Flavonoid và dược liệu chứa flavonoid

Tài liệu này dành cho sinh viên, giảng viên viên khối ngành y dược tham khảo và học tập để có những bài học bổ ích hơn, bổ trợ cho việc tìm kiếm tài liệu, giáo án, giáo trình, bài giảng các môn học khối ngành y dược

Sau khi học chương này, SV phải trình bày được

• Cấu trúc cơ bản của 3 nhóm Flavonoid

• Các tính chất căn bản của Flavonoid

• Nguyên tắc chiết xuất, định tính, định lượng Flavonoid

• Các tác dụng & công dụng của Flavonoid

• Các (10) dược liệu chứa Flavonoid chính

- hoa Hòe - Diếp cá - Núc nác

(C6 – C3 – C6) flavonoid (eu-F, iso-F, neo-F)

(C6 – C3 – C6)n tannin ngưng tụ

(C6 – C4) naphthoquinon

(C6 – C1)2 anthraquinon, stilben

• Về mặt hóa học

- 1664, R Boyle : hoa Viola tricolor  màu tím

(màu xanh / kiềm, tím / trung tính, đỏ / acid)

- 1814, Chevreul : gỗ Morus tinctoria  Morin

- 1835, L.C Marquart : hoa Centaurea cyanus

 anthocyanin (Δ’ 2-benzo pyrilium)

Sau đó, đã phân lập :

- phloridzin / Táo (1835), naringin / Bưởi (1857),

Sự liên quan về cấu tạo hóa học chưa được làm rõ,

các nghiên cứu chưa hệ thống  tên không thống nhất

anthoxanthin, anthoxanthidin, anthocyanin, anthochlor, chymochrome

Năm 1952 :

T.A Geissman :  Flavone (Δ’ 2-phenyl chromon)

→ những chất # Flavone này được gọi là Flavonoid

- do từ-nguyên (flavus = màu vàng)

FLAVONOID

• Về mặt dược lực học

- Derris elliptica thuốc cá, diệt côn trùng (rotenon) →

- 1928, S Györgyi và I Rusznyak  yếu tố P

 Citrin (hesperidin + eriodictyol) chống xuất huyết

- 1954, Bradbury & White  Formononetin và Genistein

- 1970, Kupchan  eupatin, eupatoretin,

centaureidin (kháng khối u)

O HO

O HO

O

O OH

O

A

B C

B

C

1 5

4

3 2

7

2

3 4 5

6

7

1

3 5

7

3 4

6

5 1

I EU-FLAVONOID

III NEO-FLAVONOID

O 4

2 3

4-phenyl chroman 4-phenyl coumarin

brazilein

(tô mộc)

O

O HO

- ít quan trọng, chủ yếu gặp / ngành Hạt trần.

- Cấu trúc : Flavonoid – Flavonoid (dimer)

- Đại đa số : Flavon(ol) – Flavon(ol)

(apigenin – apigenin)

- Thường : nối C-C (~120 chất), C-O-C (~20 chất)

C4’ - C6 : robusta-flavonC6 - C6 : cupressu-flavonC3' - C8 : amento-flavon

IV BI-FLAVONOID

O OH

MeO

OMe O

O OH

HO

OH

3' 8

ginkgetin /Ginkgo biloba

V CẤU TRÚC KHÁC

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH

OH OH

OH

O HO

OH OH OH

OH

OH OMe

CH 2 OH

O HO

O O OH

Flavo-Lignan

OH OH O

O OH

HO

3 rutinose

O

OH OMe O

O OH

7

6

4' 1'

O-glycosid

(rutin)

CÁC KIỂU GLYCOSID

sulfat glycosid(persicarin)

O

O OH

-D-glc -D-gal -L-rha

CÁC OSE THƯỜNG GẶP

1 6

O

CH 2 OH

O Genin

O Me

O

1

2

O Me

O

O O

Genin

Ð Ð

7

3’

4’

C1 theo khung của genin

- euflavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid

C2 theo loại mạch đường

- O-glycosid, C-glycosid, sulfat glycosid

C3 theo số mạch đường

- monodesmosid ( monosid, biosid, triosid)

- bidesmosid, tridesmosid

C4 theo cách tổ hợp phân tử

- monomer, dimer, trimer

C TÓM TẮT PHÂN LOẠI

OR

OR

- Flavon - Flavonol

- Flavanon - Flavanonol

- Chalcon - Dihydrochalcon (DHC)

