Hơn một thập kỷ qua, phương pháp chẩn đoán và giám định loài sinh vật dựa trên đặc điểm ADN đã được phát triển và đang được sử dụng rộng rãi. Lợi thế của phương pháp sinh học phân tử là cho kết quả có độ tin cậy cao, cần ít mẫu vật và không phụ thuộc vào các giai đoạn phát triển của các cá thể sinh vật nên rất phù hợp cho việc chẩn đoán và phân loại các bệnh ký sinh trùng. Với kích thước nhỏ lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các gen của ty thể trong cùng một chủng, cùng loài thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại (Lê Thanh Hoà, 2002). Một trong những gen quan trọng là nad3gen mã hoá cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, có độ bảo tồn cao đã được khai thác phục vụ nghiên cứu, giám định, phân loại và lập di truyền quần thể (Fernadez và cs., 1998). Do tầm quan trọng về dịch tễ học và phòng bệnh sán lá gan nhỏ O. viverrini ở Việt Nam, cũng như ý nghĩa về giám định bệnh bằng chỉ thị di truyền hệ gen, em lựa chọn đề tài tiểu luận: Giám định bệnh sán lá gan nhỏ O. viverrini bằng chỉ thị di truyền gen nad3 của hệ gen ty thể.
I HC NNG TRNG I HC BCH KHOA - - TIU LUN CUI KHểA Tờn ti: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Mụn hc: Cụng ngh ADN tỏi t hp Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.N Ngnh: Cụng ngh sinh hc Nng, 3/2015 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th M U Bnh sỏn lỏ gan nh l mt bnh truyn nhim lõy qua ng n ung, loi Clonorchis sp hoc loi Opisthorchis sp gõy nờn Trong ú, bnh sỏn lỏ gan nh opisthorchiasis Opisthorchis viverrini gõy nờn l bnh quan trng i vi sc khe cng ng cỏc nc ụng Nam bao gm Thỏi Lan, Lo, Campuchia v Vit Nam (IARC, 1994) Nhng mu ký sinh trựng ln u tiờn c Lieper mụ t (1911) Kerr cung cp, ly t t thi ca tự nhõn nh tự Chiengmai (phớa Bc Thỏi Lan) vo nm 1911 Sau ny, nm 1955 Sadun ó nghiờn cu hỡnh thỏi v dch t hc ca loi sỏn lỏ gan ny ụng Bc Thỏi Lan (Sadun v cs., 1955) v kt lun nhng trng hp b nhim sỏn Thỏi Lan l O viverrini gõy nờn v c Wykoff v cng s xỏc nhn li nm 1965 (Wykoff v cs., 1965) Vit Nam, sỏn lỏ gan nh O viverrini c tỡm thy mt s tnh phớa Nam v ó c giỏm nh phõn t bng ch th di truyn h gen ty th (Nguyn Chng, 2000; Lờ Thanh Hũa v cs., 2003; Ngụ Th Hng v cs., 2006) Hn mt thp k qua, phng phỏp chn oỏn v giỏm nh loi sinh vt da trờn c im ADN ó c phỏt trin v ang c s dng rng rói Li th ca phng phỏp sinh hc phõn t l cho kt qu cú tin cy cao, cn ớt mu vt v khụng ph thuc vo cỏc giai on phỏt trin ca cỏc cỏ th sinh vt nờn rt phự hp cho vic chn oỏn v phõn loi cỏc bnh ký sinh trựng Vi kớch thc nh li cha gen ti cn thit cho hot ng sng ca t bo nờn ADN h gen ty th c coi l i tng lý tng kho sỏt s bin i h gen phc v nghiờn