Lợn mang kiểu gene nn có tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn, tỷ lệ nạc trong quầy thịt, diện tích thịt thăn, tỷ lệ thịt xẻ cao hơn, bên cạnh đó trọng lượng xương đùi, độ dày mỡ lưng thấp hơn lợn có kiểu gene NN, Nn (Rundgren và cs, 1990) [31]. Trái lại, lợn mang kiểu gene nn tăng trưởng chậm 10 - 20%, tỉ lệ chết cao từ giai đoạn sơ sinh đến khi xuất chuồng 20 – 30%, tỉ lệ quầy thịt PSE tăng 25%, giảm 0,5 con/ổ đẻ và kéo dài khoảng cách giữa hai lứa đẻ ở lợn nái, giảm khả năng xuất tinh ở lợn đực. Lợn mang kiểu gene Nn có tỷ lệ nạc quầy thịt, diện tích cơ thăn thấp hơn so với lợn mang kiểu gene nn nhưng lại cao hơn so với lợn mang kiểu
gene NN. Ngoài ra lợn mang kiểu gene Nn có dày mỡ lưng thấp hơn, hệ số chuyển hóa thức ăn tốt hơn và khả năng hình thành thịt PSE cao hơn so với lợn mang kiểu gene NN (Rundgren, 1990) [31]. Theo Mitchell và Heffron, 1982 [32], lợn mang kiểu gene NN, Nn có tính kháng stress tốt hơn so với lợn mang kiểu gene nn.
Cải thiện hiệu quả chuyển hóa thức ăn, giảm dày mỡ lưng, tăng diện tích thịt thăn và tăng tỉ lệ nạc quầy thịt là những cải thiện đáng kể của ngành công nghiệp chăn nuôi lợn. Tuy nhiên, những tác động hạn chế của gene Halothane lên phẩm chất thịt, sinh sản, sinh trưởng không thể không kể đến. Cách tốt nhất để hạn chế những thiệt hại do gene Halothane gây ra đối với ngành chăn nuôi lợn là nên loại bỏ gene này ra khỏi đàn lợn giống. Bên cạnh đó cũng có ý kiến cho rằng nên giữ lại gene này ở dạng dị hợp tử Nn do những ưu điểm về tỷ lệ nạc quầy thịt và tính kháng stress. Tuy nhiên, nên cân nhắc về khả năng hình thành thịt PSE của lợn mang kiểu gene Nn nhằm có sự lựa chọn hợp lý để mang lại hiệu quả cao nhất. Trước thực tế đó, việc phát hiện sớm gene này trong đàn lợn giống là hết sức cần thiết để ngành chăn nuôi kiểm soát được tác động xấu của gene Halothane.
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Vật liệu nghiên cứu
3.1.1 Đối tượng
Các mẫu tinh dịch thu được từ 18 lợn đực giống của 3 giống (Piétrain thuần, PiDu và Landrace thuần) mỗi giống sáu con tại Trạm truyền giống gia súc - Trung tâm giống vật nuôi Thái Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Tất cả các con lợn đang trong độ tuổi khai thác.
Các mẫu lông của từng con lợn trong từng giống được bảo quản trong NaCl 1%, sau đó kiểm tra gene Halothane tại phòng thí nghiệm JICA - HUA và Bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, thị trấn Trâu Quỳ, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội.
3.1.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
a. Các loại hóa chất
- Hóa chất trong quy trình tách chiết DNA từ gốc lông của lợn
Tris.HCl (50mM, pH=8), EDTA (100mM, pH=8), NaCl (100mM), SDS (Sodium dodecyl sulfat, 1%), Protease K (0.5mg/ml), 25:24:1 (Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol), 24:1 (Chloroform/Isoamyl alcohol), cồn 100%, cồn 70%, đệm TE (Tris.HCl/EDTA).
