Phương pháp này được sử dụng khi gene Halothane đã được nhân lên (nhận biết bằng điện di với Ladder 100bp sau khi chụp với tia UV). Quy trình gồm các bước sau:
- Chuẩn bị các thành phần trước khi ủ + DNA sau khi PCR: 5µl
+ Buffer: 2 µl
+ Acetyl BSA: 0.2 µl + Nước khử ions: 12.3 µl
Dùng pipette trộn đều hỗn hợp, sau đó thêm 0.2 µl Enzyme cắt giới hạn HhaI - Dùng pipette trộn đều, spin nhẹ
- Ủ ở 370C từ 1 – 4 h, sau đó kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên Agarose 2% Đây là bước tiếp theo sau khi đã nhân gene Halothane với cặp mồi và chu trình nhiệt như trên. Trong bước này, sử dụng enzyme giới hạn HhaI để nhận biết và cắt đoạn DNA bình thường không chứa điểm đột biến tại vị trí nucleotit 1843thành 2 đoạn có chiều dài 524 bp và 135 bp. Như vậy, trong trường hợp lợn có kiểu gene đồng hợp tử trội NN, enzyme HhaI sẽ nhận biết được và cắt cả hai mạch DNA. Khi đó sẽ cho 2 đoạn DNA có chiều dài là 524 bpvà 135 bp. Ở lợn có kiểu gene đồng hợp tử lặn nn, tức là cả hai mạch DNA đều chứa điểm đột biến của gene Halothane, enzyme HhaI sẽ không nhận biết được điểm cắt (đã thay nucleotit C bằng T), do vậy enzyme này sẽ không cắt DNA và trong trường hợp này sẽ chỉ có đoạn DNA gồm
659 bp. Kiểu gen dị hợp tử Nn sẽ có một mạch DNA (chứa allene N) bị cắt và tạo thành đoạn 524 bp và 135 bp, còn mạch DNA khác (chứa allene n) sẽ không bị cắt và vẫn giữ nguyên chiều dài 659 bp. Trong trường hợp này, sản phẩm thu được là các đoạn DNA có chiều dài 659, 524 và 135 bp. Để nhận biết được chiều dài các đoạn cắt thì phải tiến hành điện di.
5’ - GCG C - 3’ 3’ - C GCG - 5’
Hình 3.5. Vị trí cắt của enzyme HhaI 3.3.11 Phương pháp điện di
Phương pháp này nhằm kiểm tra, xác định sự nhân lên của gene Halothane sau khi PCR và gene Halothane tồn tại ở trạng thái đồng hợp (trội/lặn) hay dị hợp sau khi được cắt với enzyme cắt giới hạn HhaI.
Ở phương pháp này, sử dụng Agarose 2%. Quy trình được thực hiện qua các bước sau:
- Pha đệm TAE 1X (TAE: Tris HCl-Acid Acetic-ETDA)
- Cân Agarose (2%) và đổ vào đệm TAE, sau đó đun nóng hỗn hợp bằng lò vi sóng sao cho hỗn hợp đồng nhất thành dd trong suốt, không màu
- Thêm thuốc nhuộm Ethydium Bromide (thường dùng với tỉ lệ 1 µl cho 100ml Agarose 2%).
- Đổ ra khay (chờ cho dd còn khoảng 400C rồi đổ). Sau đó chờ 15-20’ cho cứng rồi cho vào bể điện di.
- Sử dụng đệm TAE 1% cho điện đi, tra mẫu vào giếng và điện di (thường sử dụng 5-10 µl).
- Sau đó chụp ảnh và đọc kết quả.
