Với sự phát triển từng bước của ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử và di truyền học, các nhà vi sinh vật học y học đã nghiên cứu, nuôi sống và giữ gìn vi sinh vật có ích trong những điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng những hoạt động có ý nghĩa của nó để tạo ra các chế phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,…giúp phòng điều trị bệnh cho người. Ngày xưa cũng như ngày nay,có những căn bệnh có lịch sử rất lâu đời, phổ biến và gây khó khăn,trở ngại cho việc điều trị bằng các dược phẩm hoá học, trong đó có bệnh tiểu đường.Vậy có biện pháp nào khác giúp đỡ các bệnh nhân này? Câu trả lời là vi sinh vật.
Trang 1Như các bạn đã biết vi sinh vật là những sinh vật vô cùng nhỏ bé không thể trôngthấy bằng mắt thường Tuy nhỏ, nhưng chúng lại có ảnh hưởng vô cùng to lớn đến đờisống của chúng ta.
Với sự phát triển từng bước của ngành vi sinh vật học, sinh học phân tử và ditruyền học, các nhà vi sinh vật học y học đã nghiên cứu, nuôi sống và giữ gìn vi sinhvật có ích trong những điều kiện tối ưu, nhằm lợi dụng những hoạt động có ý nghĩa của
nó để tạo ra các chế phẩm có ích như: vacxin, kháng sinh, hoocmon,…giúp phòng điềutrị bệnh cho người
Ngày xưa cũng như ngày nay,có những căn bệnh có lịch sử rất lâu đời, phổ biến vàgây khó khăn,trở ngại cho việc điều trị bằng các dược phẩm hoá học, trong đó có bệnhtiểu đường.Vậy có biện pháp nào khác giúp đỡ các bệnh nhân này? Câu trả lời là vi sinhvật
Đối với bệnh tiểu đường, người ta dùng một loại vi sinh vật để điều trị đó làInsulin.Câu hỏi đặt ra ở đây là Insulin co tác dụng gì, với những ưu nhược điểm nào.Sau đây,chúng ta hãy cùng nhau bước vào tìm hiểu các vấn đề này nha!
Trang 2GIỚI THIỆU CHUNG
Insulin được 2 nhà sinh lý học người Canada là Fred Banting và Charles Best tìm ranăm 1921 Quá trình nghiên cứu sản xuất insulin có sự đóng góp rất quan trọng của cácchú chó Banting và Best đã cắt bỏ tuyến tụy của những chú chó và hậu quả là chúng bịđái tháo đường Họ đã cố gắng tinh chiết ra một hormone hóa học từ tụy và chiết xuấtnhiều thành phần từ tiểu đảo Langerhan Sau đó, những chất này được tiêm vào chú chó
bị đái tháo đường để thử nghiệm và họ nhận thấy bệnh đái tháo đường bị đẩy lùi Banđầu, thuốc tiêm lẫn nhiều tạp chất và thường gây những tai biến nguy hiểm, một độingũ các nhà khoa học đã phối hợp nghiên cứu và tạo ra được tinh chất chiết xuất từ tiểuđảo Langerhan, bảo đảm đủ độ tinh khiết để thử nghiệm trên người bệnh Vào 11 tháng
1 năm 1922, Leonard Thomson-14 tuổi đã được điều trị thành công ở bệnh việnToronto bằng tinh chất này (insulin) Ông đã sống được đến ngày 20 tháng 4 năm 1935,thọ được 27 tuổi (sau 13 năm 3 tháng tiêm insulin)
Collip và MacLeod là những người đầu tiên đã dùng chiết xuất từ tiểu đảoLangerhan (Insulin) để tiêm cho Leonard Thomson tại Toronto (Canada) ngay sau khiBanting và Best chiết suất được vài ngày Năm 1928, Oskar Wintersteiner đã chứngminh rằng insulin là một protein
