Nghiên cứu, xác định mối quan hệ giữa kiểu gene Halothane và chất lượng tinh dịch một số lợn đực giống nuôi tại Thái Nguyên

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản th¬¬¬¬¬¬¬¬ân, tôi còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, hướng dẫn tận tình của các cá nhân, tập thể và đơn vị khác. Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy ThS. Ngô Thành Trung, bộ môn Công nghệ sinh học Động vật; thầy ThS. Nguyễn Quốc Trung, phó trưởng bộ môn Công nghệ sinh học Phân tử và Ứng dụng, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; cô – TS. Ngô Thị Kim Cúc, trưởng bộ môn Di truyền giống vật nuôi, Viện Chăn nuôi Quốc gia đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo và các cán bộ bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình dạy bảo tôi trong suốt 4 năm học qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ, công nhân viên của Trạm truyền giống gia súc – Trung tâm vật nuôi Thái Nguyên, phòng thí nghiệm JICA – HUA đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp trong thời gian vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn trong nhóm sinh viên nghiên cứu khoa học lớp CNSHA – K55, CNSHB – K55, CNSHA – K56, CNSHB – K56, CNSHC – K56 đã tham gia giúp đỡ tôi rất nhiệt tình trong quá trình làm đề tài tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình đã luôn ở bên tôi, chăm sóc, động viên tôi và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này. Hà Nội, ngày 3 tháng 1 năm 2014 Sinh viên Đào Văn Hoàng MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT BÁO CÁO viii PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu 1 1.3 Yêu cầu 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về tinh dịch và thành phần tinh dịch ở lợn 3 2.2 Hình thái, cấu tạo tinh trùng và quá trình sinh tinh ở lợn 5 2.2.1 Hình thái và cấu tạo tinh trùng 5 2.2.2 Quá trình hình thành tinh trùng 7 2.3 Một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh dịch lợn 9 2.3.1 Thể tích tinh dịch 9 2.3.2 Hoạt lực tinh trùng 9 2.3.3 Nồng độ tinh trùng 10 2.3.4 Độ pH của tinh dịch 10 2.3.5 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 10 2.3.6 Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần khai thác 10 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch và tinh trùng lợn 11 2.4.1 Giống 11 2.4.2 Tuổi của lợn đực 11 2.4.3 Các yếu tố thời tiết, khí hậu 11 2.4.4 Trạng thái sức khỏe của lợn đực giống 11 2.4.5 Tần suất khai thác 12 2.4.6 Ảnh hưởng của một số gene 12 2.4.7 Chế độ dinh dưỡng 12 2.5 Tổng quan về gene Halothane trên lợn 13 2.5.1 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng thịt 19 2.5.2 Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng tinh dịch 20 2.5.3 Ảnh hưởng của gene Halothane đến sức sinh sản 21 2.5.4 Tác động tích cực của kiểu gene Halothane 22 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23 3.1 Vật liệu nghiên cứu 23 3.1.1 Đối tượng 23 3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 23 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.3 Phương pháp nghiên cứu 24 3.3.1 Phương pháp xác định pH của tinh dịch 24 3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng 24 3.3.3 Phương pháp xác định hoạt lực tinh trùng 26 3.3.4 Phương pháp xác định tinh trùng kỳ hình 26 3.3.5. Phương pháp xác định sức kháng của tinh trùng 26 3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 27 3.3.7 Phương pháp lấy mẫu lông lợn 28 3.3.8 Phương pháp tách chiết DNA từ gốc lông lợn 28 3.3.9 Phương pháp PCR 29 3.3.10 Phương pháp cắt bằng Enzyme cắt giới hạn 29 3.3.11 Phương pháp điện di 30 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chất lượng tinh dịch 33 4.1.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu pH tinh nguyên 33 4.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu thể tích tinh dịch 34 4.1.3 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng 36 4.1.4 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu nồng độ tinh nguyên 37 4.1.5 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu kỳ hình tổng số tinh nguyên 39 4.1.6 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu sức kháng tinh trùng 41 4.1.7 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu V.A.C 42 4.2. Ảnh hưởng của gene Halothane tới chất lượng tinh dịch 44 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA từ gốc lông 44 4.2.2. Kết quả quá trình PCR nhân gene Halothane 45 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1. Kết luận 49 5.2. Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần hóa học tinh dịch của một số loài gia súc . 5 Bảng 4.