PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Histamine là một amin sinh học có công thức hóa học là C5H9N3, được tạo thành trong quá trình chuyển hóa axit amin histidine dưới sự xúc tác của enzyme L - histidine decarboxylase.. Khi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÀI BÁO CÁO

Môn học: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG ĐỘC TỐ

TRONG SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP

Đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE

TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

GVHD: ThS Phùng Võ Cẩm Hồng

I Đặt vấn đề

- Hiện nay ngộ độc Histamine đang là một

trong những mối nguy phổ biến đối với sức khỏe của người tiêu dùng Ngộ độc Histamine xảy ra

sau khi ăn phải một số hải sản có chứa hàm

lượng cao histamine thường gặp ở các loại cá

thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá thuộc họ

Scombroidiae Các loại cá này có chứa hàm

lượng cao histidine tự do trong mô của chúng

Và khi điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của

vi khuẩn (ví dụ khi cá được bảo quản trong nhiệt độ không thích hợp), enzyme decarboxylase do

vi khuẩn sinh ra sẽ chuyển hóa histidine thành

histamine

1 Histamine là gì?

Histamine là một amin sinh học có công thức hóa học là

C5H9N3, được tạo thành trong quá trình chuyển hóa axit amin histidine dưới sự xúc tác của enzyme L - histidine decarboxylase

Hình 2.2 sự chuyển hóa từ histidine thành

histamine bởi histidine decarboxylase

Histamine có đặc tính chịu nhiệt, thậm chí khi được

nấu chín histamine vẫn không bị phá hủy Khi hàm

lượng histamine trong thức ăn quá cao hoặc enzym

phân hủy histamine (acetaldehyde dehydrogenase hay

histamine - N - methyltransferase và diamine oxidase)

trong cơ thể bị ức chế thì histamine sẽ gây độc cho cơ

thể

2 Ngộ độc histamine

Ngộ độc histamine thường xảy ra nhanh từ một đến vài giờ sau khi ăn Thường với lượng ăn vào từ 8 mg - 40 mg histamine, người nhạy cảm sẽ bị chảy nước mắt, nước bọt, buồn nôn…; từ 1.500 mg - 4.000 mg, người ăn có biểu hiện như nhức đầu, đau bụng, tiêu chảy, mạch nhanh, khó thở, co thắt khí quản, nổi ban mạch nhanh, hạ huyết áp do giãn mạch

Hình 1.2b Các triệu chứng lâm sàn khi ngộ độc

3 Qui định hàm lượng histamine cho phép

Hàm lượng histamine cho phép la khoảng 100 mg/kg

Trích thông tư 29/2010/TT-BNNPTNN ngày 6/5/2010

4 Nguồn histamine

Thực phẩm tươi hầu như không có hoặc có chứa rất ít histamine Vì histamine được tạo thành từ axit amin histidine nên thực phẩm chứa nhiều đạm được bảo quản càng lâu thì lượng histamine càng tăng Thịt, cá đặc biệt là các loại cá biển như cá ngừ, cá nục, cá thu… bị ôi, ươn có hàm lượng histamine cao

II Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

1 Ðối tượng và phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng

histamin trong sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC) Giới hạn phát hiện của

phương pháp là 5 mg/kg

2 Phương pháp tham chiếu

Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số

99 - 1981(Nordic committee on food analysis No 99 -1981)

3 Nguyên tắc

Histamin có trong mẫu thủy sản được tách chiết bằng

metanol Dịch chiết được làm sạch trên cột trao đổi anion;

sau đó, được tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt (OPT) Hàm lượng dẫn xuất histamin được định lượng trên

hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp

ngoại chuẩn

Hình 2.3a Hệ thống HPLC

4 Phương pháp tiến hành

Qui trình trích ly xử lý mẫu

- Cắt toàn bộ mẫu thành những miếng nhỏ và nghiền cơ

học Hỗn hợp khối lượng được và nặng 10g mẫu vào

100ml cốc và thêm 20 ml dung dịch 10% axit tri-chloro

acetic (TCA) và 20 ml nước cất mẫu đồng nhất trong 2

phút sử dụng đồng hóa và chuyển giao mẫu vào 100 ml

bình định mức, thêm nước cất và đợi 10 phút Sau đó,

mẫu được lọc qua giấy lọc Whatman số 1 và pipetted ra

10 ml dịch lọc vào cốc thủy 50ml và điều chỉnh pH đến

4,6 và đi qua các cột pha đảo Amberlite CG-50 nhựa 8

mL mẫu tách rửa được đưa vào 25 ml cốc thủy tinh và

điều chỉnh pH=7 và thực hiện lên đến 10 ml bằng nước

cất

 Qui trình phân tích

- Histamine phản ứng chậm với hệ thống dò tìm bởi dễ bay hơi và thiếu sắc thể, không có tính hấp thụ huỳnh quang chuyên biệt Do đó chất dẫn xuất được dùng để làm tăng

độ nhạy như o-phthalaldehyde (OPA) và Dansyl

chloride

- Dùng pipetted lấy ra 5,0 mL rửa giải pháp sắc ký cột

vào một bình định mức 10,0 ml và thêm 1,00 ml NaOH

1,0 M Sau đó, thêm 0,50 ml OPT 0.1% ,thêm 1.50 mL

H2SO4 1M sau 4 phút và được hỗn hợp thêm nước cất

đến vạch định mức

- Chuẩn bị 100 và 10mg/l chuẩn trung gian

- Chuẩn làm việc 0.5;1.0;1.5;2.0 và 3.0mg/l

5 Kết quả thí nghiệm

6 Kết luận

Sự tích lũy histamine là kết quả của sự lạm dụng thời gian/

nhiệt độ trong quá trình chế biến và bảo quản dẫn đến hư hỏng thực phẩm Để giảm thiểu nguy cơ này tổ chức FDA (2001) đề xuất các loại cá sao khi đánh bắt cần được bảo quản dưới

4oC.Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá được bảo quản không được quá 6 giờ

Cơ quan FDA đã thiết lập tiêu chuẩn cho hàm lượng histamine trong cá ăn được là MRL(giới hạn nồng độ cho

phép)=50mg/kg (FDA, 2005) và các loại cá có hàm lượng

histamine cao hơn qui định sẽ bị cấm bán cho người tiêu dùng Tại Australia thì MRL=200mg/kg và tại Nam Phi thì

MRL=100mg/kg (Auerwald et al.,2006)

Tài li u tham kh oệu tham khảo ảo

An, H., & Ben-Gigirey, B (1998) Scombrotoxin poisoning In I Millar,

D Gray, & N.

Strachan (Eds.), Microbiology of seafoods (pp 68–69) London:

Chapman & Hall

Ltd.

Chen, H C., Kung, H F., Chen, W C., Lin, W F., Hwang, D F., Lee,

Y C., et al (2008).

Determination of histamine and histamine-forming bacteria in tuna

dumpling

implicated in a food-borne poisoning Food Chemistry, 106, 612–618 Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., & Hirvi, T (1993) Liquid

chromatographic

determination of biogenic amines in dry sausages Journal of AOAC

international,

76, 575–577.