- Auron - Anthocyanidin (AC)

- Catechin - Leuco-anthocyanidin (LAC)

1 PHÂN LOẠI EU-FLAVONOID

O

O

O OH

OH

1.1 Flavon

apigenin luteolin tricetin

OH HO

1.2 Flavonol

O OH

OH

OH OH

OH HO

O

O

OH OH HO

O

O

O OH

O HO

hesperidin

OH HO

O

O

HO

OH OH OH

O

OH

O OH

chalco-naringenin

1.5 Chalcon

butein

OH HO

OH O

OH

OH OH

OH

HO

O OH

1.6 Dihydrochalcon (DHC)

O OH

O OH

OH OH

OH

HO O

O OH

OH OH HO

O

O OH

OH HO

OH OH OH

O HO

OH OH OH

OH

O HO

OH OH OH

O HO

OH

OH OH OH

O HO

OH

OH OH

OH HO

2 SINH NGUYÊN FLAVONOID

acid shikimic (I)

COOH

OH OH

HO

COOH

OH OH

O P

CH 2

COOH

C COOH O

CH 2

O H

C OH

CH 2

O H

CH 3 C CH 2 C CH 2 C OH

O O

H H

H

H

H H H OH

CH 3

O O

O OH

OH

OH HO

3 đơn vị acetic

Ý NGHĨA VỀ MẶT CẤU TRÚC

- Chalcon là tiền chất của các Flavonoid khác

OH ở 2’, 4’, 6’ và 4 OH ở 4’, 5 và 7

3.1 Trạng thái

• Flavonoid được phân lập dưới dạng

- genin/glycosid : hầu hết flavon(ol), flavanon, chalcon

- chủ yếu genin : flavanonol, catechin, LAC, biflavonoid

- chủ yếu là glycosid : AC

• dạng glycosid thường khó kết tinh

• dạng genin thường kết tinh, điểm chảy cao

• biflavonoid thường bền, điểm chảy cao

3 LÝ TÍNH FLAVONOID

3.2 Màu sắc

- flavanon(ol), DHC : không màu

- catechin, LAC : không màu

- flavon, isoflavon : không màu  vàng nhạt

- flavonol : vàng nhạt  vàng

- chalcon, auron : vàng  đỏ cam

- anthocyanidin : vàng cam, đỏ, tím (tùy pH)

Trong cùng nhóm : càng ít OH  màu càng nhạt

3.3 Độ bền

- dạng genin :

flavon(ol) > flavanon(ol), chalcon, auron, DHC >

> AC, catechin, LAC (kém bền nhất)

- dạng glycosid :

C-glycosid > O-glycuronid > O-glycosid

- polymere > monomere

3.4 Độ tan

3.4.1 Độ tan của genin

- tan / dung môi phân cực vừa đến ph.cực mạnh

(EtOAc, Me2CO, MeOH, EtOH )

- kém tan / d.môi kém ph.cực (hexan, Bz, EP, Et2O )

- càng nhiều OH  càng khó tan / d.môi kém ph.cực

- càng nhiều OMe  càng dễ tan / d.môi kém ph.cực

3.4.2 Độ tan của glycosid

- tan trong MeOH, EtOH

- mạch đường dài / nhiều : có thể tan / nước nóng

- AC (ion, glycosid) : dễ tan / nước, cồn loãng

kém tan /cồn cao độ

- OH/C-7: tính acid  tan / NaOH, Na2CO3, NaHCO3

• Phổ UV : có 2 band

- band II (220-290 nm, chủ yếu do vòng A)

- band I (290-380 nm, chủ yếu do vòng B+C)

• Mỗi loại flavonoid có 1 dạng phổ UV với max riêng,

Nói chung, max tăng dần theo dãy

(isoflavon, flavanon)  (flavon, flavonol) (chalcon, auron)  (anthocyanin)

4 PHỔ UV

4 PHỔ UV

band II (nm) band I (nm) phân nhóm

5 PHỔ IR

- Thường dùng để định danh (so với phổ chuẩn)

- Ít có ứng dụng thực tế khác

- Chú ý các băng (cm-1) trong vùng

• 3300 – 3400 (OH linh động)