cu v giỏm nh, phõn loi v lp ph h qun th Cỏc gen ca ty th cựng mt chng, cựng loi thm cỏc loi cú quan h gn v sinh hc cú s bo tn rt cao, vy bt c s thay i nh no cng l du hiu giỏ tr giỏm nh v phõn loi (Lờ Thanh Ho, 2002) Mt nhng gen quan trng l nad3-gen mó hoỏ cho enzyme nicotinamide dehydrogenase, cú bo tn cao ó c khai thỏc phc v nghiờn cu, giỏm nh, phõn loi v lp di truyn qun th (Fernadez v cs., 1998) Do tm quan trng v dch t hc v phũng bnh sỏn lỏ gan nh O viverrini Vit Nam, cng nh ý ngha v giỏm nh bnh bng ch th di truyn h gen, em la chn ti tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh O viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Chng 1: TNG QUAN V SN L GAN V H GEN TY TH 1.1 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh Vit Nam v trờn th gii 1.1.1 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh trờn th gii Hỡnh 1.1: S phõn b a lý ca cỏc loi sỏn lỏ gan nh chõu Bnh sỏn lỏ gan nh gp nhiu cỏc nc ụng , ụng Nam , Trung Quc, Nht Bn, Hn Quc, Malaysia, Thỏi Lan, Lo, Campuchia (WHO, 1995) v tng lờn cỏc nc phỏt trin s di c ca ngi Chõu (Woolf, A., v cs., 1984) Bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini gõy nờn l mt cn bnh phõn b theo a phng cỏc nc Campuchia, Lo, Thỏi Lan, Malaysia, Vit Nam, Trung Quc Nm 1929, Bedier v Chesneau ó phỏt hin thy O viverrini b nhim nhng ngi Lo Vientian (15%) v Takhet (23%) (Bedier, E., Chesneau, P., 1929) Nm 1997, Lo cú ti 1,7 triu ngi nhim, cú ni t l nhim ti 54,4-100% (Sithithawom v cs., 1997) Thỏi Lan c coi l trung tõm v dch t ca O viverrini, cú khong triu ngi b nhim sỏn lỏ gan (Jongsukusntigul v Imsomboon, 1997) 1.1.2 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh Vit Nam Clonorchis sinensis Opisthorchis viverrini Hỡnh 1.2: S phõn b a lý ca cỏc loi sỏn lỏ gan nh Vit Nam Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Cng nh trờn th gii, bnh sỏn lỏ gan nh Vit Nam cng liờn quan n quỏn sinh hot, c bit nhng ni cú tc n gi cỏ Bnh sỏn lỏ gan nh ó c xỏc nh phõn b ớt nht 18 tnh, thnh ph: Nam nh, Ninh Bỡnh, H Nam, Thỏi Bỡnh, Hi Phũng, Qung Ninh, Bc Giang, H Tõy, Hũa Bỡnh, H Giang, Thanh Húa, Ngh An, Tha thiờn Hu, Qung Nam, Bỡnh nh, Phỳ Yờn, c Lc, Gia Lai, cú ni t l nhim ti 37% nh Nam nh, Phỳ Yờn Riờng nhim O viverrini thỡ c tỡm thy ch yu mt s tnh phớa Nam Hin ó xỏc nh ớt nht tnh lu hnh O viverrini nh Phỳ Yờn (t l nhim 36,9%), Bỡnh nh (t l nhim 11,9%), c Lc (t l nhim 7,6%), Nng (t l nhim 0,3%), Qung Nam (t l nhim 4,6%), Khỏnh Ho (t l nhim 1,4%), Tha Thiờn Hu (phỏt hin ca bnh) (Nguyn Vn Chng, Nguyn Vn , 1996, 1997, 2003) Bng hỡnh thỏi hc Opisthorchis viverrini ó c Nguyn Vn Chng, Nguyn Vn v cng s nm 1997 xỏc nh ti Phỳ Yờn v cụng b nm 2000 v ó c giỏm