- Hóa chất trong quy trình PCR và điện di
+ Mồi xuôi có trình tự: 5’-TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA-3’ + Mồi ngược có trình tự: 5’-ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG -3’ + Nước khử ion, Agarose, Ethydium Bromide, TAE 1X (Tris HCl/Acid acetic/EDTA)
+ Master mix 2X (của hãng Promega sản xuất, thành phần gồm: dNTP, Buffer, Taq Polymerase, Mg2+)
b. Dụng cụ thí nghiệm
- Kính hiển vi, bể ổn nhiệt, giấy quỳ, cân kỹ thuật và cân phân tích, buồng đếm Neu Bauer, micropipet, đầu côn các loại, lam kính, lamen, giấy lau, lọ nhựa bảo quản tinh dịch, ống Fancol 10 ml, ống Eppendorf, cốc đong, đĩa ấm.
- Pipette, ống Eppendorf (1.5ml), máy Spin, máy lắc, tủ sấy, máy li tâm, máy PCR, bể điện di, lò vi sóng, khuấy từ, đầu ống côn.
3.2 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1 - Thí nghiệm 1. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố giống đến chất lượng tinh dịch lợn
Chất lượng tinh dịch của từng cá thể lợn được đánh giá thông qua các chỉ tiêu: thể tích tinh dịch (V - ml), hoạt lực tinh trùng (A - % tinh trùng tiến thẳng), nồng độ tinh trùng (C – triệu tinh trùng / ml), sức kháng tinh trùng (R – số lần bổ sung NaCl 1% cho đến khi toàn bộ tinh trùng chết), độ pH tinh dịch, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %), chỉ tiêu tổng hợp V.A.C (tổng số tinh trùng tiến thẳng/lần khai thác).
Các chỉ tiêu được đánh giá trên sáu con lợn đực trong mỗi giống, mỗi lợn đực được lặp lại sáu lần. So sánh giá trị trung bình của các chỉ tiêu giữa các giống lợn (ba giống gồm Piétrain thuần, con lai PiDu giữa Piétrain và Duroc, và Landrace) từ đó, rút ra kết luận về ảnh hưởng của yếu tố giống đến chất lượng tinh dịch lợn.
Nội dung 2 - Thí nghiệm 2. Đánh giá ảnh hưởng của kiểu gene Halothane đến chất lượng tinh dịch lợn đực giống
Thu mẫu lông của các cá thể đực từ thí nghiệm 1, kiểm tra kiểu gene Halothane, so sánh chất lượng tinh dịch của các đực giống thuộc nhóm kiểu gen NN, Nn và nn. Từ đó, rút ra kết luận về ảnh hưởng của kiểu gene Halothane đến chất lượng tinh dịch lợn đực giống.
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp xác định pH của tinh dịch
Dùng giấy quỳ xác định pH của tinh nguyên, giá trị pH được so sánh bằng phương pháp so màu, cần xác định ngay khi tinh được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Việc xác định pH tinh nguyên cần được tiến hành nhanh.
3.3.2 Phương pháp xác định nồng độ tinh trùng
Áp dụng phương pháp của Milovanov, 1972 [42]:
- Chuẩn bị dụng cụ: ống Fancol 10 ml, buồng đếm Thoma, lamen dài, micropipette, đầu côn, kính hiển vi.
- Tiến hành: Sau khi đưa tinh nguyên về tới phòng thí nghiệm, nhanh chóng lấy 50 µl tinh nguyên trộn đều trong 9950 µl dung dịch NaCl 10%, lắc đều, đưa dung dịch vào 2 phía của buồng đếm Thoma → xác định mật độ tinh trùng → tính nồng độ.