• 1450 – 1650 (vòng pyron)

• 1050 – 1150 (carbinol; C – O)

O

O OH

OH HO

OH

OH

HO

O O

OH

OH

Rutinose

Rutin

3400

O

O OH

OH HO

3300

O OH

OH HO

O H

3 5

7

4'

6.1 Của các nhóm -OH

Có tính acid yếu (-OH/C-7 > 4' > 3' > 3, 5)

Tính acid giảm khi -OH ở gần chức carbonyl

6 HÓA TÍNH FLAVONOID

tính acid mạnh hơntính acid

mạnh hơn

6.1.1 Tạo glycosid với đường (hoặc Δ’ của đường)

- thường : glc, rha, gal, xyl là O-glyc ở 3,7, 4',5

- số mạch : 1, 2 mạch, ít khi > 3 mạch

- mỗi mạch gồm 1, 2, ít khi > 3 ose

- mạch thường thẳng, hiếm khi phân nhánh

- nếu có glc : sát genin (OH/C1 của ose  OH/genin)

- các biosid đáng chú ý: (R = L-rha, G = βD-glc)

rutinose R1  6G gentibiose G1  6G

6.1.2 Tạo muối

- với kiềm loãng :  phenolat kém bền ( màu)

- tạo sulfat-glycosid (-OH thành -OSO3K),

6.1.3 Tạo phức với ion kim loại

(Al+++, Fe+++, Mg++, Pb++, Zn++, Zr++)

Đặc biệt với (-OH/C-3; C-5) hoặc (o-diOH/B)

Các phức này có độ bền khác nhau / HCl

Căn cứ vào độ bền này  cấu trúc của flavonoid

Sự dịch chuyển band I / phổ UV của luteolin

O

OH

OH OH

O

O Al O

O Al

OH

O Al

Khi Flavonoid + thuốc thử tăng màu :

+ kiềm loãng (NaOH, Na2CO3, AcONa, EtONa)

+ muối kim loại (AlCl3, ZnCl2 )  chuyển dịch max

- bathochrom nếu  max - hyperchrom nếu  Abs

- hypsochrom nếu  max - hypochrom nếu  Abs

Căn cứ vào

- max và Abs của flavonoid trước và sau khi + th’.thử

- độ bền của sản phẩm màu / HCl

6.2 Hóa tính của vòng -pyron

6.2.1 Tính kiềm

- vòng -pyron : kiềm yếu, với acid  tạo muối kém bền

- flavon(ol) có thể tan một phần trong acid

- nhóm -OH / C-5, 7, 4' làm tăng tính kiềm của vòng C

- vòng pyrilium của anthocyanidin có tính kiềm mạnh

với acid  muối bền, tồn tại trong tự nhiên

Như vậy, flavonoid : lưỡng tính (vừa acid vừa kiềm)

HCl

6.2.2 Tính oxy hóa khử

a khi khử

vòng -pyron / -dihydropyron  vòng pyrilium

(tăng màu, quan trọng / định tính) Nếu có xúc tác, có thể khử  catechin hay LAC

b khi oxy hóa

flavon  flavonol

flavanon  flavanonol  flavon  flavonol

6.3 Hóa tính của các vòng thơm (A và B)

Phản ứng thế azoic : tạo màu, dùng / định tính

Tác nhân : p-nitroanilin, acid sulfanilic đã được diazo-hóa, Điều kiện : - môi trường kiềm yếu,

- các vị trí o- hay p-(/OH) còn trống

- không bị cản trở lập thể

O

OH HO

6.4.1 Kiềm phân eu-flavonoid

Flavonoid + kiềm đặc và nóng (NaOH 2M, KOH )

 các mảnh nhỏ và đơn giản

So sánh các mảnh nhỏ này với các chuẩn có sẵn,

O

OH OH OH

O H

OH

O H

HO

- Trong môi trường kiềm, các iso-F có H-5 sẽ bị mất 1

carbon C-2, tạo deoxybenzoin thế và formiat

- Tách deoxybenzoin bằng Et2O / HCl; so sánh (SKLM ) với các chuẩn (có nhóm R khác nhau),

 cấu trúc ban đầu của iso-F

6.4.3 Thủy phân Flavonoid

Sự thủy phân dễ hay khó tùy theo

- loại glycosid (C-glycosid / O-glycosid),

- loại đường (-ose / -uronic),

- kiểu mạch đường (biose nối 1-2 / 1-6),

- vị trí gắn đường (vị trí số 3 / 7 / 4' )

