PHƯƠNG PHÁP PCR KHUYẾCH ĐẠI GEN THYAMIDINE KINASE PHÁT HIỆN KOI HERPESVIRUS TRÊN LOÀI CÁ CHÉP (CYPRINUS CARPIO) Ở VIỆT NAM

1.1. Đặt vấn đề1.2. Mục đích, nội dung của đề tài Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh Koi herpesvirus trên thế giới2.1.1. Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus2.1.2. Sự phân bố toàn cầu của KHV2.1.3. Đặc điểm Koi herpesvirus2.1.4. Vật chủ và bệnh lý2.1.5. Sự phát sinh phát triển của bệnh2.2. Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép Việt Nam.2.2.1. Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam2.2.2. Tình hình nghiên cứu và chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus ở Việt Nam2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng2.3.2. Mô bệnh học2.3.3. Phân lập virus2.3.4. Miễn dịch học2.3.5. Phương pháp PCRPhần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP3.1. Đối tượng nghiên cứu3.2. Hóa chất và thiết bị3.2.1. Hóa chất3.2.2. Thiết bị3.3. Thời gian và địa điểm thực tập3.4. Phương pháp nghiên cứu3.4.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm3.4.2. Phương pháp tách ADN tổng số3.4.3. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ ADN3.4.4. Phương pháp PCR khuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase (tk)3.4.5. Phương pháp nhân dòng và xác trình tự gen3.4.6. Phương pháp tin sinh học3.4.7. Phương pháp lây nhiễm thực nghiệmPhần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN4.1. Kết quả thu mẫu4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số4.3. Kết quả khuyếch đại gen đoạn tk phát hiện Koi herpesvirus trên cá4.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen tk4.4.1. Kết quả nhân dòng4.2.2. Kết quả giải trình tự và so sánh4.5. Kết quả lây nhiễm thực nghiệmPhần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ5.1. Kết luận 5.2. Kiến nghị

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: “PHƯƠNG PHÁP PCR KHUYẾCH ĐẠI GEN THYAMIDINE KINASE PHÁT HIỆN KOI HERPESVIRUS TRÊN LOÀI CÁ CHÉP (CYPRINUS CARPIO) Ở VIỆT NAM”. Sinh viên: Lê Văn Hoàng Khoa: Công nghệ sinh học Khóa: 2006-2010 Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Đức TS. Lê Văn Trường MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục đích, nội dung của đề tài Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh Koi herpesvirus trên thế giới 2.1.1. Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus 2.1.2. Sự phân bố toàn cầu của KHV 2.1.3. Đặc điểm Koi herpesvirus 2.1.4. Vật chủ và bệnh lý 2.1.5. Sự phát sinh phát triển của bệnh 2.2. Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép Việt Nam. 2.2.1. Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam 2.2.2. Tình hình nghiên cứu và chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus ở Việt Nam 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh Koi herpesvirus 2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng 2.3.2. Mô bệnh học 2.3.3. Phân lập virus 2.3.4. Miễn dịch học 2.3.5. Phương pháp PCR Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Đối tượng nghiên cứu 3.2. Hóa chất và thiết bị 3.2.1. Hóa chất 3.2.2. Thiết bị 3.3. Thời gian và địa điểm thực tập 3.4. Phương pháp nghiên cứu 3.4.