Hình3.1. Buồng đếm Thoma
Hình 3.2. Vùng đếm tinh trùng Hình 3.3. Cách đếm tinh trùng
Công thức tính nồng độ tinh trùng
Trong mỗi ô lớn đều có 16 ô nhỏ (16 ô × 5 = 80 ô nhỏ) Diện tích của ô vuông nhỏ nhất là 0.0025 mm2
Chiều cao của buồng đếm là 0.1 mm
Như vậy thể tích buồng đếm là: 0.1 × 0.0025 × 80 = 1/50 mm3
Trong thể tích 1/50 mm3, tinh dịch đã pha loãng K lần, ta đếm được n tinh trùng. Vậy trong 1mm3 tinh nguyên ta có: C = n.K.50
Và trong 1ml tinh nguyên ta có: C = n.K.50.1000 Tinh dịch pha loãng K = 100, ta có:
C = n.100.50.1000 = n.5.106 tinh trùng/ml = n.5 (triệu tinh trùng/ml)
3.3.3 Phương pháp xác định hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực của tinh trùng được xác định theo phương pháp của Herrick và Self, 1962 [17], nhỏ 3 giọt tinh nguyên lên lam kính, quan sát trên kính hiển vi, xác định tỷ lệ % tinh trùng vận động tiến thẳng (Progressive Motility), % tinh trùng vận động tại chỗ và xoay tròn (Local Motility), % tinh trùng không vận động (Immotile). Ước lượng tỷ lệ trung bình sau khi quan sát từ 3 giọt tinh nguyên.
3.3.4 Phương pháp xác định tinh trùng kỳ hình
Làm tiêu bản cố định và quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Cho 300µl tinh nguyên vào ống Eppendorf có chứa 700µl dung dịch Formolcitrate 4%.
Dùng lam kính sạch, sấy khô, nhỏ một giọt tinh đã được cố định lên lam. Dùng lamen sạch, trong, đã sấy khô đặt nghiêng từ từ lên phần lam kính có chứa giọt tinh, sao cho tiêu bản được cố định mà không có bọt khí. Phần dung dịch thừa được thấm hết bằng giấy thấm.
Đưa tiêu bản đã cố định lên quan sát trên kính hiển vi. Quan sát và đếm số tinh trùng kỳ hình trong tổng số 200 tế bào quan sát được.
Các dạng kỳ hình: được trình bày trong phần phụ lục.
Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình được tính bằng tổng số tinh trùng kỳ hình đếm được chia cho 200 là tổng số tinh trùng được đếm.
3.3.5. Phương pháp xác định sức kháng của tinh trùng
Hình 3.4. Sơ đồ phương pháp 2 lọ xác định tính kháng
Cách tiến hành:
Dùng micropipet hút 0,01 ml tinh dịch nguyên cho vào lọ I đã chứa sẵn 5 ml NaCl 1%, lắc đều. Như vậy, tinh dịch ở lọ thứ nhất đã được pha loãng 500 lần. Hút 0,5 ml dung dịch ở lọ I cho vào lọ II đã chứa sẵn 0,5 ml NaCl 1%, sau đó dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ, lắc đều ở lọ II tinh dịch được pha loãng 1000 lần. Lấy một giọt dung dịch ở lọ II đưa lên kính hiển vi để quan sát. Nếu thấy tinh trùng vẫn còn hoạt động thì ta lại cho thêm 0,1 ml NaCl 1% vào trong lọ II, lắc nhẹ, khuấy đều, rồi lại lấy 1 giọt dung dịch ở lọ II đưa lên kính hiển vi quan sát. Nếu thấy tinh trùng vẫn còn hoạt động, thì tiếp tục cho thêm 0,1ml NaCl 1% vào lọ II và các bước thao tác được làm như trên cho đến khi tất cả tinh trùng ngừng hoạt động thì dừng lại.
Lúc đó, sức kháng của tinh trùng được tính theo công thức: R = ro + n.r
Trong đó: ro là mức pha loãng tinh trùng tại thời điểm kiểm tra đầu tiên
r là mức pha loãng sau mỗi lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% . n là số lần cho thêm 0,1 ml dung dịch NaCl 1% .
Trong trường hợp của ví dụ trên thì ro = 1000 và r = 100. Như vậy sức kháng của tinh trùng trong trường hợp này là : R = 1000 + n . 100 = 100 (10 +n)
3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được tổng hợp và xử lý thống kê bằng Excel và phần mềm SAS – thống kê trong Nông nghiệp.