Năm 1955, Frederick Sanger-người đoạt giải Nobel đã tìm ra chuỗi axit amin củainsulin người Điều này đã cho phép các nhà khoa học tạo ra một gene insulin, dùng đểtạo ra chủng vi khuẩn biến đổi di truyền có khả năng sinh ra số lượng lớn insulin với độtinh khiết cao
Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tại Công ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982 Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công
Trang 31 KHÁI QUÁT:
1.1 Sơ lược về bệnh tiểu đường:
-Tiểu đường là một dạng bệnh do rối loạn chuyển hóa carbon hydrate khi
hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện
ở mức đường máu luôn cao
-Bệnh tiểu đường có 2 thể bệnh chính: bệnh tiểu đường loại 1 do tụy không tiết
ra insulin, loại 2 do tiết giảm insulin và đề kháng insulin
-Biểu hiện: gia đoạn mới phát sinh, người bệnh thường đi tiểu nhiều, tiểu vào ban đêm và kèm theo chứng khô miệng, khát nước
-Nguyên nhân phát sinh bệnh: do insulin tiết ra thiếu hoặc không đủ và tế bào có tính mẫn cảm với insulin giảm thấp, dẫn tới sự rối loạn quá trình trao đổi đường, nước, chất béo và chất điện giảm trong cơ thể
1.2 Sơ lược về Insulin:
Trang 4- Được sản xuất từ insulin động vật qua các phương pháp:
Bán tổng hợp từ insulin lợn
Tái tổ hợp gen: là loại insulin trung tính đơn thành phần, được sảnxuất bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA, sử dụng nấm men làm cơ thểsinh sản đạt đến độ tinh khiết hóa và chất lượng cao nhất, có cấutrúc giống hệt insulin tự nhiên của người, do vậy ít tạo kháng thể
và thời gian tác dụng ngắn hơn
1.2.2 Cấu tạo:
- Là một protein gồm 51 aa tạo thành 2 chuỗi polypeptid Ở hầu hết cácloài, chuỗi A gồm 21 aa, chuỗi B gồm 30 aa nối nhau bằng 2 cầu nối S-S(disulfua)
- Trọng lượng phân tử khoảng :5800-6000 Dalton
Trang 5Cấu trúc của phân tử insulin
Hình 1 Cấu trúc của phân tử insulinMặc dù trình tự các aaxitamin khác nhau giữa các loài nhưng một số đoạn nhất định củaphân tử có tính bảo tồn cao, các đoạn đó có chứa 3 cầu nối disulfua, cả hai đầu củachuỗi A và các nhánh bên của đầu COOH của chuỗi B Sự tương đồng trong tình tựaxitamin dẫn đến cấu trúc 3 chiều của Insulin ở các loài khác nhau rất giống nhau.Insulin chiết rút từ động vật có hoạt tính sinh học cao hơn các loài khác
Trang 6CẤU TRÚC KHÔNG GIAN CỦA INSULIN
1.2.3 Phân loại:
-Có 4 loại insulin:
Insulin có tác dung nhanhInsulin tác dụng bán chậm (trung bình) Insulin tác dụng chậm
Insulin hốn hợp
1.2.4 Cơ chế:
- Thời gian bán hủy 3-5 phút
- Bị phá hủy tại đường tiêu hóa bởi enzym proteinase tại dạ dày
- Hấp thu tốt bằng đường tiêm Mức độ phụ thuộc vào nồng độ insulin, vị trí tiêm, độ sâu của mũi tiêm, vận động
- Insulin bị chuyển hóa tại gan, thận, cơ Trong đó 50% tại gan
- Đào thải qua thận
2 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT INSULIN:
2.1 Quy trình sản xuất Insulin trước đây:
2.1.1 Đặc điểm quy trình:
Trang 7Sau khi hai nhà khoa học người Canada ( Frederick G Bantingvà Charles
H Best )phát hiện ra insulin và vai trò của chúng từ thí nghiệm về nhữngchú chó, từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên
1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật nhưheo và bò Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acidamin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B)
và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B) Do đó gây ra những tác dụngkhông mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heohay bò Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặpnhiều khó khăn Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từinsulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyểnpeptide (transpeptidation) sử dụng trypsin
Nhược điểm của việc sản xuất Insulin dùng trong lâm sàng chủ yếu cónguồn gốc động vật ( bò và lợn) Tụy của động vật này sẽ được dùng đểtách chiết insulin , vì thế cần một lượng lớn tụy mới có thể sản xuất mộtlượng nhỏ insulin Việc insulin được sản xuất trực tiếp từ tụy động vậtthường có cấu trúc không hoàn toàn giống với insulin người, hoạt độngchức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin người , khả năng hấp thụkém, có thể gây ra những phản ứng phụ Mặt khác trong quá trình táchchiết, không thể loại bỏ hết đươc những tác nhân gây bệnh của động vật,quá trình tách chiết này đòi hỏi kỷ thuật cao, chi phí đắt, không thể sản xuấtvới qui mô rộng lớn, giá thành cao
2.1.2 Nhược điểm quy trình sản xuất Insulin chiết xuất từ động vật:
- Insulin động vật (bò và lợn) có cấu trúc không hoàn toàn giống cấu trúcInsulin ở người
- Hoạt động chức năng trong cơ thể kém hơn so với insulin của người’
- Khả năng hấp thụ kém
- Có thể gây ra phản ứng miễn dịch trong cơ thể người( gây dị ứng)
Trang 8- Trong quá trình tách chiết, không loại bỏ hết các tác nhân gây bệnh từđông vật
- Quá trình tách chiết đòi hỏi kỹ thuật cao
- Chi phí đắt (do cần lượng lớn tụy để sản xuất insulin)
-Không thể sản xuất lượng lớn trên quy mô lớn
-Giá thành cao
2.2 Quy trình sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất Insulin:
2.2.1 Khái quát về công nghệ AND tái tổ hợp:
- Kỹ thuật AND tái tổ hợp là tập hợp nhiều kỹ thuật để tạo ra một gen hoặc
cả hệ gen ; cải biến cấu trúc của gen, nhằm tạo ra các gen mới rồi chuyểnchúng vào trong tế bào, cơ thể chủ nhằm mục đích sản xuất các sản phẩm( protein, enzym,…), các tế bào, cơ thể có tính trạng mới theo mong muốn
- Những hiểu biết sâu sắc về các đại phân tử sinh học là cơ sở khoa học của
kỹ thuật gen( kỹ thuật di truyền) mà khởi đầu là kỹ thuật AND tái tổ hợp
- Kỹ thuật AND tái tổ hợp gồm các bước cơ bản sau:
Tách chiết tạo ra AND, ARN theo mong muốn ( phân lập gen)Tạo vector tái tổ hợp ( chuẩn bị vector tách dòng, enzym cắt giới hạn
và enzym nối)Chuyển ( biến nạp) AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng genSàng lọc và theo dõi sự hoạt động của gen được chuyển vào trong tếbào chủ, tạo số lượng lớn đoạn AND theo mong muốn để sử dụng vàomục đích khác nhau
2.2.1.1 Phân lập gen:
* Tách chiết AND:tùy theo nguồn axit nucleic,có những kiểu táchchiết khác nhau:
Trang 9- Đối với vi khuẩn, nuôi vi khuẩn thu sinh khối lớn, phá vỡ màng,loại bỏ protein bằng enzim, kết tủa và tinh sạch AND bằng hóa chất,dung môi, dịch chiết thích hợp.
