau, nhiệt độ thủy phân như nhau 700C nhưng thời gian thủyphân khác nhau (10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45 phút) Kết quả khảosát được trình bày ở bảng 3.6 và 3.7 và hình 3.13.

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của thời gian đến kết quả thuỷ phân

của axit benzoic

4,856

97,12

99,72

101,78

100,30

100,72

107,34

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến kết quả thuỷ

phân của axit sorbic

Thời gian

101,10

100,52

102,04

101,30

Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian đến quá trình thủy phân

+ Nhận xét: Kết quả khảo sát ở bảng 3.6 và 3.7 và hình 3.13cho thấy thời gian từ 30 phút trở lên hiệu suất phản ứng thu được làtốt nhất, chúng tôi chọn 30 phút để tiến hành thủy phân mẫu

3.3 Qui trình định lượng

3.3.1 Khảo sát tính tương thích của hệ thống

Tiến hành tiêm 6 lần mẫu vào hệ thống sắc ký lỏng cao áp ở các điều kiện đã lựa chọn Tính tương thích của hệ thống sắc ký được biểu thị bằng sai số tương đối (RSD) của kết quả sau 6 lần tiêmcủa mẫu

Bảng 3.8 Kết quả độ lặp lại của hệ thống sắc ký

X

RSD (%)

2842,3470,131

3178,0920,138Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy sai số tương đối RSD% thuđược với hai chất đều nhỏ hơn 1%, điều đó chứng tỏ hệ thống sắc kýmà chúng tôi tiến hành là phù hợp và đảm bảo sự ổn định củaphương pháp đã xây dựng

3.3.2 Xác định khoảng tuyến tính của phương pháp định lượng

* Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của axit benzoic – axit sorbic:

Tiến hành chuẩn bị các dung dịch chuẩn như sau:

Dung dịch chuẩn gốc 1000ppm: Cân riêng biệt mỗi loại

chuẩn 0,1g, thêm 2 – 3ml methanol, lắc cho tan hoàn toàn, thêm

nước vừa đủ 100 ml

Dung dịch chuẩn: Từ 2 dung dịch chuẩn gốc trên, pha ra cácchuẩn làm việc 1,0 ; 2,0 ; 5,0 ; 10,0 ; 20,0 ; 25,0 ; 50,0 ; 100,0µg/ml,lọc qua màng milipore 0,45 µm Sau khi máy ổn định tiến hành đo ởđiều kiện đã chọn, tiêm 20µl các dung dịch vào cột

y = 58.526x + 10.693

R 2 = 0.9997

4000 6000 8000 10000 12000

(a) (b)

Hình 3.14 Đường chuẩn của axit benzoic (a), axit sorbic (b)

+ Nhận xét: Qua các phương trình tuyến tính của từng chất

chúng tôi nhận thấy có mối tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữanồng độ và diện tích píc tương ứng thu được trên sắc ký đồ, khoảngphân tích rộng nồng độ từ 0,25 µg/ml đến 200 µg/ml, hệ số tươngquan r2 = 0,9997 đối với axit benzoic và r2 = 1 đối với axit sorbic

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.

1 Giới hạn phát hiện

LOD =

b

S y

0,3

Trong đó Sy : Độ lệch chuẩn của diện tích pic trên đường hồi quy tuyến

tính, b là độ dốc của đường hồi qui tuyến tính

Bảng 3.10 Kết quả xác định giới hạn phát hiện LOD(*)

Phương trình hồi qui tuyến tính, hệ số tương quan (R),

S y và LOD Axit

benzoic

0.250.51.02.0

14.45830.40363.444128.965

Y = 65.53x -2.117

R = 1

Sy = 50,71LOD = 2,3 µg/mL

Axit

sorbic

0.250.51.02.0

13.13829.01561.119125.283

Y = 64.115x -2

R = 1

Sy = 49,62LOD = 2,3 µg/mLPhương pháp đạt LOD khá thấp (2,3µg/ml cho mỗi hoạtchất)

2 Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng LOQ = (3 - 4).LOD

Giới hạn định lượng của axit benzoic:

LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL

Tương tự giới hạn định lượng của axit sorbic:

LOQ = 3* 2,3 = 6,9 µg/mL

3.3.4 Xác định độ lặp lại của phương pháp

Tiến hành 5 thí nghiệm lặp lại và mỗi thí nghiệm tiêm mẫulặp lại 3 lần để lấy giá trị trung bình của diện tích pic

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên mẫu nước

(µg/mL)

Diện tích pic

Nồng độ xác định được

(µg/mL)2962.913

3254.3383273.7803284.7193252.1373285.879

49.2549.8450.0548.8650.42

X

RSD (%)

49.561,62

49.681,26

Theo Horwitz, khi phân tích những nồng độ cỡ mg/L, thì saisố trong nội bộ phòng thí nghiệm nhỏ hơn ½ RSD tính theo côngthức:RSD(%)= 2(1 – 0,5lgC) (C là nồng độ chất phân tích) thì đạt yêucầu

+ Đối với phép phân tích axit benzoic:

RSD(%) = 1,26% ≤ 10 )

50 lg 5 , 0 1

2 2

1 2

RSD(%) = 1,62% ≤ 10 )

50 lg 5 , 0 1

2 2

1 2

3.3.5 Xác định độ đúng của phương pháp

Tiến hành thêm chính xác một lượng axit benzoic – axit sorbic chuẩn vào mẫu thử Tỷ lệ thêm 80 (µg/mL) ; 100 (µg/ml) ; 120 (µg/ml).Định lượng mẫu thêm chuẩn với 3 phép thử song song

Bảng 3.12 Kết quả khảo sát độ đúng trên mẫu nước giải

khát (n= 3)

Hoạt

Lượng có sẵn trong dung dịch (µg/ml)

Lượng thêm vào (µg/ml)

Lượng tìm thấy (µg/ml)

Tỷ lệ thu hồi (%)

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp

đo axit benzoic

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra độ đúng của phương pháp

đo axit sorbic

C Rev (%) 1/2.RSDHorwitz

(%)

Kiểm tra

50 ppm 98,80 4,44 Đạt

+ Nhận xét: Kết quả ở bảng 3.9 và 3.10 cho thấy phương pháp đạt được

độ đúng tốt với độ thu hồi nằm trong khoảng từ 96,83% - 102,47%, thỏa mãn hàm Horwitz

3.4 Xây dựng qui trình phân tích đồng thời axit benzoic – axit sorbic

3.4.1 Điều kiện sắc ký

- Sử dụng cột pha đảo RP18 (150 × 4,6 mm ; 3µm )

- Dung môi pha động: dung dịch kali hyđrophosphat : methanol(70 : 30)

- Thể tích bơm mẫu 20µl

- Tốc độ dòng 1,5 ml/phút

- Nhiệt độ cột : nhiệt độ phòng

- Detector : UV bước sóng λ = 230 nm hay λ = 227 nm,

3.4.2 Kiểm soát qui trình phân tích

+ Đối với mẫu là thực phẩm dạng lỏng

+ Đối với mẫu thực phẩm là dạng rắn

3.4.3 Xây dựng đường chuẩn

3.5 Áp dụng phương pháp xây dựng định lượng một số mẫu thực phẩm trên thực tế

Tiến hành với các điều kiện sắc ký và thao tác như đã xâydựng tùy vào hàm các hoạt chất trong chế phẩm khác nhau có thểpha loãng khác nhau (sao cho nồng độ nằm trong khoảng tuyến tínhxác định của phương pháp đã được xác định) phù hợp với quy trìnhđịnh lượng đã xây dựng