nh bng ch th di truyn h gen ty th (Lờ Thanh Ho v cs., 2003; Nguyn Vn v cs., 2004; Ngụ Th Hng v cs., 2006) 1.2 Gii thiu s lc v h gen ty th 1.2.1 Mt s khỏi nim c bn Gen l mt n v di truyn cha mt on ADN gii hn gia b mó u v b mó kt thỳc Gen cú th cho sn phm hoc khụng cho sn phm H gen l hp cỏc chui nucleotit phõn b cỏc phõn on di ngn khỏc gi l nhim sc th (NST) (i vi h gen cỏ th bc cao) hoc l mt vũng acid deoxyribonucleic (ADN) khộp kớn (i vi h gen cỏ th bc thp) Plasmid l cỏc yu t di truyn nm ngoi NST, chộp mt cỏch c lp bờn cỏc t bo sinh vt ADN ca chỳng l ADN mch vũng, si kộp, cú mang cỏc gen cn thit cho vic chộp plasmid v cn thit cho cỏc chc nng khỏc ca plasmid Cỏc plasmid c dựng nhiu nht cỏc thớ nghim v ADN tỏi t hp, cú mang cỏc gen bn vng vi cỏc khỏng sinh Nh vy cú th chn lc cỏc phõn t ADN tỏi t hp mt cỏch d dng Chỳng li cú trng lng nh hn nhiu so vi ADN vt ch nờn cú th d dng tinh sch 1.2.2 Ty th v h gen ty th Ty th (mitochondrial) l mt loi t bo quan (organelle) c bit ca t bo, nm t bo cht ca cỏc t bo cú nhõn tht (Eucaryota) Chc nng chớnh ca ty th l s dng cỏc loi enzyme chuyn hoỏ chỳng sn xut, thc hin quỏ trỡnh oxy hoỏ-kh sn xut nng lng di dng ATP cung cp cho cỏc hot ng ca t bo Chớnh vỡ th, ty th c xem nh l nh mỏy nng lng ca t bo ADN ca ty th l mt vũng ADN khộp kớn, cú kớch thc khong 13-40 kb tu loi, cú nhng c im c trng nh tn ti dng n bi, khụng xy quỏ trỡnh tỏi t hp v di truyn theo dũng m Hn na, h gen ty th khụng ln lm, li khụng cú cu trỳc quỏ phc v cú t l bin i nucleotide cao hn h gen nhõn t 10-15 ln Vi cỏc c im trờn, h gen ty th l i tng lý tng rt thun li vic chn oỏn v phõn loi nhiu loi ký sinh trựng, cng nh xỏc nh mi quan h h hng v quan h tin hoỏ ca sinh vt Do ú, vic nghiờn cu cỏc c im ca sinh vt trờn c s h gen ty th ngy cng tr nờn ph bin trờn th gii (Lờ Thanh Ho v cs., 2007) Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th H gen nhõn H gen ty th Hỡnh 1.3: H gen nhõn v h gen ty th t bo Trong mt t bo ng vt luụn tn ti song song hai h gen: h gen nhõn v h gen ty th Hai h gen ny u cú sn phm riờng hot ng cú tớnh cht va c lp va tng tỏc D nhiờn h gen ty th chu nh hng iu hũa ca h gen nhõn H gen nhõn ch cú mt bn mt t bo ng vt, nhim sc th dng thng, ADN si kộp, kớch thc ln (vi trm n vi nghỡn megabase) H gen ty th gm nhiu bn mt t bo, nm t bo cht ADN si kộp, dng vũng, kớch thc 13-25 kb ( ng vt), 40 kb ( thc vt) Mng Mng ngoi Np gp mn Khoang nn 0,5-1mm Hỡnh 1.4: Cu trỳc ty th Ty th v h gen ty th l mt b phn quan trng ca t bo, nú cú hỡnh gy hoc hỡnh ht Di kớnh hin vi in t, ngi ta thy ty th l b phn cú t chc cao Ty th cú hai mng phõn bit rừ rt: mng ngoi nhn, bao quanh ty th, mng cú tng on cú np gp chy vo trung tõm lm thnh nhng mo (cristae) Khoang trung tõm gi l cht c bn Kớch thc thay i tựy loi t bo Trong mt t bo cú 200-300 ty th hot ng (Lờ Thanh Ho, 2002) Vù ng không mã hóa L1 L1 H cox3 QF M cob nad4 VAD atp6 nad2 NP I K nad1 S2 T cox1 nad4L S1 W C rrnL Y rrnS nad3 R G SNR LNR nad6 E nad5 cox2 10 12 14 Hỡnh 1.5: Cu trỳc h gen ty th ng vt Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 15kbp Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th H gen ty th ng vt bao gm mt vũng ADN khộp kớn cha khong 13-25 nghỡn nucleotit gm 12-13 gen cho sn phm Protein, gen ARN Ribosome (rARN), 22 gen ARN chuyn (tARN) v mt s tiu phn khỏc Cỏc chui giao gen thng ngn (tuy nhiờn cng cú ớt nht mt vựng khụng mó húa di), cựng vi b ba u cho vic chộp mt s loi cú liờn quan n tớnh n nh ca cu trỳc bc Cho n cú hn 130 h gen ty th ca cỏc ng vt t n bo n a bo ó c phõn tớch y hoc gn y iu ny l mt thun li to ln cho vic s dng h gen ty th nghiờn cu (Lờ Thanh Ho, 2002) Trt t ca gen ty th thng n nh qua mt thi gian di S khỏc bit gia cỏc thnh viờn mt h thng l him Trong nhng khỏc bit rừ rng cú th xy loi cao hn, c bit cỏc lp hoc ph h iu ny rt thun li cho vic nghiờn cu chn oỏn, giỏm nh loi bng sinh hc phõn t vi ch th di truyn l h gen ty th Do kớch thc gen nh li cha gen ti cn thit cho hot ng sng ca t bo, ADN h gen ty th c gi l i tng lý tng kho sỏt s bin i h gen phc v nghiờn cu v chn oỏn, phõn loi sinh vt Cỏc gen ty th li cú s bin i nhanh hn h gen nhõn t bo 10-15 ln nờn rt thun li cho vic nghiờn cu Cỏc gen ca ty th cựng chng, loi thm cỏc loi cú quan h gn v sinh hc cú s bo tn rt cao, vy bt c s thay i nh no cng l du hiu giỏ tr giỏm nh v phõn loi Nghiờn cu h gen ty th cũn cú tm quan trng chn oỏn, iu tr v phũng chng bnh, vỡ cú nhiu bnh ngi v ng vt cú liờn quan ti s bin i ty th i vi ký sinh trựng, s hiu bit y v h gen ty th cũn cú giỏ tr nh hng phũng chng c bit l tỡm kim húa cht, húa dc iu tr bnh ký sinh trựng hoc thc nghim cỏc loi vacxin th h mi 1.2.3 Gen nad3 (nicotinamide dehydrogenase) Loi sỏn lỏ gan nh O viverrini Phỳ Yờn (OvPY4) c giỏm nh bng on gen cú chiu di khong 1,3kb, on gen ny bao gm ton b gen nad3 m chỳng tụi dựng phõn tớch, so sỏnh H V A D Q FM cob nad4 atp6 nad2 N P I K nad1 S1 W T cox1 nad3 nad4L OvF ~1,3kb OvR O viverrini Hỡnh 1.6: S minh v trớ cp mi bỏm Chc nng ca gen nad3 l tng hp NADH cung cp in t cho cỏc chu trỡnh hot ng ca t bo c im ca gen nad3 l cú h s bo tn cao h gen ty th, ớt t bin, ch t bin 3-4/357 nucleotide (Ngụ Th Hng v cs., 2006) T nhng c im ú cho thy gen nad3 cú th dựng lm s liu so sỏnh vic giỏm nh, chn oỏn loi sỏn lỏ gan nh O viverrini Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th 1.3 Tm quan trng ca vic nghiờn cu bnh sỏn lỏ gan nh bng phng phỏp