3.3.7 Phương pháp lấy mẫu lông lợn
Phương pháp được tiến hành theo hướng dẫn của thầy Ngô Thành Trung, bộ môn Công nghệ sinh học Động vật, khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Các mẫu lông của từng con lợn trong từng giống được thu (bằng cách nhổ cả gốc lông) tại Trạm truyền giống gia súc, trung tâm giống vật nuôi Thái Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Sau đó, được bảo quản trong NaCl 1% và đem về phòng thí nghiệm, bảo quản trong tủ lạnh.
3.3.8 Phương pháp tách chiết DNA từ gốc lông lợn
- Dùng kéo cắt gốc lông (10 – 20 gốc) thành những đoạn ngắn (0.5 cm) bỏ vào cối sứ đã khử trùng, thêm 1ml dd DNA digestion buffer và nghiền bằng chày (dd DNA digestion buffer gồm có Tris HCl – 50mM/pH=8, EDTA – 100mM/pH=8, NaCl – 100mM, SDS – 1%), sau đó bổ sung thêm Protease K (0.5 mg/ml).
- Đổ dịch vừa nghiền vào ống Eppendorf (1.5ml), ủ qua đêm ở 370C.
- Thêm 0.7 ml 25:24:1 vào mỗi ống, lắc nhẹ trong vòng 1h, spin nhẹ và li tâm ở 12000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút.
- Hút dịch nổi bỏ sang ống mới, tiếp tục thêm 0.7ml 24:1, lắc nhẹ trong 30 phút, và li tâm ở 12000 vòng/phút, ở 40C trong 10 phút.
- Hút dịch nổi, bỏ sang ống mới, sau đó thêm 1 lượng thể tích cồn 100% tương đương với lượng có trong ống Eppendorf. Dùng tay lắc nhẹ ống Eppendorf, sau đó li tâm ở 12000 vòng/phút ở 40C trong 10 phút.
- Đổ bỏ dịch nổi, thu cặn, tiếp tục thêm 0.5ml cồn 70% vào trong ống (dùng pipette để trộn đều cặn với cồn) và li tâm ở 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Lặp lại bước này 3 lần để loại bỏ muối ra khỏi DNA.
- Đổ bỏ dịch nổi, để ống ở 370C trong 15 phút để cồn bay hơi.
- Thêm 30µl dd đệm TE 0.1X, ủ ở 370C trong 15 phút, sau đó điện di DNA tổng số.
3.3.9 Phương pháp PCR
Sau khi điện di DNA tổng số, tiến hành chuẩn bị phản ứng PCR nhân gene Halothane. Phản ứng PCR nhân gen Halothane được thực hiện theo phương pháp của Otsu và cs, 1992 [25] và Nakajima và cs, 1996 [37]
Phản ứng được chia thành 4 giai đoạn: 1) 940C - 3 phút. 2) 35 chu kỳ (940C - 1 phút, 640C -1 phút, 720C - 2 phút). 3) 720C - 8 phút. 4) 40C - ∞. Thể tích 20 µl của phản ứng gồm: - 4 µl DNA khuôn.
- 2 µl mồi xuôi và 2 µl mồi ngược.
+ Mồi xuôi có trình tự: 5’-TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA-3’ + Mồi ngược có trình tự: 5’-ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG -3’
- 10 µl Master Mix 2X.
- 2 µl nước khử ion (deion water).
Bằng phương pháp trên, đoạn DNA thu được có chiều dài 659 bp. Đoạn DNA được tổng hợp này (giới hạn bởi cặp mồi xuôi và ngược) chứa điểm đột biến ở vị trí nucleotide thứ 1843 (C thành T) của gene Halothane. Lúc này, đã có sản phẩm DNA - PCR có chứa điểm đột biến của gen Halothane.
