M: thang chuẩn 1kb
4.4.Kết quả khuếch đại đoạn gen Thyamidine kinase phát hiện Koi herpesvirus
ADN tổng số của các mẫu cá sau khi tách chiết được sử dụng làm mẫu cho phân tích PCR khuếch đại đoạn gen Thyamidine kinase sử dụng cặp mồi KHV TK F, Ro của nhóm nghiên cứu phòng Công nghệ Phôi thiết kế (đã được trình bày ở phần phương pháp, mục 3.3.4) để phát hiện sự nhiễm Koi herpesvirus trong các mẫu cá. Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1.5%, TAE 1X. Kết quả PCR một số mẫu cá được hiện thị trên điện di đồ dưới đây:
Nhìn vào điện di đồ ta thấy phân tích PCR đã khuyếch đại một đoạn gen duy nhất khoảng 620 bp rất rõ nét (đúng như tính toán lý thuyết). Điều này có nghĩa là cặp mồi được thiết kế là hoàn toàn phù hợp và đặc hiệu cho phát hiện Koi herpesvirus.
620 bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 7. Điện di đồ phản ứng PCR phát hiện Koi herpesvirus trên các mẫu cá.
M: thang chuẩn 1 kb, giếng 1: chứng dương (plasmid chứa đoạn gen tk 620 bp); giếng 2: cá chép trần K7; giếng 3: cá chép Bắc Ninh CC4; giếng 4-7: cá chép trần Hà Nội K8-K11; giếng 8: chứng âm (nước cất không nuclease)
Danh sách các mẫu cá được xét nghiệm KHV bằng PCR được thống kê trong bảng sau:
Bảng 2. Kết quả khuyếch đại đoạn gen tk 620 bp trên các mẫu nghiên cứu
STT Tên mẫu Thời gian Địa Điểm Số mẫu PCR
1 Cá chép trần 25/3/2008 Bắc Giang 2 con - 2 Cá koi mẹ 24/9/2008 Củ Tri – Tp HCM 2 con - 3 Cá koi giống 24/9/2008 Củ Tri – Tp HCM 2 con - 4 Cá chép trần 20/1/2009 Hà nội 1 con (K7) + 5 Cá chép giống ao A2 13/2/2009 Viện thủy sản I- Bắc Ninh 13 con (CC2) + 6 Cá chép 3/11/2009 Viện thủy sản I- Bắc Ninh (CC3)3 con + 7 Cá chép trần 25/1/2010 Hoàng Hoa Thám - Hà Nội (K8, K9,4 con K10, K11) + 8 Cá koi 5/5/2010 Công ty AKIKOI- HN (K12→7 con K18) - 9 Cá chép 24/5/2010 Bắc ninh 2 con (CC4) -
Để khẳng định chắc chắn đoạn gen được nhân lên là đoạn gen tk của KHV, một sản phẩm PCR khuyếch đại gen tk bên trên (cá chép trần K10) được nhân dòng để giải trình tự và so sánh với các trình tự gen tk khác trên ngân hàng gen.
4.5. Kết quả nhân dòng và giải trình tự
4.5.1. Kết quả nhân dòng
Sản phẩm PCR khuyếch đoạn đoạn gen tk của cá chép trần K10 được nhân dòng và giải trình tự theo bộ kít nhân dòng CloneJET™ PCR Cloning Kit của hãng Fermentas.
Sản phẩm PCR của K10 sau khi được làm bằng đầu và gắn vào vectơ pJET 1.2, được biến nạp vào dòng tế bào khả biến E.coli DH5α. Sau đó được cấy trải trên môi trường LB đặc chứa Ampicilin 100 µg/ml để chọn lọc khuẩn lạc. Chỉ những khuẩn lạc có chứa vectơ tái tổ hợp mới phát triển được trên môi trường chọn lọc.
4-6 khuẩn lạc E.coli bên trên được chọn lọc để tạo dòng. Các khuẩn lạc sau khi chọn lọc được nuôi cấy trên môi trường LB lỏng để tăng sinh khối và tách lấy plasmid theo bộ Plasmid Mini Extraction của hãng Bioneer. Để khẳng định plasmid nhận được là plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen cần giải trình tự, cắt enzyme giới hạn được thực hiện để kiểm tra.
Hình 8. Hình ảnh khuẩn lạc E.coli trên môi trường chọn lọc (Ampicilin 100 µg/ml)
Bên trên là điện di đồ kết quả cắt enzyme giới plasmid tái tổ hợp. Nhìn vào hình trên ta thấy đối với giếng được cắt enzyme giới hạn đã xuất hiện 2 vạch băng, 1 vạch khoảng 2800 bp tương ứng với kích thước plasmid, 1 vạch băng khoảng 620 bp tương ứng với đoạn gen tk cần chèn vào. Điều này chứng tỏ đoạn gen tk 620 bp đã được chèn vào vectơ pJET 1.2/blunt và sẵn sàng cho việc giải trình tự.