sinh hc phõn t 1.3.1 Gii thiu chung Sinh hc phõn t l mt lnh vc quan trng khỏm phỏ h gen bờn trong, nghiờn cu cu trỳc, mi tng quan v biu hin kiu gen (genotype) ca i tng Nh vy, núi n sinh hc phõn t ngha l núi n cu trỳc c bn v gen v di truyn cng nh cỏc k thut nhm phc v cho quỏ trỡnh nghiờn cu v thc nghim lnh vc ny Phng phỏp sinh hc phõn t ang c ng dng ngy cng rng rói v cú hiu qu mi lnh vc sinh hc ú l vic s dng cỏc k thut ADN (trc ht l k thut PCR) v k thut protein xỏc nh chui gen hay chui amino acid ca tng gen, cng nh lp bn gen ca tng khu vc nht nh h gen ca loi cn chn oỏn so sỏnh i chiu vi nhng loi khỏc, nhm xỏc nh chớnh xỏc loi mong mun Cú rt nhiu phng phỏp chn oỏn sinh hc phõn t, trc ht phi k n phng phỏp di truyn hc t bo, phng phỏp hp lai ADN-ADN, phng phỏp hp lai ADN phúng x, phng phỏp phõn tớch bin thỏi phõn on ADN bng k thut enzyme gii hn (RFLP), cng nh rt nhiu phng phỏp s dng phn ng PCR (polymerase chain reaction) hoc phi hp PCR vi phng phỏp ADN Tớnh chớnh xỏc so sỏnh cu trỳc trt t nucleotit ca h gen cỏc cỏ th khỏc cho phộp cú c s phõn bit chớnh xỏc c tớnh di truyn hc ca cỏ th, k c sn phm gen ca chỳng cú th b nh hng tng tỏc ca mụi trng v ng loi Ngy nay, kho sỏt v phõn tớch cu trỳc ADN ca cỏ th so sỏnh c coi l phng phỏp ti u nghiờn cu sinh vt núi chung v ký sinh trựng núi riờng, t mt hng mi: hng giỏm nh, phõn loi v nghiờn cu tin hoỏ bng phng phỏp sinh hc phõn t, ỳng hn l phng phỏp ADN Phng phỏp ADN cú nhy v tớnh chớnh xỏc cao, c bit chn oỏn phỏt hin bin chng, thm cỏc cỏ th ng chng, c vựng ADN nghiờn cu khụng cho sn phm gen (non-coding region), hay c mt s gen trng thỏi im lng (silent genes) Phng phỏp ADN cũn bao quỏt c phng phỏp Protein, vỡ cu trỳc gen chui nucleotide ó c xỏc nh thỡ cu trỳc protein cng d dng xỏc nh ỏnh giỏ v so sỏnh S phỏt trin ca k thut mỏy tớnh in t (computational technology), kt hp vi cỏc k thut ADN (DNA technology) hỡnh thnh nờn mt lnh vc khoa hc nghiờn cu v ng dng mi gi l Sinh-tin hc (Bioinformatics) cho phộp ng dng phng phỏp ny mt cỏch hiu qu v rng rói Tuy nhiờn phng phỏp sinh hc ny ũi hi trang thit b t tin, tn kộm v cn cỏc nhõn viờn k thut cú trỡnh cao Nh vy, vic chn oỏn, giỏm nh v phõn loi nhiu loi sinh vt, k c ký sinh trựng cho n da vo cỏc phng phỏp truyn thng l chớnh, trc ht phng phỏp hỡnh thỏi hc chim v trớ quan trng Cỏc phng phỏp sinh hc phõn t ó bc u c ng dng chn oỏn phõn loi v lp ph h sinh vt Cỏc s liu chớnh xỏc ca cỏc phng phỏp sinh hc phõn t ó cho phộp ng dng nhng hng mi v rt cú th s lm thay i mt phn h thng phõn loi hin cú Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th 1.3.2 Tm quan trng ca vic nghiờn cu bnh sỏn lỏ gan nh bng phng phỏp sinh hc phõn t Hin nay, Vit Nam cng nh