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm 2 3.4.2. Phương pháp tách ADN tổng số 3.4.3. Phương pháp kiểm tra độ sạch và xác định nồng độ ADN 3.4.4. Phương pháp PCR khuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase (tk) 3.4.5. Phương pháp nhân dòng và xác trình tự gen 3.4.6. Phương pháp tin sinh học 3.4.7. Phương pháp lây nhiễm thực nghiệm Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu 4.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số 4.3. Kết quả khuyếch đại gen đoạn tk phát hiện Koi herpesvirus trên cá 4.4. Kết quả giải trình tự đoạn gen tk 4.4.1. Kết quả nhân dòng 4.2.2. Kết quả giải trình tự và so sánh 4.5. Kết quả lây nhiễm thực nghiệm Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận 5.2. Kiến nghị 3 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa ẩm, địa hình có nhiều ao, hồ, sông, suối, đầm lầy… Đây là điều kiện thuận lợi cho nước ta phát triển ngành nuôi trồng thủy sản nước ngọt. Và từ xa xưa đến ngày nay việc đánh bắt và nuôi trồng thủy sản nước ngọt đã và đang mang lại nguồn lợi lớn cho nhân dân ta. Trong các loại cá nước ngọt, cá chép với chất lượng thịt thơm ngon, thích ứng rộng với các điều kiện sống khác nhau đã được nuôi phổ biến ở các ao, hồ, thủy vực nước ngọt là nguồn cung cấp thực phẩm lớn cho nhân dân ta. Loài cá này cũng được sử dụng rộng rãi khắp thế giới như một loại thực phẩm quan trọng. Đối với Việt Nam và Trung Quốc, cá chép còn gắn liền tín ngưỡng văn hóa của nhân dân “cá chép hóa rồng”, “cá chép đưa Táo quân lên trầu trời”. Ngày nay ngành công nghiệp cá cảnh phát triển, cá Koi – một loại cá chép cảnh với nhiều màu sắc và hình dáng đẹp mắt đang được thị trường Mỹ và Châu Âu rất ưa chuộng. Việt Nam là một trong những nước xuất khẩu cá cảnh lớn, nhất là ở Thành phố Hồ Chí Minh. Mặc dù khủng hoảng kinh tế ảnh hưởng đển nhiều mặt hàng xuất khẩu nhưng đến những ngày đầu tháng 9-2009, lượng cá cảnh xuất khẩu ở TP.HCM vẫn đạt khoảng 4 triệu con (bằng cả năm 2008), kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 7 triệu USD (Phạm Lâm Chính Văn, 2009). Nhưng hiện nay có một mối nguy hiểm đối với cá chép và cá koi là bệnh koi herpesvirus mà koi herpesvirus (KHV) chính là tác nhân gây bệnh trong nhiều loài cá Chép (Cyprinus carpio sp) với tỉ lệ lây nhiễm và chết rất cao. Koi herpesvirus được phát hiện lần đầu tiên ở Israel năm 1998, sau đó bệnh lây lan ra khắp các quốc gia Châu Âu, Châu Á và Châu Mỹ qua việc buôn bán cá chép cảnh koi (Hedrick và cộng sự, 2000; Pokorova và cộng sự, 2005). Bệnh này được Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đưa vào danh mục 6 loại bệnh thủy sản phải công bố dịch (thông tư số 39/2009/TT-BNNPTNT). Hơn nữa, hiện nay việc xuất nhập khẩu cá cảnh cần phải kiểm dịch, nhất là đối với thị trường Mỹ và Châu Âu. Theo quyết định số 656/2006/EC ngày 20/9/2006 của Ủy ban Châu Âu “Về điều kiện sức khỏe và chứng nhận nhập khẩu cho các loài cá dùng làm cảnh”, bệnh Koi Herpes Virus Disease (KHV) thuộc Danh mục các bệnh phải kiểm dịch, đồng thời phải kiểm soát chặt chẽ các lô hàng nhập khẩu các loài cá trên, kể cả cá làm cảnh và các sản phẩm của chúng. Ở Việt Nam gần đây một số nhà khoa học đã quan tâm và nghiên cứu xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm bệnh KHV đã thu được một số kết quả khả quan. Tại hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009, Nguyễn Thị Thanh Lợi và các cộng sự Viện Công nghệ sinh học công bố kết quả nghiên cứu phát hiện koi herpesvirus trên loài cá chép bằng phương pháp PCR. (Nguyễn Thị Thanh Lợi và cộng sự, 2009) Để góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm bệnh KHV trên cá chép ở Việt Nam, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phương pháp PCR khuếch đại gen Thyamidine kinase phát hiện Koi herpesvirus trên loài cá chép (Cyprinus carpio) ở Việt Nam”. 1.2. Mục đích, nội dung của đề tài 1.2.1. Mục đích: - Đề tài nhằm góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm bệnh Koi herpesvirus trên loài cá chép (Cyprinus carpio) ở Việt Nam. 1.2.2. Nội dung: - Thu thập mẫu cá chép, cá koi ở các địa phương. - Tách chiết ADN của các mẫu cá koi, cá chép nuôi ở Việt Nam. - Phát hiện sự có mặt của Koi herpesvirus trong các mẫu cá thông qua việc khuyếch đại đoạn gen Thyamidine kinase đặc trưng của virus. - Giải trình tự đoạn gen khuyếch đại và so sánh với các gen đã đăng kí trên ngân hàng gen quốc tế. - Lây nhiễm thực nghiệm trên một số mẫu cá nhằm quan sát diễn biến của bệnh và kiểm định lại phương pháp chẩn đoán. 5 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu bệnh koi herpesvirus trên thế giới 2.1.1. Giới thiệu về bệnh Koi herpesvirus Koi herpesvirus (KHV) là một bệnh virus truyền nhiễm cao, gây ra tỉ lệ bệnh và chết có ý nghĩa trong cá chép thường (Cyprinus carpio) (Hedrick và cộng sự, 2000; OATA 2001). Những dịch cấp tính của bệnh mới này trong koi và chép thường có thể đã xảy ra sớm từ 1995-1996, nhưng đã được công nhận đầu tiên ở Đức năm 1997 (Bretzinger và cộng sự, 1999). Năm 2000, virus giống herpes này đã được phân lập đầu tiên ở Mỹ sau dịch bệnh trên cá chép koi và cá chép thường ở Isael và Mỹ; và được đặt tên là Koi herpesvirus (Hedrick và cộng sự, 2000). Cuộc hội thảo đầu tiên về bệnh gây ra tỉ lệ tử vong cao của cá chép và cá koi đã được trình bày tại hội thảo quốc tế lần thứ 9 của Hội liên hiệp Châu Âu về bệnh học cá năm 1999 (Ariav và cộng sự, 1999). Cá chép thường được nuôi như là một loại cá thực phẩm trong nhiều nước với sản lượng hàng năm đạt 1.5 triệu tấn. Chép koi là một dạng màu của cá chép thường, thu được bởi chọn tạo. Cá cảnh này có nguồn gốc từ Nhật Bản. Ngày nay, sự thương mại hóa được mở rộng, Koi đã được nuôi và buôn bán rộng rãi trên khắp thế giới. Sự lây lan nhanh chóng của KHV có quan hệ với sự thương mại cá toàn cầu và sự trình diễn cá koi mà không có sự kiểm tra sức khỏe trước hoặc những yêu cầu về chứng chỉ sức khỏe. Một trong những biện pháp ngăn ngừa chống lại sự lan truyền của nguồn bệnh là kiểm tra cá trước khi vận chuyển hoặc tại nông trại sản xuất. Những chương trình kiểm soát nên dựa vào những thủ tục chuẩn đoán đặc hiệu và nhạy cho sự phát hiện nguồn bệnh (D. Pokorova và cộng sự, 2005). 