Do DNA có một lượng phosphate tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện, DNA sẽ di chuyển ngược chiều điện trường. Các đoạn cắt DNA tách khỏi nhau tương ứng với kích thước của chúng và di chuyển với tốc độ khác nhau. Các đoạn DNA có kích thước lớn sẽ chạy chậm hơn so với các đoạn DNA có kích thước nhỏ, các đoạn DNA có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn về phía ngược chiều điện trường. Nhờ tác dụng của thuốc nhuộm Ethidium bromide, DNA phát quang dưới ánh đèn tử ngoại, do vậy sẽ quan sát được các vạch cắt DNA khác nhau (các đoạn
DNA có chiều dài khác nhau). Căn cứ vào thang chuẩn (Ladder) sẽ biết được các vạch sáng này chứa đoạn DNA dài bao nhiêu cặp bazơ. Kiểu gene Halothane được xác định bằng số vạch sáng trên mỗi dải của bản gel.
+ Kiểu gene Halothane NN: 2 băng 524 và 135 bp + Kiểu gene Halothane Nn: 3 băng 659, 524 và 135 bp + Kiểu gene Halothane nn: 1 băng 659 bp.
PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh nguyên gồm: thể tích tinh dịch trong một lần khai thác (V - ml), giá trị pH tinh dịch, nồng độ tinh trùng (C - triệu tinh trùng / ml), hoạt lực tinh trùng (A - %), sức kháng tinh trùng (R), tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %) và chỉ tiêu tổng hợp V.A.C. Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng tinh nguyên ở trên được so sánh với các chỉ tiêu kỹ thuật về tinh dịch theo tiêu chuẩn trên thế giới và ở Việt Nam.
Các mẫu tinh dịch trong nghiên cứu được tiến hành khai thác, chọn lọc ngẫu nhiên tại trại lợn thuộc Trạm truyền giống gia súc – Trung tâm giống vật nuôi Thái Nguyên, xã Hóa Thượng, huyện Đồng Hỷ, tỉnh Thái Nguyên. Các kết quả chỉ tiêu kiểm tra chất lượng tinh dịch của các cá thể thuộc các giống nghiên cứu được trình bày trong bảng 4.1.
Kết quả cho thấy các chỉ tiêu tinh dịch, tinh trùng của các mẫu tinh dịch nghiên cứu đạt yêu cầu kỹ thuật theo tiêu chuẩn Việt Nam và trên thế giới. Lần lượt từng chỉ tiêu sẽ được đánh giá và phân tích chi tiết trong các phần sau.
Bảng 4.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu tinh nguyên của các giống lợn nghiên cứu Giống Piétrain (n=6) Landrace (n=6) PD (n=6)
V (ml) 275±30.66 300.56±42.18 203.02±5.9 C (triệu/ml) 263.33±10.17 220.00±5.06 263.06±4.52 A (%) 76.56±1.00 68.50±1.10 77.28±0.56 V.A.C (tỉ/lần) 55.37±6.50 45.33±6.35 41.29±1.60 pH 7.31±0.05 7.11±0.03 7.28±0.03 R 3897.22±59.08 3402.78±41.39 3515.83±51.46 K (%) 5.36±0.13 7.33±0.57 8.11±0.27
4.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chất lượng tinh dịch
4.1.1 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu pH tinh nguyên
pH của tinh dịch ảnh hưởng tới sức sống và khả năng thụ thai của tinh trùng bởi vì pH có mối liên quan chặt chẽ với quá trình trao đổi chất của tinh trùng thông qua hệ thống enzyme của chúng. Ảnh hưởng của 3 giống khác nhau đến pH tinh nguyên của lợn đực giống được thể hiện trong bảng 4.1. và hình 4.1.