trờn th gii vic phũng chng cỏc bnh ký sinh trựng gõy cú vai trũ rt quan trng cho vic chm súc sc khe ngi dõn T chc y t th gii (WHO, 1995) ó a cỏc chng trỡnh y t ln nhm chng li cỏc bnh lý ký sinh trựng gõy ra: chng trỡnh phũng chng st rột, chng trỡnh phũng chng cỏc bnh v giun, sỏn Cỏc chng trỡnh u rt tn kộm nhng hiu qu ca nú thỡ cha c nh mong mun Trong ú cú khỏng thuc ca ký sinh trựng, xỏc nh s phõn b, vựng dch t, t l mc bnh cũn gp nhiu khú khn Vit Nam l mt nc nm vựng nhit i, rt thun li cho ký sinh trựng phỏt trin Hn na iu kin kinh t, y t cũn cú nhiu khú khn, cng vi cỏc quỏn sinh hot cũn lc hu nht l cỏc vựng nụng thụn, vựng xa, iu kin v sinh cha m bo, vỡ vy t l mc cỏc bnh v ký sinh trựng Vit Nam cũn rt cao ú cú bnh sỏn lỏ gan Mt khỏc, nm gia vựng dch t, bao bc xung quanh bi cỏc nc cú t l nhim bnh sỏn lỏ gan nh cao: Trung Quc, Lo, Campuchia, Thỏi Lan, Malaysia, Philippine nờn vic phũng chng bnh sỏn lỏ gan nh l quan trng v cp thit Chỳng ta u bit hu qu sỏn lỏ gan gõy cho ngi b nhim l rt trm trng: x gan, ung th gan, ung th ng mt õy l nhng gõy nờn nhng tn tht rt ln v sc khe v kinh t cho gia ỡnh v xó hi Vic s dng phng phỏp sinh hc phõn t m c th l ng dng phng phỏp PCR chn oỏn v phõn loi bnh sỏn lỏ gan nh núi riờng v bnh ký sinh trựng núi chung cú mt ý ngha ht sc to ln Nh phng phỏp ny m ngi ta cú th chn oỏn t rt sm, rt chớnh xỏc tỏc nhõn gõy bnh Ngay c bnh nhõn cha cú triu chng (ngi lnh mang trựng) iu ny giỳp cho cỏc nh iu tr hc la chn phng phỏp iu tr hiu qu ớt tn kộm nht, gúp phn ngn chn cỏc hu qu xu bnh gõy Vic xỏc nh cỏc cu trỳc mt gen hay nhiu gen c trng ca sỏn lỏ gan nh cũn giỳp cho cỏc nh sinh hc xỏc nh c sn phm c th ca gen ú õy s l c s cho vic sn xut cỏc khỏng nguyờn c hiu, s dng cho phng phỏp chn oỏn bng dch hc Phng phỏp sinh hc phõn t cũn giỳp cho cỏc nh dch t hc xỏc nh c mt cỏch chớnh xỏc t l mc bnh, loi ký sinh trựng gõy bnh, vựng phõn b ca cỏc ký sinh trựng t ú cỏc chng trỡnh phũng chng phự hp v hiu qu Trong chn oỏn bnh sỏn lỏ gan, phng phỏp PCR cũn l c s, nn tng c bn u tiờn cho vic tip cn vi mt phng phỏp k thut chn oỏn mi T õy, s m rng vic ng dng nú vic chn oỏn cỏc bnh lý khỏc nh bnh v vi khun, virus: lao, viờm gan, HIV v thm c vic chn oỏn sm bnh ung th Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Chng 2: NGUYấN, VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 Nguyờn liu v phng phỏp thu nhn mu Nguyờn liu nghiờn cu l mu sỏn lỏ gan nh trng thnh cú kớch thc 1,2 x 0,1 cm, mu vng nht, thu nhn trờn ngi, c xỏc nh l O viverrini v mt hỡnh thỏi hc Cỏch thu nhn mu c tin hnh nh sau: chn cỏc bnh nhõn cú tin s cú n gi cỏ dic sng, sau ú cho xột nghim phõn Nhng bnh nhõn xột nghim cú trng sỏn lỏ gan nh c iu tr bng