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu tinh nguyên của các giống lợn nghiên cứu 32 Bảng 4.2. Giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn nghiên cứu 33 Bảng 4.3. Giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống nghiên cứu 34 Bảng 4.4. Giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 36 Bảng 4.5. Giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 38 Bảng 4.6. Giá trị trung bình kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu 39 Bảng 4.7. Giá trị trung bình sức kháng tinh trùng của 3 giống nghiên cứu 41 Bảng 4.8. Giá trị trung bình VAC của 3 giống nghiên cứu 42 Bảng 4.9. Bảng giá trị OD các mẫu DNA ở bước sóng 260 nm 44 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu tạo tinh trùng lợn 7 Hình 2.2. Sơ đồ quá trình sinh tinh trùng 8 Hình 2.3. Sơ đồ cơ chế điều hòa nội tiết quá trình sinh tinh 8 Hình 2.4. Trình tự một đoạn của gene Halothane 14 Hình 2.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane 15 Hình 2.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme HhaI 15 Hình 2.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gene Halothane với DNA được tách chiết theo phương pháp 2 17 Hình 2.8. Hình ảnh điện di sản phầm PCR sau khi ủ với Enzyme CfoI 17 Hình 2.9. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme BsiHKAI 18 Hình 2.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi ủ với Enzyme Hin PI 19 Hình 2.11. Hình ảnh thịt PSE và DFD 20 Hình3.1. Buồng đếm Thoma 25 Hình 3.2. Vùng đếm tinh trùng 25 Hình 3.3. Cách đếm tinh trùng 25 Hình 3.4. Sơ đồ phương pháp 2 lọ xác định tính kháng 27 Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn 33 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống 35 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống 36 Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống 38 Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình tỉ lệ kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống 40 Hình 4.6. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình sức kháng tinh trùng của 3 giống 41 Hình 4.7. Biểu đồ thể hiện giá trị VAC của 3 giống nghiên cứu 43 Hình 4.8. Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ gốc lông của các cá thể thuộc các giống nghiên cứu 44 Hình4.9. Hình ảnh điện di DNA tách chiết từ đuôi và lông 45 Hình 4.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 46 Hình 4.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi giảm thể tích DNA đi một nửa 47 Hình 4.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với nồng độ mồi khác nhau 47 Hình 4.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với Master Mix và thành phần riêng lẻ 48 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT < Nhỏ hơn > Lớn hơn ± Cộng hoặc trừ A Hoạt lực của tinh trùng (%) C Nồng độ tinh trùng (triệu tinh trùng ml) V Thể tích tinh dịch (ml) K Tỷ lệ kỳ hình (%) V.A.C Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần xuất tinh R Sức kháng bp Base pair BSA Brovin Serum Albumine cs Cộng sự dd Dung dịch EDTA Etylendiamine tetra acetic acid TE Tris.HClEDTA TAE Tris.HClAxit AxeticEDTA DNA Deoxy nucleic acid NST Nhiễm sắc thể LH Luteinizing hormone FSH Folliclestimulating hormone GH Hormone sinh trưởng TNNT Thụ tinh nhân tạo Nu Nucleotide ryr1 rynodine receptor PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme (Enzyme cắt giới hạn) U Unit (đơn vị) PSE pale, soft, exudative (nhạt màu, mềm, rỉ dịch) DFD dark, firm, dry (sậm màu, cứng, khô) HN Halothane Negative HP Halothane Positive GTTB Giá trị trung bình SD Standard deviation TÓM TẮT BÁO CÁO Nghiên cứu nhằm đánh giá, so sánh ảnh hưởng của yếu tố giống (Piétrain thuần, Landrace thuần và PiDu) đến chất lượng tinh dịch của 1 số lợn đực thí nghiệm nuôi tại Trạm truyền giống gia súc Trung tâm giống vật nuôi Thái Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Trên cơ sở đó, tiếp tục đánh giá ảnh hưởng của kiểu gene Halothane tới chất lượng tinh dịch của các lợn đực thí nghiệm thuộc các giống trên. Thí nghiệm 1 – Đánh giá ảnh hưởng của nhân tố giống đến chất lượng tinh dịch lợn: sử dụng tinh dịch 18 lợn đực giống (6 con Piétrain thuần, 6 con Landrace thuần và 6 con lai PiDu), mỗi con lặp lại sáu lần. Đánh giá các chỉ tiêu tinh dịch gồm pH, hoạt lực (A %), thể tích (V ml), nồng độ (C triệu tinh trùngml), kỳ hình (K %), R (sức kháng của tinh trùng), V.A.C (tổng số tinh trùng tiến thẳnglần khai thác). So sánh giá trị trung bình của các chỉ tiêu giữa các giống lợn. Kết quả: Giống Landrace có thể tích tinh dịch trong 1 lần khai thác (Vml) lớn nhất (300.56±42.18), thứ 2 là giống Piétrain (275±30.66), thấp nhất là giống PiDu (203.02±5.9) (P