Sử dụng quy trình nhân gene Halothane theo phương pháp của Otsu và cs, 1992 [25] và Nakajima và cs, 1996 [37]:
Phản ứng được chia thành 4 giai đoạn: 1) 940C - 3 phút,
2) 35 chu kỳ (940C - 1 phút, 640C -1 phút, 720C - 2 phút), 3) 720C - 8 phút
4) 40C-∞.
- 4 µl DNA khuôn.
- 1 µl mồi xuôi và 1 µl mồi ngược
+ Mồi xuôi có trình tự: 5’-TCC AGT TTG CCA CAG GTC CTA CCA-3’ + Mồi ngược có trình tự: 5’-ATT CAC CGG AGT GGA GTC TCT GAG -3’ - 10 µl Master Mix 2X (Hãng Promega sản xuất)
- 4 µl nước khử ion.
Sau đó, điện di kiểm tra thấy xuất hiện 1 băng vạch sáng nhưng không dùng Ladder để so sánh, và qua thí nghiệm trên, có thể gene Halothane đã được nhân lên.
Hình 4.10. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR
Tuy nhiên, các lần tiếp theo PCR theo như quy trình và điện di trên gel 2% thì vạch sáng xuất hiện nữa.
Trong quá trình PCR, nồng độ DNA thường dùng trong khoảng từ 20 – 100 ng/µl. Nếu lượng DNA lớn sẽ gây ra việc tổng hợp các sản phẩm không đặc hiệu. Ở thí nghiệm này đã giảm thể tích DNA giảm đi một nửa (4 µl xuống còn 2 µl). Mặc dù vậy, vạch sáng vẫn không xuất hiện.
Hình 4.11. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi giảm thể tích DNA đi một nửa
Trong quá trình PCR, nồng độ mồi sử dụng trong khoảng từ 100 – 500 nM, nếu ít quá sẽ không đủ cho phản ứng, không có băng hoặc băng mờ nhạt. Ngược lại, nồng độ mồi cao sẽ ức chế phản ứng, gây sai lệch phản ứng.
Thí nghiệm tiếp theo sử dụng mồi ở nồng độ 100 µM (1 µl), song phản ứng vẫn không xảy ra, điện di vẫn không thấy vạch sáng. Sau đó, tiến hành thí nghiệm giảm nồng độ mồi xuống còn 10 µM và kết quả vẫn chưa thu được vạch sáng sau khi chạy với Ladder. Dưới đây là hình ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi ở nồng độ 100 µM và 10 µM:
PCR sử dụng mồi ở nồng độ 10 µM PCR sử dụng mồi ở nồng độ 100 µM
Thí nghiệm tiếp tục được tiến hành do nghi ngờ Master Mix 2X có vấn đề (một số giảng viên và nghiên cứu viên bên khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thủy sản cũng đã làm và rút ra kinh nghiệm này). Sau đó, tiến hành thí nghiệm với các thành phần riêng lẻ của quá trình PCR. Các thành phần gồm:
- DNA: 2 µl
- dNTP: 0.5 µl (10mM) - MgCl2: 1.5 µl (25mM) - Buffer: 2.5 µl
- Mồi xuôi, mồi ngược: Mỗi loại 1 µl - Taq Polymerase: 0.25 µl
- Nước khử ion: 15.75 µl
Tuy vậy, sau khi PCR và điện di sản phẩm thì vẫn không thấy xuất hiện vạch sáng xuất hiện như lần đầu.
PCR với các thành phần riêng lẻ PCR với Master Mix 2X
Hình 4.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với Master Mix và thành phần riêng lẻ
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận
Thí nghiệm 1 – Đánh giá ảnh hưởng của nhân tố giống đến chất lượng tinh dịch lợn:
- Giống Landrace có thể tích tinh dịch trong một lần khai thác (V-ml) lớn nhất (300.56±42.18), thứ hai là giống Piétrain (275±30.66), thấp nhất là giống PiDu (203.02±5.9) (P<0.05).
- Giống Piétrain và PiDu có nồng độ tinh trùng (triệu tinh trùng/ml) tương đương (lần lượt là 263.33±10.17 và 263.064.52), giống Landrace có nồng độ thấp hơn (220.00±5.06) (P<0.05).
- Giống Landrace có hoạt lực tinh trùng (A-%) (68.50±1.10), thấp hơn hai giống Piétrain và PiDu (lần lượt là 76.56±1.00 và 77.28±0.56) (P<0.05).
- Giá trị V.A.C tổng hợp (tỉ tinh trùng/lần) giữa các giống có sai khác rất rõ rệt, giống Piétrain lớn nhất (55.37±6.50), thứ hai là giống Landrace (45.33±6.35), thấp nhất la giống PiDu (41.29±1.60) (P<0.05).