liu Distocid (6 viờn), sau ú ói phõn ca bnh nhõn ú tỡm sỏn trng thnh Mu sỏn c nh loi da vo cỏc c im hỡnh thỏi hc, sch bng nc mui sinh lý nhiu ln, trc chuyn vo cn 70% v bo qun -850C 2.2 Vt liu 2.1.1 Thit b dng c Mỏy ly tõm Eppendorf (Centrifuge 5415D) Mỏy PCR (mỏy PTC-100) ca MJ Research Inc Mỏy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), cú kốm theo mỏy vi tớnh Mỏy tớnh v cỏc phn mm tin-sinh hc Thit b dựng in di kim tra sn phm PCR ca hóng Bio-Rad Mỏy n nhit, mỏy lc t bo Laminair cy vụ trựng B pipetman (10l, 20l, 200l, 1000l) v u cụn cỏc loi, ng Eppendorf cỏc loi, a Petri, l ng mụi trng, ng nuụi vi khun Mỏy Vortex 2.1.2 Hoỏ cht B kit tỏch chit ADN tng s, QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA) v hoỏ cht hóng Qiagen cung cp B kit dựng cho phn ng PCR hóng Invitrogen cung cp Dung dch m in di TAE 1X v bt agarose B kit tỏch dũng TA-cloning Kit hóng Invitrogen cunng cp Mụi trng LB lng v mụi trng LB agar 1,5% Mụi trng dinh dng SOC c cung cp cựng vi b TA-cloning Kit Khỏng sinh kanamycin (50 mg/ml), X-gal, cn tuyt i B kit tỏch plasmid tỏi t hp, QIAprep Spin Miniprep Kit hóng Qiagen cung cp B kit dựng cho phn ng PCR gii trỡnh trỡnh t B kit dựng tinh sch sn phm PCR gii trỡnh trỡnh t 2.1.3 Dung dch s dng bin np ADN plasmid vo t bo E.coli v mụi trng nuụi cy chn lc t bo bin np Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Dung dch: dung dch giu dinh dng SOC: - trypton: 20g/l; dch chit nm men: 5g/l; NaCl: 10mM; KCl: 2,5mM; MgCl2: 10mM; MgSO4: 10mM; glucoz: 20mM Mụi trng: Mụi trng LB (Luria-Bertani): 1% Trypton; 0,5% cao nm men; 1% NaCl Mụi trng chn lc: mụi trng LB c: thnh phn nh mụi trng LB v b sung thờm agar 1,5%, Kanamycin (t l 1:1 so vi th tớch mụi trng LB), X-gal (t l 2:1 so vi th tớch mụi trng LB) Mụi trng nuụi cy: tng t mụi trng chn lc nhng khụng b sung agar 2.1.4 Cỏc dung dch dựng in di ADN trờn gel agarose Dung dch m TAE c 50X (100ml): Tris-kim: 24,2%; Axit axetic: 5,71ml; EDTA 0,5M (pH8,0): 10ml m tra mu (6X) (loading dye): Bromophenol blue: 0,25%; Xylen cyanol FF: 0,25%; Glycerol: 30% Dung dch nhum gel: ethidium bromide (EtBt): 0,5 mg/ml 2.3 Phng phỏp nghiờn cu (cú ph lc chi tit) Phng phỏp tỏch chit ADN tng s t mu vt Phng phỏp in di trờn gel agarose Phng phỏp khuych i invitro ADN bng phn ng trựng hp polymerase (PCR) Phng phỏp tinh sch sn phm PCR Phn ng ni ADN ngoi lai vo plasmid Phng phỏp sc nhit bin np vect vo t bo v nuụi cy chỳng trờn mụi trng thch Phng phỏp chn lc khun lc v nuụi cy mụi trng lng Phng phỏp tỏch chit ADN plasmid tỏi t hp Phng phỏp x lý ADN plasmid bng enzyme ct hn ch Phng phỏp gii trỡnh trỡnh t Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th PH LC Quy trỡnh giỏm