- khung genin (flavon glycosid > flavonol glycosid)

Nói chung, C-glycosid bền hơn O-glycosid

a Thủy phân bằng acid

Với HCl 2N / MeOH (1:1), cách thủy 1 giờ thì :

Nếu nhóm -OH của ose bị acyl-hóa hoặc bisulfat-hóa

thì glycosid của chúng cũng có thể không bị thủy phân

Có thể thủy phân flavonoid glycosid bằng nhiều cách:

b Thủy phân bằng kiềm loãng (KOH 0.5% / N2)

- Ít sử dụng đối với các flavonoid glycosid

- dùng để phân biệt 3-O- với 7-O- và glycosid

(3-O- bền hơn 7-O- và 4'-O-glycosid)

O

O

O O

O OH

ose

ose

ose 3

7

4'

- các biosid nối (1  2) bền hơn (1  6)

bị thủy phân sau 1-2 h

để cắt dùng enzym

c Thủy phân bằng enzym

Mỗi loại enzym sẽ thủy phân 1 vài glycosid nhất định

Các loại enzym này có bán sẵn trên thị trường

7.1 Dùng ROH + nước

- Thường : MeOH, EtOH (70-90%) nóng hoặc nguội

(thu được các glycosid + genin ph.cực + tạp ph.cực)

- Loại tạp kém phân cực bằng các d.môi kém ph.cực

- Kết tinh / tủa trong các dung môi thích hợp

- Thu được genin + tạp kém ph.cực (ch’ béo, chlorophyll)  loại tạp tiếp bằng các phương pháp thích hợp

7.2 Dùng d.môi ph.cực trung bình (Cf, DCM )

7.3 Dùng dãy dung môi

- Ngấm kiệt với (ROH + H2O),

- cô, loại tạp kém phân cực bằng cách lắc với EP

lớp nước chứa flavonoid + tạp phân cực (đường )

- Lắc lớp nước này với Et2O rồi với EtOAc,

lớp Et2O chủ yếu chứa genin,

lớp EA chủ yếu chứa glycosid + ít genin còn sót

lớp nước chủ yếu chứa ose,

- tiếp tục phân lập bằng các kỹ thuật khác (SKC…)

bột dược liệu

7.4 Dùng cồn acid

- Ngấm kiệt bằng ROH loãng chứa 0.1% - 1% acid

(HCl, AcOH, tartric, citric )

- Cô dịch chiết ở nhiệt độ thấp hoặc đông khô

- Loại tạp, rồi tinh chế bằng các ph.pháp thích hợp

- Áp dụng đối với các flavonoid kém bền

7.5 Dùng cồn kiềm

- Chiết dược liệu với (ROH + H2O) + NaOH

- Trung hòa dịch (= acid vô cơ loãng), cô dung môi,

- acid hóa, Flavonoid (glycosid & aglycon) sẽ tủa

- Tinh chế bằng (C* + ROH nóng) thu dịch cồn nóng

- Để nguội, để lạnh  Flavonoid sẽ kết tinh

- Kết tinh lại lần 2, nếu cần

- Thường áp dụng với các Citro-Flavonoid / chi Citrus

Nói chung, Flavonoid là các hợp chất phân cực, khó phlập.

Độ phân cực Flavonoid thì :

• kém hơn đường, tannin

• xấp xỉ saponosid, anthraglycosid

• mạnh hơn sapogenin > anthraquinon > phytosterol

> coumarin, tinh dầu, chất béo

Trong Flavonoid, độ phân cực giảm dần theo dãy:

• glycuronid glycosid > glycosid

• bidesmosid > monodesmosid; polymer > monomer

Để phân lập 1 hỗn hợp Flavonoid  các Flavonoid tinh khiết,có thể dùng các kỹ thuật :

• chiết phân bố (lỏng – lỏng)

• SKC phân bố đảo (Si-gel RP; Diaion HP-20)

• SKC phân bố thuận (Polyamid, Cellulose)

• SKC rây phân tử (Sephadex G, Sephadex LH-20)