- Độ pH tinh dịch giữa hai giống Piétrain và PiDu không có sự sai khác (7.31±0.05 và 7.28±0.03), cao hơn giống Landrace (7.11±0.03) (P<0.05).
- Chỉ tiêu sức kháng khác nhau rõ rệt giữa các giống Piétrain (3897.22±59.08), Landrace (3402.78±41.39) và PiDu (3515.83±51.46) (P<0.05).
- Chỉ tiêu kì hình tổng số giữa các giống có sự khác nhau rõ rệt, giống PiDu có giá trị lớn nhất (8.11±0.27), thứ hai là giống Landrace (7.33±0.57), thấp nhất là giống Piétrain (5.36±0.13) (P<0.05).
Thí nghiệm 2 – Kiểm tra kiểu gen Halothan của các đực giống thí nghiệm:
- Đã tách chiết thành công DNA từ các mẫu thể hiện qua kết quả chạy điện di và đo OD kiểm tra độ tinh sạch.
- Đã chạy PCR nhân trình tự đặc hiệu của gene Halothane, do ảnh hưởng của một số nhân tố chưa biết do đó chỉ hoàn thành phản ứng nhân ở một số mẫu, chưa tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn để kiểm tra kiểu gene.
5.2. Đề nghị
- Cần phải có thí nghiệm tiếp theo để xác định nguyên nhân và thực hiện thành công quy trình xác định kiểu gene Halothane của lợn từ mẫu gốc lông. Từ đó, xác định ảnh hưởng của kiểu gene Halothane đến chất lượng tinh dịch lợn đực giống.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2013). Báo cáo kế hoạch thực hiện kế hoạch 5 tháng năm 2013 ngành nông nghiệp và phát triển nông thôn, Tr.1.
2. Đỗ Đức Lực, Nguyễn Chí Thành, Vũ Đình Tôn, Bùi Văn Định, F.Farnir, P.Leroy và Đặng Vũ Bình (2011). Ảnh hưởng của allene Halothane đến khả năng sinh trưởng của lợn và sự xuất hiện tần số kiểu gene đời sau.
3. Đinh Văn Chỉnh và cs (1999). Xác định tần số kiểu gene và tính năng sản xuất của lơn Landrace và Yorkshire có các kiểu gene khác nhau nuôi ở một số cơ sở giống miền Bắc. Báo cáo khoa học – Nhà xuất bản Nông Nghiệp.
4. Hà Xuân Bộ, Đỗ Đức Lực và cs (2013). Khả năng sinh trưởng và phẩm chất tinh dịch lợn đực Piétrain kháng stress nuôi tại trung tâm giống lợn chất lượng cao – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
5. Hà Xuân Bộ, Đỗ Đức Lực, Đặng Vũ Bình (2011). Đánh giá phẩm chất tinh dịch lợn Piétrain kháng stress nhập từ Bỉ nuôi tại Xí nghiệp Chăn nuôi Đồng Hiệp – Hải Phòng, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp.
6. Lê Xuân Cương (1985). Truyền tinh nhân tạo góp phần tăng nhanh tiến bộ di truyền các giống lợn, Thông tin Kinh tế Kĩ thuật Hà Nội, Tr. 1 – 23.
7. Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt (1996). Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm, NXB Nông nghiệp.
8. Nguyễn Tấn Anh (dịch 2001). Ảnh hưởng của thụ tinh nhân tạo đến chăn nuôi lợn, Tạp chí Khoa học Kỹ Thuật Nông nghiệp.
9. Nguyễn Tấn Anh (2002). Thụ tinh nhân tạo cho gia súc, gia cầm, NXB Lao động, Hà Nội.
10. Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993). Thụ tinh nhân tạo cho lợn ở Việt Nam,
NXB Nông nghiệp, Tr. 93, 102 – 103.
11. Nguyễn Văn Thắng, Vũ Đình Tôn (2010). Năng suất sinh sản, sinh trưởng, thân thịt và chất lượng thịt của các tổ hợp lai giữa lợn nái F1 (Landrace x Yorkshire) với đực giống Landrace, Duroc và Pietrain x Duroc. Tạp chí khoa học và phát triển, trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.
12. Phan Vũ Hải (2006). Giáo trình Sinh sản gia súc, ĐH Nông-Lâm Huế.
13. Trần Tiến Dũng và cs (2002). Giáo trình sinh sản gia súc, NXB Nông nghiệp.
Tài liệu tiếng Anh
15. Audet, I., J.P. Laforest, G.P. Martineau and J.J. Matte. (2004). Effect of vitamin supplements on some aspects of performance, vitamin status, and semen quality in boars. J. Anim. Sci. 82: 626–633.
16. K.F Weitze. (1990), Long- term storage of extended boar semen, Reprod Dom Anim Suppl 1, 231-253.
17. Herrick. J. B. and H. L. Self. (1962). Evaluation of Fertility in the Bull and the Boar. Iowa State University Press, Ames, Iowa.