Bảng 4.2. Giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn nghiên cứu
Giống Pi Landrace PD
GTTB ± SD GTTB ± SD GTTB ± SD
pH 7.31±0.05a 7.11±0.03b 7.28±0.03a
(Trên cùng một hàng, các giá trị có chữ cái phía trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn
(Trong cùng một biểu đồ, các giá trị có chữ cái bên trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Theo kết quả tổng hợp ở bảng 4.1 và hình 4.1 cho thấy, giá trị trung bình pH tinh nguyên của 3 giống lợn Piétrain, Landrace và PiDu lần lượt là: 7.31±0.05, 7.11±0.03, 7.28±0.03. Kết quả nghiên cứu của Hà Xuân Bộ, Đỗ Đức Lực và Đặng Vũ Bình, 2011 [5] về chỉ tiêu này trên giống Piétrain là 7,27±0,23. Như vậy, kết quả của nghiên cứu này thấp hơn các kết quả của các tác giả trên. Hai giống Piétrain và PiDu có giá trị pH cao hơn so với giống Landrace, và sự khác nhau này có ý nghĩa (P<0.05). Điều này cho thấy yếu tố giống ảnh hưởng tới pH tinh nguyên.
4.1.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu thể tích tinh dịch
Thể tích tinh dịch là một trong số các chỉ tiêu đánh giá khả năng sản xuất tinh của lợn đực giống và là chỉ tiêu tương đối dễ đánh giá. Chỉ tiêu này khác nhau tùy thuộc giống lợn, độ tuổi, tần suất, điều kiện ngoại cảnh trong đó quan trọng nhất là nhiệt độ và độ ẩm, kỹ thuật khai thác của kỹ thuật viên cũng ảnh hưởng lớn đến lượng tinh trong mỗi lần khai thác của đực giống. Trong thực tế sản xuất, đực giống thường bị khai thác với tần suất cao, nhất là đối với những lợn đực giống có phẩm chất giống tốt, ra con đẹp (hai ngày một lần) trong khi tần suất hợp lý được khuyến cáo là 2 lần/tuần hoặc 3 lần/2 tuần dẫn đến sản lượng và chất lượng tinh bị sụt giảm. Ảnh hưởng của 3 giống lợn khác nhau đến thể tích tinh dịch trong một lần khai thác của lợn đực giống được thể hiện trong bảng 4.2. và hình 4.2.
Bảng 4.3. Giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống nghiên cứu
Đơn vị tính: ml
Giống Pi Landrace PD
GTTB ± SD GTTB ± SD GTTB ± SD
V (ml) 275±30.66a 300.56±42.18a 203.02±5.9b
(Trên cùng một hàng, các giá trị có chữ cái phía trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình thể tích tinh dịch của 3 giống
(Trong cùng một biểu đồ, các giá trị có chữ cái bên trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Trong thí nghiệm này, giống Piétrain có chỉ tiêu thể tích tinh dịch đạt: 275±30.66 ml, thấp nhất là giống PiDu: 203.02±5.9 ml, cao nhất là giống Landrace: 300.56±42.18 ml. Giống PiDu có thể tích thấp nhất là do các đực giống mới đưa vào khai thác, vẫn chưa ổn định nên thể tích thấp hơn. Ngược lại, 2 giống Pi, Landrace đã ổn định dần trong quá trình khai thác nên thể tích cao hơn.
Theo nghiên cứu của Maria Kawecka và cs, 2008 [18] (Piétrain là 145 ± 5,99 ml, PiDu: 203 ± 5,99 ml), của Nguyễn Văn Thắng và Vũ Đình Tôn, 2010 [11] (Landrace: 204 ± 5,04 ml) và đối chiếu với tiêu chuẩn tinh dịch lợn của Việt Nam TCVN 2839-79 (tinh dịch lợn đực ngoại có thể tích thấp nhất trong một lần xuất tinh là >200 ml) thì thấy kết quả nghiên cứa trên cao hơn, và chỉ tiêu thể tích tinh nguyên sau lọc (V – ml) của đàn đực giống nghiên cứu thỏa mãn yêu cầu kỹ thuật trong thụ tinh nhân tạo lợn theo TCVN 2839-79.
Như vậy, yếu tố giống ảnh hưởng tới giá trị thể tích tinh dịch trong 1 lần khai thác (giống Piétrain = giống Landrace và khác so với giống PiDu), và sự khác nhau này là có ý nghĩa (P<0.05).