2.1.2. Sự phân bố toàn cầu của KHV Sau những báo cáo đầu tiên của bệnh KHV ở CHLB Đức (1997), Israel (1998); bệnh đã lây lan tới nhiều nước trên toàn thế giới thông qua sự thương mại chép koi khi mà sự hiểu biết và các phương pháp phát hiện nó chưa có. Theo kết quả bảng điều 6 tra Koi herpesvirus toàn cầu năm 2004 và 2009 của Hannen và cộng sự, KHV đã được phát hiện trong 30 nước: Áo (2003), Bỉ (1999), Canada, Trung quốc, Costa Rica, Cộng hòa Czech, Đan mạch (2002), Pháp (2003 trong cá nhập khẩu từ Isael), Đức (1997), Hong Kong, Indonesia (2002), Ireland, Israel (1998), Italya (2003), Nhật bản (2003), Luxembourg (2003), Malaysia, Hà lan (2001), New Zealand, Ba lan (2003), Singapore (trong cá nhập khẩu từ Malaisia), Slovenia, Nam phi (2001), Hàn quốc, Thụy điển, Thụy sĩ (2003), Đài loan (2002), Thái lan (2004 trong cá nhập khẩu từ Đức), Anh (2000), và Mỹ (1998). Virus có thể đã tồn tại trong rất nhiều quốc gia khác nhưng chưa được nhận ra hoặc chưa báo cáo. 2.1.3. Đặc điểm Koi herpesvirus • Hình thái Hình thái và kích thước là tương tự những virus thuộc họ Herpesviridae. Thể virion bao gồm một vỏ capsid bên trong với cấu trúc đối xứng 20 mặt đường kính khoảng 100-110 nm. Thể virion trưởng thành chứa đựng một vỏ bao lỏng lẻo bên ngoài làm cho đường kính virion toàn bộ khoảng 170-230 nm. Thành phần chính của vỏ bao ngoài là một lớp màng kép lipoprotein (hình 2). Hình 1. Sơ đồ sự lây lan toàn cầu của KHV : dương tính, : nghi ngờ, : âm tính hoặc chưa được phát hiện (Theo Haenen và cộng sự, 2009) 7 • Cấu trúc bộ gen KHV là một virus ADN sợi kép với kích thước genome được ước lượng có sự thay đổi từ ít nhất 150 kbp ( Gray và cộng sự, 2002) tới 277 kbp ( Ronen và cộng sự, 2003) tới 295 kbp ( Waltzel và cộng sự, 2005). Trong sự đóng góp khác, sự nghiên cứu đặc điểm genome tại phòng thí nghiệm Weymouth CEFAS đã nhận dạng một số gen và một vài trong những gen này chia sẽ sự tương đồng có ý nghĩa với những gen được tìm thấy trong chanel catfish virus (CCV) và những herpesvirus khác. Khoảng 80% nucleotide tương đồng được thiết lập giữa CyHV-1, CyHV-2 và KHV. Hiện nay trình tự genome KHV đã được giải trình tự toàn bộ (Aoki và cộng sự, 2007). 2.1.4. Phân loại: Koi herpesvirus là một virus thuộc họ Herpesviridae. Waltzel và cộng sự đã cung cấp bằng chứng để xếp loại KHV là một herpesvirus và được đặt tên là cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) sau danh pháp của hai loài virus cá chép khác: CyHV-1 (virus bệnh đậu cá chép) và CyHV-2 (virus hoại tử máu cá vàng). Ngoài ra, dựa vào tác động trên cơ thể vật chủ KHV còn được cho cái tên là virus hoại tử mang và viêm thận cá chép (CNGV). Capsid vỏ lipoprotein Hình 2. Cấu tạo của KHV trên kính hiển vi điện tử. (Theo Rosenkranz D. 2008) 8 2.1.5. Vật chủ và bệnh lý • Vật chủ: Sự nhiễm KHV xảy ra trong tự nhiên mới chỉ được ghi nhận trên cá chép thường (Cyprinus carpio carpio), chép koi (Cyprinus carpio koi) và các dạng lai của chúng. Tất cả nhóm tuổi của cá đều biểu hiện sự cảm nhiễm với bệnh KHV (Bretzinger và cộng sự, 1999; Sano và cộng sự, 2004). Cá chép thường được nuôi hỗn hợp cùng với các loại cá khác, nhưng không có dấu hiệu của bệnh hoặc chết quan sát thấy trong các loài cá khác. Các loại cá khác thuộc họ cá chép như cá vàng không bị nhiễm với KHV. Như vậy cá chép thường và cá koi là dễ bị nhiễm nhất đối với KHV. Bệnh lý: Những dấu hiệu bệnh lý của KHV thường không đặc trưng. Sự nhiễm KHV thường