Đáng chú ý là SKC với Diaion HP-20 và các Sephadex

• SKC Diaion HP-20 với (H2O – MeOH; MeOH %  dần)

- Flavonoid sẽ ra sau đường, tannin (là những chất phân cực hơn Flavonoid)

• SKC Sephadex G/LH-20 với (H2O – MeOH)

- thường thì Flavonoid sẽ ra sau tannin (thường, M của tannin > M của Flavonoid)

8.1.1 Với kiềm đặc-nóng

Phá vỡ cấu trúc ( phloroglucinol) dùng để xác định cấu trúc flavonoid

8 ĐỊNH TÍNH

O

OH OH OH

OH

8.1 Phản ứng với kiềm (KOH, NaOH)

8.1.2 Với kiềm loãng

Flavonoid tăng màu (tạo phenolat, Δ’ có Δ liên hợp)

isoflavonoid Φ màu / vàng nhạt  vàng nhạt/vàng sậm

flavon,

flavonol vàng nhạt / vàng  cam (oxy hóa  nâu)chalcon,

anthocyanin đỏ hay tím  xanh

trước khi + kiềm sau khi + kiềm

8.2 Phản ứng với acid

(chỉ thị màu)

flavon, flavonol

 vàng sậm, cam (huỳnh quang !)

chalcon  mất màu

(flavanon)

isoflavon isoflavanon  vàng

8.3 Phản ứng Cyanidin (Shinoda, Shibata, Pew)

a với Mg* / HCl đ.đặc

Flavon(ol), Flavanon(ol)Chalcon

b với Zn* / HCl đ.đặc

đỏ đậm / magenta

 AC, màu đỏ

Flavonoid bột Mg, ZnEtOH HCl đ.đặc+

Lắc sản phẩm của phản ứng Cyanidin với octanol

- dạng glycosid : dịch màu đỏ / lớp EtOH (dưới)

- dạng aglycon : dịch màu đỏ / lớp octanol (trên)

PHÂN BIỆT GENIN / GLYCOSID *

octanol

glycosid aglycon

8.4.1 Với d.dịch FeCl3 loãng

Flavonoid + FeCl3  phức xanh (nâu, lá, đen)

- để sơ bộ nhận định số lượng nhóm OH / phân tử

- càng nhiều OH (đ.biệt là o-di-OH): màu càng đậm

- các dẫn chất 3',4',5' tri-OH : tạo màu xanh đen

8.4 Phản ứng tạo phức màu với muối kim loại

O HO

OH OH

OH O

HO

OH

8.4.2 Với dd acetat chì : Tạo phức tủa có màu

- dd acetat chì kiềm :  tủa vàng nhạt đến sậm với hầu hết các flavonoid (và cả các polyphenol)

- dd acetat chì trung tính:  tủa vàng nhạt đến sậm với các flavonoid có ortho-di-OH phenol

Màu tủa thay đổi tùy số lượng và vị trí các nhóm thế

8.4.3 Với dung dịch AlCl3 / ROH

- Là thuốc thử tăng màu (shift reagent), dùng để khảo sát cấu trúc flavonoid bằng quang phổ UV

- dựa vào Δλmax,  số lượng & vị trí các nhóm -OH / khung

Chú ý : Thuốc thử này chỉ quan sát rõ dưới UV 365 nm

Dưới ánh sáng thường: không thấy rõ sự th.đổi

8.4.4 Với thuốc thử Martini-Bettòlo (SbCl5 / CCl4)

Flavonoid / Na2CO3 + th’.thử diazonium  đỏ cam / đỏ

8.5 Phản ứng với thuốc thử diazonium

(hay dùng p-nitroanilin đã được diazo-hóa)

các flavonoid (+) khi

- có H ortho hay para / -OH

- H này không bị cản trở lập thể

O

O OH

OH OH HO

8.6 Định tính bằng phương pháp sắc ký (SKG, SKLM)

Dịch cồn của flavonoid được sắc ký (1, 2 chiều)

- SKG (Whatman 3MM ) hay

- SKLM (Si-gel NP, RP-18, cellulose, polyamid)

Dung môi khai triển thông dụng (xem Wagner, 1996)

BAW = nBuOH - AcOH - H2O (4:1:5; )CAW = CHCl3 - AcOH - H2O (30:15:2)TBA = tBuOH - AcOH - H2O (3:1:1)