4.1.3 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng
Hoạt lực tinh trùng là tỷ lệ phần trăm tinh trùng tiến thẳng trong mỗi mẫu tinh dịch. Chỉ tiêu này được ước lượng bằng mắt thường hoặc được xác định bằng phần mềm của hệ thống SPERM-VISION. Chỉ tiêu này phải đạt trên 70% đối với tinh được pha loãng để bảo quản dài ngày ở dạng lỏng hoặc trên 80% đối với tinh sử dụng cho quy trình bảo quản đông lạnh theo tiêu chuẩn Việt Nam (Trần Tiến Dũng và cs, 2002 [13]). Ảnh hưởng của 3 giống khác nhau đến hoạt lực tinh trùng của lợn đực giống được thể hiện trong bảng 4.3 và hình 4.3.
Bảng 4.4. Giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống nghiên cứu
Đơn vị tính: %
Giống Pi Landrace PD
GTTB ± SD GTTB ± SD GTTB ± SD
A (%) 76.56±1a 68.5±1.10b 77.28±0.56a
(Trên cùng một hàng, các giá trị có chữ cái phía trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình hoạt lực tinh trùng của 3 giống
(Trong cùng một biểu đồ, các giá trị có chữ cái bên trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hoạt lực của tinh trùng trong kết quả nghiên cứu đối với các giống Piétrain, Landrace và PiDu lần lượt là 76.56±1, 68.5±1.10, 77.28±0.56. Kết quả nghiên cứu này hơn kết quả nghiên cứu tương ứng của Maria Kawecka, 2008 [18] ở các giống tương ứng là giống Piétrain đạt 71.9 ± 0.60 %, ở giống PiDu là 72.5 ± 0.60 % và kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thắng và Vũ Đình Tôn, 2010 [11] hoạt lực của lợn đực giống Landrace là 75.5±0.5%). Theo Nguyễn Tấn Anh, 1984 [7] trong thụ tinh nhân tạo lợn, một số giống lợn ngoại nuôi ở nước ta có hoạt lực tinh trùng trung bình là 70 %.
Qua nghiên cứu trên, thấy lợn giống loại PiDu và Piétrain có hoạt lực tinh trùng gần như nhau (lần lượt là 76.56±1.00 và 77.28±0.56 ), giống lợn Landrace có hoạt lực tinh trùng thấp nhất (68.5±1.10). Sở dĩ có sự khác nhau này là do yếu tố giống ảnh hưởng tới chất lượng tinh dịch, cả 3 giống lợn này đều là giống nhập nội, chất lượng tinh dịch đã được nghiên cứu qua nhiều đề tài và đã chứng minh rằng giống Landrace có hoạt lực tinh trùng thấp hơn so với 2 giống Piétrain và PiDu.
Như vậy, yếu tố giống ảnh hưởng tới giá trị hoạt lực tinh trùng, các giống khác nhau có giá trị khác nhau, sự khác nhau này là có ý nghĩa (P<0.05).
4.1.4 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu nồng độ tinh nguyên
Nồng độ tinh nguyên được xác định bằng số tinh trùng đếm được trong 1ml tinh dịch. Đây là chỉ tiêu rất có ý nghĩa trong thực tế sản xuất vì nó kết hợp với chỉ tiêu hoạt lực tinh trùng để xác định số liều tinh sản xuất. Nếu nồng độ tinh nguyên cao thì sẽ pha được số liều tinh nhiều hơn. Nồng độ tinh nguyên phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố trong đó có yếu tố dinh dưỡng do nó có ảnh hưởng đến quá trình phát triển và sự cân bằng các hormone tham gia quá trình tạo tinh trùng. Ảnh hưởng của việc sử dụng 3 giống khác nhau đến nồng độ tinh nguyên của lợn đực giống được thể hiện trong bảng 4.4 và hình 4.4.