tạo ra những thương tổn mang dữ dội với sự biểu hiện là sự lốm đốm mang với những phần đỏ và trắng. Những phần trắng là vì sự hoại tử (chết) của mô mang. Hình 3: Dấu hiệu bệnh koi herpesvirus. A- Da có những phần bị mất màu. B- Mắt trũng C- Mang bị hoại tử (Theo Hedrick và cộng sự, 2005) 9 Những thương tổn mang gây bởi bệnh KHV là dấu hiệu phổ biến nhất trong Koi bị ảnh hưởng. Những dấu hiệu bên ngoài khác bao gồm rỉ máu mang, hõm mắt, những phần nhạt màu hoặc phồng rộp trên da. Trong một vài trường hợp, sự nhiễm kí sinh trùng và vi khuẩn tiếp theo làm bệnh trầm trọng hơn (Hedrick và cộng sự, 2000; OATA 2001; Goodwin 2003). Những dấu hiệu bên trong của KHV có thể thay đổi và không đặc trưng nhưng có thể bao gồm sự dính chặt vào xoang cơ thể hơn bình thường và sự biểu hiện vết lốm đốm của những cơ quan bên trong ( Hedrick và cộng sự, 2000; Goodwin 2003). Về hành vi, cá bị ảnh hưởng thường bơi gần bề mặt, bơi không định hướng và tần số hô hấp cao. Cá có thể bị tử vong rất nhanh trong quần thể bị nhiễm, cá bị chết bắt đầu trong vòng 24-48h sau những dấu hiệu bệnh lý đầu tiên. 2.1.6. Sự phát sinh phát triển của bệnh • Sự xâm nhập và vị trí của virus trong mô Những nghiên cứu trước đây vẫn chưa biết được virus xâm nhập vào cá thông qua mang hay qua ruột (Hedrick và cộng sự, 2000; Perelberg và cộng sự, 2003). Tuy nhiên những kết quả nghiên cứu của Costes và cộng sự năm 2009, dựa vào kỹ thuật mô tả phát quang sinh học (bioluminescence imaging) đã kết luận rằng con đường chính của virus KHV xâm nhập vào cá là da, thay vì là mang hay ruột. ADN virus đã được phát hiện trong thận và máu của cá nhiễm tại thời điểm rất sớm sau sự nhiễm, khoảng 3 -5 ngày. Phân tích PCR và lai ADN đã phát hiện ADN KHV trong mô mang, dạ dày-ruột và gan của cá được lây nhiễm trong phòng thí nghiệm. Ngược lại, không phát hiện thấy ADN virus trong mô não cá lây nhiễm thí nghiệm bởi lai ADN và PCR, điều này có thể gợi ý rằng ADN virus có số copy thấp trong mô não (Gray và cộng sự, 2002). • Con đường virus lây lan Sự lây lan của KHV bao gồm trực tiếp tiếp xúc với cá bệnh, dịch từ cá bệnh hay nước (Dishon và cộng sự, 2005). Sự tiết dịch nhớt mạnh là rất rõ ràng trong thời 10 [...]... mồi khuyếch đại đồng thời 3 đoạn gen trong cùng một phản ứng để phát hiện KHV trong các mẫu cá bệnh (Nguyễn Thị Thanh Lợi và cộng sự, 2009) 2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh koi herpesvirus Hiện nay trên thế giới đã có nhiều phương pháp phát hiện Koi herpesvirus Mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm riêng; tùy vào mục đích và điều kiện mà các phương pháp được lựa chọn để sử dụng Dưới đây là những phương. .. 5’-CACCCAGTAGATTATGC-3’ Cặp mồi này khuyếch đại một đoạn gen 409 bp Phương pháp PCR khuyếch đại gen tk đã không khuyếch đại nhưng ADN herpesvirus cá khác như Herpesvirus cyprini (CHV) và chanel catfish virus (CCV) Phương pháp PCR dựa vào sự khuyếch đại đoạn gen tk đã được so sánh với những phương pháp PCR miêu tả trước đó và với 16 sự nuôi cấy virus trong cá bệnh và đã cho thấy đây là phương pháp chẩn đoán nhạy nhất... 36 mẫu cá; bao bồm 18 mẫu cá chép, 18 mẫu cá chép trần và cá koi, trong đó có cả cá trưởng thành và cá giống Các mẫu cá chép được thu tại Viện thủy sản I Bắc Ninh trong đó có các mẫu cá khỏe mạnh bình thường và các mẫu cá được thu từ các ao có biểu hiện chết hàng loạt Các mẫu cá chép trần được thu từ một số cửa hàng bán cá cảnh Cá có biểu hiển mắt đục, bơi lờ đờ, tiết nhiều dịch là những biểu hiện. .. “Nghiên cứu phát triển phương pháp PCR với tổ hợp mồi chế tạo bộ KIT phát hiện sớm một số virus gây bệnh nguy hiểm ở cá biển, cá cảnh” vào danh mục các đề tài/dự án cấp bộ lĩnh vực thủy sản đưa vào thực hiện giai đoạn 2008-2010 do tiến sỹ Nguyễn Hoàng Uyên chủ trì Kết quả nghiên cứu của đề tài này đã phát hiện được KHV ở trên cá chép nuôi ở Việt Nam và xây dựng thành công phương pháp seminested PCR với... cầu 3.4.4 Phương pháp PCR khuyếch đại gen Thyamidine kinase (TK) Phương pháp PCR được thực hiện theo nguyên tắc do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Mạch ADN mới được tổng hợp từ mạch khuôn với mồi đặc hiệu nhờ enzyme Taq polymerase với sự có mặt của các dNTP và ion Mg 2+ và được thực hiện trên các máy chu trình nhiệt (gọi là máy PCR) Cặp mồi để khuyếch đại gen tk được thiết kế dựa trên trình... từ 18-28oC Ở 23oC tỉ lệ chết là 90-95%; ở 18oC là 90%; không thấy tỉ lệ chết ở 13oC (Gilad và cộng sự, 2003), tuy nhiên vẫn phát hiện thấy ADN virus ở nhiệt độ này (Gilad và công sự, 2004) 2.2 Tổng quan tình hình nuôi và bệnh koi herpesvirus ở cá koi và cá chép Việt Nam 2.2.1 Tình hình nuôi cá koi, cá chép ở Việt Nam Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, có nhiều ao, hồ, đầm lầy… Nhân... Bảng 1 Danh sách mẫu cá sử dụng trong nghiên cứu STT 3 4 5 Địa Điểm Số mẫu 25/3/2008 Bắc Giang 2 con Bệnh 24/9/2008 Bệnh lở thân 24/9/2008 Củ Tri – Tp HCM Củ Tri – Tp HCM Hà nội 2 con Cá koi giống Cá chép trần 2 Thời gian Cá chép trần Cá koi mẹ 1 Tên mẫu 2 con Mẹ bị bệnh lở thân 20/1/2009 6 Cá chép giống ao A2 Cá chép 7 Cá chép trần 25/1/2010 8 Cá koi 5/5/2010 Công ty AKIKOI- HN 9 Cá chép 24/5/2010 Bắc... Phương pháp PCR Phương pháp PCR phát hiện KHV dựa vào việc khuyếch đại đoạn gen đặc trưng của virus Hiện nay, PCR được sử dụng rộng rãi nhất trong việc phát hiện KHV vì độ chính xác, độ nhạy và nhanh chóng PCR có thể phát hiện bệnh sớm; giúp cho việc phòng và trị được kịp thời, giảm thiệt hại cho nghề cá Trên thế giới đã có nhiều tác giả nghiên cứu ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh KHV Những test PCR. .. thiết kế là hoàn toàn phù hợp và đặc hiệu cho phát hiện Koi herpesvirus 34 Danh sách các mẫu cá được xét nghiệm KHV bằng PCR được thống kê trong bảng sau: Bảng 2 Kết quả khuyếch đại đoạn gen tk 620 bp trên các mẫu nghiên cứu STT 1 2 3 4 5 Tên mẫu Cá chép trần Cá koi mẹ Thời gian 25/3/2008 Địa Điểm Bắc Giang Số mẫu 2 con PCR - 24/9/2008 2 con - Cá koi giống Cá chép trần 24/9/2008 Củ Tri – Tp HCM Củ Tri... được sử dụng làm mẫu cho phân tích PCR khuếch đại đoạn gen Thyamidine kinase sử dụng cặp mồi KHV TK F, Ro của nhóm nghiên cứu phòng Công nghệ Phôi thiết kế (đã được trình bày ở phần phương pháp, mục 3.3.4) để phát hiện sự nhiễm Koi herpesvirus trong các mẫu cá Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1.5%, TAE 1X Kết quả PCR một số mẫu cá được hiện thị trên điện di đồ dưới đây: M 1 2 3