18. Maria kavecka và cs. (2008). Quality of semen of young boars of the breeds Pietrain and Duroc and their reciprocal crosses, Arch. Tierz., Dummerstorf 51 42- 54.
19. Gregor G., Hardge. T. (1995). Zum Einfluss von Ryanodin - Rezeptor - Genvarianten auf Spermaqualitatsmerkmale bei KB - Ebern, Arch. Tierz., 38 (5): 527 – 538
20. Smital J. (2009). Effects influencing boar semen. Animal Reproduction Science, 110: 335-346 and Wolf J. and J. Smital. (2009). Quantification of factors affecting semen traits in artificial insemination boar from animal model analyses. J. Anim. Sci. 87: 1620 -1627.
21. Wierzbicki H., Gorska I., Macierzynska A. & Kmiec M. (2010). Variability of semen traits of boars used in artificial insemination. Medycyna Weterynaryjna, 66: 765-769.
22. Kemp, B., denHartog, L.A. and Grooten, H.J.G. (1989). The effect of feeding level on semen quantity and quality of breeding boars. Anim. Reprod. Sci. 20:245- 254.
23. Kennedy, B.W. and Wilkins, J.N. (1984). Boar, breed and environment factors 24. Leman AD and Rodeffer HE: Boar managene. Vet Rec. (1976) jun 5 ,98 (23): 457-
9.
25. Otsu K., M. S. Phillips, V. K. Khanna, S.Leon, and D. H. MacLennan. (1992). Refinement of diagnostic assays for a probable causal mutation of porcine and human malignant hyperthermia. Genomics, 13: 835.
26. Fujii, J., K. Otsu, F. Zorzato, S. de Leon, V. K. Khanna, J. E. Weiler, P. J. O’Brien, and D. H. MacLennan. (1991). Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia.
27. Barton – Gade. (1984). Sermina on meat quality, Bristol.
28. Luescher, U., A. Schneider, H. Jucker. (1979). Genetics of halothane-sensitivity and change of performance, carcass and meat quality traits induced by selection against halothane sen-sitivity. In: Proc. 30th Annual Meeting of the EAAP, Harrogate, England.
29. Pfeiffer H., Lengerken G.v., Schwalbe M., Horn P., Kovach G. (1986). Relationships between the stress susceptibility and the fertility of pigs. 3T&dquo; Annual Meeting of the E.A.A.P.,Budapest, Summaries, vol. 1, GP 3.20, 140-141 (Abstr.).
30. Wileke và cs. (1986). A note on the effect of the halothane-type of sows on lifetime prolyfiacy and little parity at culling . Livest . Prod. Sci.,14, 205-210
31. Rundgen M, Lundstrom K., and Edfors-Lilja I. (1990). A within – little comparison of the three halothane genotype. 2. Performance, carcass quality organ development and long – term effects of transportation and amperozide. Liverstock Production Science 26: 231-243.
32. Mitchell, G. and Heffron, J. J. A. (1982). Porcine stress syndromes. Advances in Food Research, 28, 167-230.
33. N. Stanisic, S.Aleksic, L. Di và cs. (2012). Porcine stress syndrome (pss) in mangalitsa pigs.
34. Reginaldo Gaspar Bastos và cs. (2000). Characterization of swine stress gene by DNA testing using plucked hair as a source of DNA.
35. Bauerová, M., Vasicek, D., Uhrin, P., Chrenek, P., Mlynek, J. andBulla, J. (1996). Detection of malignant hyperthermia in pigs by DNA-test using plucked hair as a source of DNA.Pig News Inf. 16: 109N-111N.
In:Advances in Forensic Haemogenetics (Carracedo, A., ed.). Springer-Verlag, New York, pp. 269-271.
37. E. Nakajima, T. Matsumoto, R.Yamada, K. Kawakami, K. Kateda, A. Ohnishi và M. Komatsu. (1996). Techical note: use of a PCR-single straind conformation polymorphism (PCR-SSCP) for detection of a point mutation in the swine ryanodine receptor (RYR1) gene.
38. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. (1989). Analysis of genomic DNA by Southern hybridization. In: Molecular Clon-ing. 9.31. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
39. Higuchi, R. (1989). Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: PCR Technology. p 31. Stockton Press, New York.
40. Puwaravutipanich, T., and S. Panyim. (1975). The nuclear basic proteins of human testes and ejaculated spermatozoa. Exp. Cell Res. 90:153.
41. Ellis and Bertol. (2000). The effect of the Halothane and Rendement Napole genes on carcass and meat quality traits of pigs. Journal of Animal Science, 78, 2862- 2867.
Tài liệu tiếng Nga
42. Milovanov: Милованов В. К. Сравниение трех способов охраниения глубокозамороженново семени быка. – Сельское хозяйство за бежом, № 7, c. 15…20, 1972.
PHỤ LỤC