3.3.10 Phương pháp cắt bằng Enzyme cắt giới hạn
Phương pháp này được sử dụng khi gene Halothane đã được nhân lên (nhận biết bằng điện di với Ladder 100bp sau khi chụp với tia UV). Quy trình gồm các bước sau:
- Chuẩn bị các thành phần trước khi ủ + DNA sau khi PCR: 5µl
+ Buffer: 2 µl
+ Acetyl BSA: 0.2 µl + Nước khử ions: 12.3 µl
Dùng pipette trộn đều hỗn hợp, sau đó thêm 0.2 µl Enzyme cắt giới hạn HhaI - Dùng pipette trộn đều, spin nhẹ
- Ủ ở 370C từ 1 – 4 h, sau đó kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên Agarose 2% Đây là bước tiếp theo sau khi đã nhân gene Halothane với cặp mồi và chu trình nhiệt như trên. Trong bước này, sử dụng enzyme giới hạn HhaI để nhận biết và cắt đoạn DNA bình thường không chứa điểm đột biến tại vị trí nucleotit 1843thành 2 đoạn có chiều dài 524 bp và 135 bp. Như vậy, trong trường hợp lợn có kiểu gene đồng hợp tử trội NN, enzyme HhaI sẽ nhận biết được và cắt cả hai mạch DNA. Khi đó sẽ cho 2 đoạn DNA có chiều dài là 524 bpvà 135 bp. Ở lợn có kiểu gene đồng hợp tử lặn nn, tức là cả hai mạch DNA đều chứa điểm đột biến của gene Halothane, enzyme HhaI sẽ không nhận biết được điểm cắt (đã thay nucleotit C bằng T), do vậy enzyme này sẽ không cắt DNA và trong trường hợp này sẽ chỉ có đoạn DNA gồm
659 bp. Kiểu gen dị hợp tử Nn sẽ có một mạch DNA (chứa allene N) bị cắt và tạo thành đoạn 524 bp và 135 bp, còn mạch DNA khác (chứa allene n) sẽ không bị cắt và vẫn giữ nguyên chiều dài 659 bp. Trong trường hợp này, sản phẩm thu được là các đoạn DNA có chiều dài 659, 524 và 135 bp. Để nhận biết được chiều dài các đoạn cắt thì phải tiến hành điện di.
5’ - GCG C - 3’ 3’ - C GCG - 5’
Hình 3.5. Vị trí cắt của enzyme HhaI 3.3.11 Phương pháp điện di
Phương pháp này nhằm kiểm tra, xác định sự nhân lên của gene Halothane sau khi PCR và gene Halothane tồn tại ở trạng thái đồng hợp (trội/lặn) hay dị hợp sau khi được cắt với enzyme cắt giới hạn HhaI.
Ở phương pháp này, sử dụng Agarose 2%. Quy trình được thực hiện qua các bước sau:
- Pha đệm TAE 1X (TAE: Tris HCl-Acid Acetic-ETDA)
- Cân Agarose (2%) và đổ vào đệm TAE, sau đó đun nóng hỗn hợp bằng lò vi sóng sao cho hỗn hợp đồng nhất thành dd trong suốt, không màu
- Thêm thuốc nhuộm Ethydium Bromide (thường dùng với tỉ lệ 1 µl cho 100ml Agarose 2%).
- Đổ ra khay (chờ cho dd còn khoảng 400C rồi đổ). Sau đó chờ 15-20’ cho cứng rồi cho vào bể điện di.
- Sử dụng đệm TAE 1% cho điện đi, tra mẫu vào giếng và điện di (thường sử dụng 5-10 µl).
- Sau đó chụp ảnh và đọc kết quả.
Do DNA có một lượng phosphate tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện, DNA sẽ di chuyển ngược chiều điện trường. Các đoạn cắt DNA tách khỏi nhau tương ứng với kích thước của chúng và di chuyển với tốc độ khác nhau. Các đoạn DNA có kích thước lớn sẽ chạy chậm hơn so với các đoạn DNA có kích thước nhỏ, các đoạn DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn về phía ngược chiều điện trường. Nhờ tác dụng của thuốc nhuộm Ethidium bromide, DNA phát quang dưới ánh đèn tử ngoại, do vậy sẽ quan sát được các vạch cắt DNA khác nhau (các đoạn
DNA có chiều dài khác nhau). Căn cứ vào thang chuẩn (Ladder) sẽ biết được các