Bảng 4.5. Giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu
Đơn vị tính: triệu/ml
Giống Pi Landrace PD
GTTB ± SD GTTB ± SD GTTB ± SD
C (triệu/ml) 263.33±10.17a 220.00±5.06b 263.06±4.52a
(Trên cùng một hàng, các giá trị có chữ cái phía trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hình 4.4. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên của 3 giống
(Trong cùng một biểu đồ, các giá trị có chữ cái bên trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Kết quả trung bình về nồng độ tinh trùng đối với 3 giống Piétrain, Ladrace, PiDu là 263.33±10.17, 220.00±5.06, 263.06±4.52 (triệu/ml) lớn hơn kết quả nghiên cứu của Maria Kawecka, 2008 [18] (2 giống Piétrain và PiDu lần lượt là 194.1 ± 7.53, 149.1 ± 7.53 triệu/ml), và nhỏ hơn kết quả nghiên cứu Nguyễn Văn Thắng và Vũ Đình Tôn, 2010 [11] (của giống lợn Landrace là 240.69±26.92 triệu/ml). Theo TCVN 2839-79, nồng độ tinh trùng đối với các giống lợn ngoại >80 (triệu/ml). Như vậy, các lợn đực giống trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn để pha loãng tinh dịch.
Qua thí nghiệm trên cho biết 2 giống lợn Piétrain và PiDu có giá trị trung bình nồng độ tinh nguyên gần như nhau, lần lượt là: 194.1 ± 7.53 và 149.1 ± 7.53 triệu/ml. Giống Landrace là 220.00±5.06, thấp hơn nhiều so với 2 giống trên, do đó chất lượng tinh dịch của 2 giống tốt hơn giống Landrace.
Như vậy, yếu tố giống ảnh hưởng tới giá trị nồng độ tinh trùng, các giống khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa (P<0.05).
4.1.5 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến chỉ tiêu kỳ hình tổng số tinh nguyên
Tinh trùng kỳ hình là tinh trùng có hình thái học không bình thường ở Acrosome, đầu, cổ thân, đuôi. Đây là một trong các chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng tinh dịch và thể trạng của lợn đực giống. Nếu tỷ lệ tinh trùng kỳ hình quá nhiều thì tinh dịch sẽ bị loại bỏ. Nếu trong các lần xuất tinh khi kiểm tra, lợn đực giống cho tinh dịch có quá nhiều kỳ hình (K > 15%) thì đực giống đó thường sẽ bị loại thải. Ảnh hưởng của 3 giống nghiên cứu đến chỉ tiêu kỳ hình tổng số tinh nguyên của lợn đực giống được thể hiện trong bảng 4.1.5 và hình 4.1.5.
Bảng 4.6. Giá trị trung bình kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống nghiên cứu
Đơn vị tính: %
Giống Pi Landrace PD
GTTB ± SD GTTB ± SD GTTB ± SD
K (%) 5.36±0.13a 7.33±0.57b 8.11±0.27c
(Trên cùng một hàng, các giá trị có chữ cái phía trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Hình 4.5. Biểu đồ thể hiện giá trị trung bình tỉ lệ kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống
(Trong cùng một biểu đồ, các giá trị có chữ cái bên trên khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê (P < 0.05))
Qua bảng 4.5 ta thấy rằng, giá trị trung bình kì hình tổng số tinh nguyên của 3 giống thí nghiệm lần lượt là: 5.36±0.13, 7.33±0.57 và 8.11±0.27. Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Thắng, Vũ Đình Tôn, 2010 [11] cho biết giá trị kì hình của giống lợn Landrace là 5.5±0.05, của Nguyễn Thị Hằng, 2012 giá trị kì hình nghiên cứu được trên hai giống Piétrain và PiDu lần lượt là: 5,36 ± 1,04 và 3,35 ± 0,40. Trong nghiên cứu này, giá trị kì hình tổng số cao hơn các nghiên cứu trước đó. Tuy nhiên,