- Đối với mô, tế bào động thực vật, nguyên tắc tách chiết AND nhưtrên Tuy nhiên chúng ta trực tiếp lấy các mẫu sinh phẩm như lông,tóc, thịt, máu, nước bọt., mô thân , rễ, lá…
* Tách chiết ARN: quy trình tương tự tách chiết AND, dịch chiết saukhi làm sạch protein, sử dụng enzim phân hủy AND, kết tủa thu ARN
* Định lượng AND, ARN: sản phẩm sau khi tách chiết cần có độ tinhsạch và hàm lượng đủ cho nghiên cứu, dùng phương pháp đo quangphổ để xác định chỉ số hấp phụ, tù đó đánh giá độ tinh sạch và hàmlượng cần thiết Hoặc dùng phương pháp điện di trên gel thạch xácđịnh băng AND, ARN, suy ra độ tinh sạch và hàm lượng cần thiếtcho nghiên cứu
2.2.1.2 Tạo vector tái tổ hợp:
► Vector tách dòng: là phân tử AND có kích thước nhỏ, có khả năng
gắn các gen cần thiết, tự tái bản, tồn tại trong tế bào chủ và đặc biệt phảimang tín hiệu nhận biết trong tế bào chủ đã mang vector tái tổ hợp
-Các loại vector tách dòng thường dùng :
Plasmid : phân tử AND dạng vòng, xoắn kép, có trong tế bào
chất của vi khuẩn
Phagơ : phần lớn là phagơ Lamda, có hệ gen chứa vị trí thuận lợi
cho cài các gen khác nhau, giúp các gen này dễ dàng xâm nhậpvào vi khuẩn có khả năng và có khả năng sao chép nhanh
Virut của tế bào nhân thực : virut SV40, adenovirut, retrovirut,
virut herpes…được sử dụng trong tách dòng và chuyển gen ở tếbào động vật, thực vật
Trang 10► Enzym cắt giới hạn: là enzym có khả năng nhận biết một đoạn trình
tự trên phân tử AND và cắt AND ở những điểm đặc hiệu Đồng thời cắtgen từ hệ gen nào đó, cắt vector tách dòng hoặc vector tái tổ hợp, tạo điềukiện gắn các đoạn gen cần thiết
► Enzym nối Ligasa: là những enzym quan trọng trong tế bào, chúng
xúc tác hình thành các liên kết photphodieste để nối các đoạn axit nucleicvới nhau
-Có 3 loại enzym nối quan trọng trong Công nghệ di truyền: enzym E.ColiAND tách chiết từ vi khuẩn E.Coli, enzym T4 AND và enzym T4 ARNtách chiết từ phage T4 Ngoài ra, ngày nay người ta còn sử dụng các đoạnnối (đầu dính - adaptor ) cho các enzym đầu bằng Adaptor xúc tác nốicác đoạn ADN do các enzym cắt đầu bằng từ đó tạo nên đầu sol Cácadaptor đặc trưng riêng cho mỗi loại enzym
Dùng enzym cắt hạn chế từ hai nguồn AND khác nhau, qua khâunối trộn lẫn sẽ tạo ra sản phẩm AND tái tổ hợp
2.2.1.3 Biến nạp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân dòng gen:
- Đưa AND tái tổ hợp vào tế bào chủ theo kỹ thuật biến nạp( chuyển trựctiếp AND tái tổ hợp vào tế bào chủ) – tế bào chủ có thể là vi khuẩn, tế bàođộng vật, tế bào thực vật; nhờ bộ máy di truyền của tế bào chủ nhân bảnAND tái tổ hợp, tạo sinh khối lớn
- Những phương pháp chủ yếu được dùng để đưa AND tái tổ hợp vào tếbào nhận:
Trang 11 Kỹ thuật siêu âm: chuyển gen vào tế bào trần ( không cóthành Xelulose) trong môi trường thích hợp
Kỹ thuật xung điện: sử dụng dòng điện cao áp ( khoãng 500V/cm) tạo lỗ thủng nhỏ trên tế bào trần, tạo điều kiện gen xâm nhập vào hệgen tế bào chủ
Kỹ thuật vi tiêm: tiêm lượng nhỏ AND vào tế bào chủ hoặc tếbào trứng đã thụ tinh ở giai đoạn phôi 4-8 tế bào
Kỹ thuật bắn gen: dùng thiết bị bắn vi đạn mang gen cầnchuyển ( súng bắn gen) vào hệ gen của tế bào chủ Vi đạn là các hạtVolfram hoặc vàng trộn với gen cần chuyển và phụ gia, vi đạn được bắnvào viên đạn lớn hơn, khi bắn, viên đạn lớn được giữ lại, vi đạn bắn vào tếbào nhận với gia tốc lớn
2.2.1.4 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện của gen:
Việc chọn lọc đúng dòng tế bào như ý không đơn giản và tốn nhiều côngsức Khi xác nhận ADN tái tổ hợp đã xâm nhập vào tế bào và mang đúnggen cần thiết thì chúng được sinh sản để tạo dòng và tạo điều kiện cho genbiểu hiện
Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmit tái tổ hợp: sau khi biếnnạp ADN vào tế bào nhận, tạo nhiều dòng tế bào vi khuẩn khác nhau.Chúng được nuôi cây thành những dòng khuẩn lạc vi khuẩn (gồm dòng tếbào vi khuẩn không nhận được plasmit, dòng nhận được plasmit không cógen lạ và dòng nhận đúng plasmit tái tổ hợp)
Do đó muốn nhận đúng và tách đúng dòng gen từ thư viện ADN, người ta
sử dụng phương pháp:
- Lai axit nucleic: làm tan tại chỗ các khuẩn lạc vi khuẩn trên giấylọc nitrocellulose và ADN thoát ra gắn với mẫu thử axit nucleic có mangdấu phóng xạ với độ dài hàng trăm nu Nếu hiện tượng bắt cặp bổ sung xảy
Trang 12- Phát hiện kiểu hình: đòi hỏi dòng mục tiêu phải có biểu hiện ra ởdạng protein dễ phát hiện bằng các phép thử.
- Phản ứng miễn nhiễm: khi tế bào nhận được plasmit có gắn đoạnADN lạ thì tế bào vi khuẩn mất hoạt tính kháng tetracyclin, do đó khuẩnlạc chỉ mọc được trên môi trường có ampicilin, không mọc được trên môitrường có tetrecyclin Đây là dòng tế bào cần chọn
Sự biểu hiện của gen được tạo dòng: nói chung gen lạ sau khiđược đưa vào tế bào nhận, muốn gen có biểu hiện tổng hợp protein cần cấutạo vector có đủ các yếu tố phiên mã và dịch mã phù hợp trên cơ sở là cơchế điều hòa biểu biểu hiện của gen Các vector này gọi là vector biểu hiện
2.2.2 Ý nghĩa của sử dụng công nghệ AND tái tổ hợp để sản xuất insulin:
Sản xuất Insulin bằng công nghệ tái tổ hợp là một bước nhảy vọt trong việcchữa trị bệnh tiểu đường Ngoài ra một ý nghĩa khá quan trong khi sử dụngcông nghệ này để sản xuất Insulin, đó là hiệu quả kinh tế, khi sử dụng côngnghệ này, giá thành sản phẩm hạ khá nhiều mà chất lượng sản phẩm vẫn bảođảm, chính là nhờ ý nghĩa sản xuất sinh khối cao của tế bào nhân tham giaquy trình con nghệ ADN tái tổ hợp
2.2.3 Quy trình sản xuất Insulin bằng công nghệ AND tái tổ hợp:
Tổng hợp Insulin người là một quá trình sinh hóa gồm nhiều bước, gồm haiphương pháp
2.2.3.1 Phương pháp 1: Tạo ra các chuỗi riêng biệt, kết hợp hoá học hoặctạo một tiền chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thànhinsulin hoàn chỉnh
Bước 1: Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng trong sinh học phân tử tách được
gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể số 11
Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người.Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen, loại bỏ protein
Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT
Trang 13Sử dụng sắc kí ái lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho quá trìnhdịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác.
Cắt bỏ cầu nối A - T thu được mARN
H8 Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người
Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.
- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn Nối bằng ADN ligase của phageT4 Trong thành phần của vector biểu hiện phải
có các promoter mạnh giúp gen biểu hiện được trong vi khuẩn
-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin
ra ngoài tế bào chất
Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:
- Sao mARN tinh khiết thành ADN (cADN) nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)
- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một
promoter mạnh Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli.
Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với
dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện
