PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỢ MƠN CƠNG NGHỆ HÓA HỌC BÀI BÁO CÁO Mơn học: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG ĐỘC TỐ TRONG SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP Đề tài: PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG HISTAMINE TRONG CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) GVHD: ThS Phùng Võ Cẩm Hồng I Đặt vấn đê Hiện ngộ độc Histamine là một những mối nguy phổ biến đối với sức khỏe của người tiêu dùng Ngộ độc Histamine xảy sau ăn phải một số hải sản có chứa hàm lượng cao histamine thường gặp ở các loại cá thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá thuộc họ Scombroidiae Các loại cá này có chứa hàm lượng cao histidine tự mô của chúng Và điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn (ví dụ cá được bảo quản nhiệt độ không thích hợp), enzyme decarboxylase vi khuẩn sinh sẽ chuyển hóa histidine thành histamine - Histamine gì? Histamine amin sinh học có cơng thức hóa học C5H9N3, tạo thành q trình chuyển hóa axit amin histidine xúc tác enzyme L histidine decarboxylase Hình 2.2 sự chuyển hóa từ histidine thành histamine bởi histidine decarboxylase Histamine có đặc tính chịu nhiệt, chí nấu chín histamine khơng bị phá hủy Khi hàm lượng histamine thức ăn cao enzym phân hủy histamine (acetaldehyde dehydrogenase hay histamine - N - methyltransferase diamine oxidase) thể bị ức chế histamine gây độc cho thể Ngộ độc histamine Ngộ độc histamine thường xảy nhanh từ đến vài sau ăn Thường với lượng ăn vào từ mg - 40 mg histamine, người nhạy cảm bị chảy nước mắt, nước bọt, buồn nôn…; từ 1.500 mg - 4.000 mg, người ăn có biểu nhức đầu, đau bụng, tiêu chảy, mạch nhanh, khó thở, co thắt khí quản, ban mạch nhanh, hạ huyết áp giãn mạch Hình 1.2b Các triệu chứng lâm sàn ngộ độc Qui định hàm lượng histamine cho phép Hàm lượng histamine cho phép la khoảng 100 mg/kg Trích thơng tư 29/2010/TT-BNNPTNN ngày 6/5/2010 Nguồn histamine Thực phẩm tươi khơng có có chứa histamine Vì histamine tạo thành từ axit amin histidine nên thực phẩm chứa nhiều đạm bảo quản lâu lượng histamine tăng Thịt, cá đặc biệt loại cá biển cá ngừ, cá nục, cá thu… bị ơi, ươn có hàm lượng histamine cao II Đối tượng phương pháp nghiên cứu Ðối tượng phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hàm lượng histamin sản phẩm thủy sản sắc ký lỏng hiệu cao (sau gọi tắt HPLC) Giới hạn phát phương pháp mg/kg Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn xây dựng dựa theo Tiêu chuẩn NMKL số 99 - 1981(Nordic committee on food analysis No 99 -1981) Nguyên tắc Histamin có mẫu thủy sản tách chiết metanol Dịch chiết làm cột trao đổi anion; sau đó, tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-Phthal alđehyt (OPT) Hàm lượng dẫn xuất histamin định lượng hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn Hình 2.3a Hệ thống HPLC  4 Phương pháp tiến hành Qui trình trích ly xử lý mẫu - Cắt toàn mẫu thành miếng nhỏ nghiền học Hỗn hợp khối lượng nặng 10g mẫu vào 100ml cốc thêm 20 ml dung dịch 10% axit tri-chloro acetic (TCA) 20 ml nước cất mẫu đồng phút sử dụng đồng hóa chuyển giao mẫu vào 100 ml bình định mức, thêm nước cất đợi 10 phút Sau đó, mẫu lọc qua giấy lọc Whatman số pipetted 10 ml dịch lọc vào cốc thủy 50ml điều chỉnh pH đến 4,6 qua cột pha đảo Amberlite CG-50 nhựa mL mẫu tách rửa đưa vào 25 ml cốc thủy tinh điều chỉnh pH=7 thực lên đến 10 ml nước cất 10  Qui trình phân tích - Histamine phản ứng chậm với hệ thống dị tìm dễ bay thiếu sắc thể, khơng có tính hấp thụ huỳnh quang chuyên biệt Do chất dẫn xuất dùng để làm tăng độ nhạy o-phthalaldehyde (OPA) Dansyl chloride - Dùng pipetted lấy 5,0 mL rửa giải pháp sắc ký cột vào bình định mức 10,0 ml thêm 1,00 ml NaOH 1,0 M Sau đó, thêm 0,50 ml OPT 0.1% ,thêm 1.50 mL H2SO4 1M sau phút hỗn hợp thêm nước cất đến vạch định mức - Chuẩn bị 100 10mg/l chuẩn trung gian - Chuẩn làm việc 0.5;1.0;1.5;2.0 3.0mg/l 11 Kết thí nghiệm 12 Kết luận Sự tích lũy histamine kết lạm dụng thời gian/ nhiệt độ trình chế biến bảo quản dẫn đến hư hỏng thực phẩm Để giảm thiểu nguy tổ chức FDA (2001) đề xuất loại cá đánh bắt cần bảo quản 4oC.Thời gian từ lúc cá chết đến lúc cá bảo quản không Cơ quan FDA thiết lập tiêu chuẩn cho hàm lượng histamine cá ăn MRL(giới hạn nồng độ cho phép)=50mg/kg (FDA, 2005) loại cá có hàm lượng histamine cao qui định bị cấm bán cho người tiêu dùng Tại Australia MRL=200mg/kg Nam Phi MRL=100mg/kg (Auerwald et al.,2006) 13 Tài liệu tham khảo An, H., & Ben-Gigirey, B (1998) Scombrotoxin poisoning In I Millar, D Gray, & N Strachan (Eds.), Microbiology of seafoods (pp 68–69) London: Chapman & Hall Ltd Chen, H C., Kung, H F., Chen, W C., Lin, W F., Hwang, D F., Lee, Y C., et al (2008) Determination of histamine and histamine-forming bacteria in tuna dumpling implicated in a food-borne poisoning Food Chemistry, 106, 612–618 Eerola, S., Hinkkanen, R., Lindfors, E., & Hirvi, T (1993) Liquid chromatographic determination of biogenic amines in dry sausages Journal of AOAC international, 76, 575–577 14 ... lượng cao histamine thường gặp ở các loại cá thu, cá ngừ, cá nục và một số loài cá thuộc họ Scombroidiae Các loại cá này có chứa hàm lượng cao histidine tự mô của chúng... histidine thành histamine bởi histidine decarboxylase Histamine có đặc tính chịu nhiệt, chí nấu chín histamine khơng bị phá hủy Khi hàm lượng histamine thức ăn cao enzym phân hủy histamine (acetaldehyde... ngộ độc Histamine là một những mối nguy phổ biến đối với sức khỏe của người tiêu dùng Ngộ độc Histamine xảy sau ăn phải một số hải sản có chứa hàm lượng cao histamine