4.5.2. Kết quả giải trình tự và so sánh với các trình tự gen tk trên genbank
Plasmid tái tổ hợp sau khi được kiểm tra bằng cắt enzyme giới hạn được gửi đi đọc trình tự tại Viện công nghệ sinh học trên máy đọc trình tự động ABI 3100 với phần mềm Sequencing Analysis. Kết quả giải trình tự thu được ban đầu dưới dạng file thô chỉ những phần mềm chuyên dụng mới đọc được (Chromas hoặc Bioedit), sau khi biên tập lại trình tự ta thu được trình tự chứa 593 nucleotide.
CATGTTCGCGGGCAAGAGCACAGAGAGCTGCAGGCGGCTGGAGCGTCTGTCCTACAGCGGGCGACGCTGCATCGCCGTCAAGCACGCCATAGACCAGCGCTACACCGAAGAGTCCAAGGTGGCCATGCAC GCTGCATCGCCGTCAAGCACGCCATAGACCAGCGCTACACCGAAGAGTCCAAGGTGGCCATGCAC AGCGGCGCGACCTACCCGGCCATCTCCGCGGGTTACCTGTACGAGGTGATGCAGCGTCTGGAGGA ATACGACGCCGTGGCCGTCGACGAGGGACAGTTCTTCCCCGACCTCTACGAGGGAGTCGTGCAGC TGCTGACCGCGGGCAAGTACGTGATCGTGGCGGCGCTGGACGGGGACTTTATGCAGCAGCCCTTC AAGCAGGTGACGGCGTTGGTGCCCATGGCGGACAAGCTGGACAAGCTGACGGCGGTGTGCATGA AGTGCAAGATGCGCGACGCACCCTTCACCGTCAGAATCTCTCAGGGCACGGACCTGGTCCAGGTT GGAGGCGCCGAGTCTTACCAGGCGGTGTGTCGTCCCTGTCTCACGGGGTTCAGGATGGCCCAGTA M 1 2
Hình 9. kết quả cắt enzyme giới hạn plasmid tái tổ hợp M: thang chuẩn 1 kb
Giếng 1: plasmid được cắt enzyme giới hạn Giếng 2: plasmid không được cắt enzyme giới hạn
2800bp 620 bp
CGAGCTGTACGGTCCGCCGCCTCCTCCTCCTGCGCATAATCTACTGGGTGCGCCCGTCGTGTCAGCCGCTCCAC CGCTCCAC
Trình tự này được đưa lên NCBI (National Center for Biotechnology
Information) để tìm kiếm các chuỗi tương đồng trên Genbank bằng phần mềm trực tuyến Blast. Kết quả tìm kiếm các chuỗi tương đồng được thể hiện dưới bảng sau:
Bảng 3. Kết quả tìm kiếm và so sánh với một số gen tương đồng trên Genbank
Mã gen Tên gen Chiều dài Nguồn
gốc
Mức độ tương đồng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
AB375389.1
Cyprinid herpesvirus 3 (KHV, CyHV-3) TK gene for thymidine
kinase, complete cds, genotype/variant: E7
1000 bp Japan 100%
DQ657948.1 Koi herpesvirus strain KHV-
U, complete genome 295146 bp USA 100%
AJ535112.1 Koi herpesvirus proviral TK
gene for thymidine kinase 651 bp ISRAEL 100%
EU932923.1
Cyprinid herpesvirus 3 isolate KHV-VDL1-TK-Band-K3 thymidine kinase (TK) gene,
partial cds
587 bp USA 99%
EF025504.1
Koi herpesvirus isolate C1 thymidine kinase (TK) gene,
partial cds
471 bp China 100%
AB458384.1
Cyprinid herpesvirus 3 TK gene gene for thymidine
kinase, partial cds
410 bp Japan 100%
EU932921.1
Cyprinid herpesvirus 3 isolate KHV-VDL1-TK-Band-K1 thymidine kinase (TK) gene,
partial cds
353 bp USA 100%
AY660950.3
Koi herpesvirus thymidine kinase gene, partial cds; and
putative glycoprotein gene, complete cds
2175 bp ISRAEL 99%
Dựa vào kết quả này có thể thấy được đoạn gen tk KHV mà chúng tôi khuyếch đại và giải trình tự hoàn toàn tương đồng với các trình tự gen tk KHV khác đã được giải trình tự và đăng ký trên Genbank (mức tương đồng lên tới 99-100%). Điều này khẳng định đoạn gen khuyếch đại được chính xác là đoạn gen tk của KHV và cũng
chứng tỏ rằng phương pháp PCR khuyếch đại gen tk là đặc hiệu cho phát hiện Koi herpesvirus. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});