nh bnh sỏn lỏ gan bng Cụng ngh ADN tỏi t hp Thu, bo qun mu vt X lý v chun b mu vt Tỏch chit ADN/ARN tng s Kim tra ADN/ARN tng s Qui trỡnh PCR/RT PCR Kim tra sn phm PCR/RT PCR Tinh sch sn phm PCR/RT PCR Ni sn phm PCR/RT PCR vo plasmid vect Chuyn np v nuụi cy trờn mụi trng thch Chn lc khun lc v nuụi cy mụi trng lng Tỏch chit ADN plasmid tỏi t hp Kim tra ADN plasmid tỏi t hp Qui trỡnh PCR gii trỡnh trỡnh t Tinh sch sn phm PCR gii trỡnh trỡnh t Gii trỡnh trỡnh t Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 20 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Cỏc bc thc hin 2.1 X lý v chun b mu vt Mu sỏn sau thu nhn, bo qun, trc em tỏch chit ADN tng s s c sch cn nhiu ln bng nc ct vụ trựng ri ct nh mu d nghin Nghin nh mu bng chy inox ó c kh trựng bng cỏch sch, ri nhỳng cn 70% t trờn ngn la ốn cn nhiu ln 2.3 Tỏch chit ADN tng s ADN tng s ca tng mu vt riờng bit c tỏch chit bng QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA) Nguyờn lý tỏch chit ADN tng s Mu vt em tỏch phi c nghin nh d tỏch chit tỏch chit c h gen ca nhõn v h gen ca ty th cn phi phỏ v mụ Huyn dch thu c gm thnh phn chớnh l protein hoc cú th cú ARN nờn cn phi tỏch b chỳng Loi b protein bng cỏch b sung Enzyme proteinase K cú tỏc dng phõn hu Protein, b sung RNase cú tỏc dng phỏ hu ARN Sau ú cn phi phỏ v mng t bo thu h gen ca nhõn v h gen ca ty th, phỏ v mng t bo ngoi ADN cũn cú cỏc thnh phn khỏc ca nguyờn sinh cht nờn cn phi tỏch riờng ADN, loi b cỏc thnh phn khỏc bng cỏch kt ta ADN bng ethanol ri gii v thu ADN cho lc trờn mng lc tớch in dng Cỏch tin hnh - Mu vt sau x lý c nghin tip 180àl dung dch ATL (ATL buffer) bng chy inox cho n thnh dung dch ng nht - B sung 20àl Proteinase-K (50mg/ml) - B sung 4àl RNase-A (100mg/ml) ri 550C gi - Thờm 200àl AL, lc mnh ri 700C 30 phỳt - Thờm 200àl Ethanol (96-100%), vontex 15-20 giõy - Ton b hn dch c chuyn lờn mng lc ca ct lc (QIAamp Spin Column), ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, loi b phn dung dch bờn di - Thờm 500àl dung dch AW1 vo ct lc ADN bỏm vo mng, ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, b dch di - Thờm 500àl dung dch AW2 vo ct lc tip ADN bỏm vo mng, ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, b dch di - Chuyn sang ng eppendorf mi, ADN tng s c thụi bng 100 àl dung dch AE, ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt Thu c ADN tng s Kớ hiu mu OV1 genomic v bo qun -20oC cho n s dng 2.4 Kim tra ADN tng s C s lý thuyt Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 21 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th ADN tng s c kim tra bng in di trờn gel agarose 0,8-1% in di c thc hin bng cỏch a mu axit nucleic vo gel v t mt in ỏp vo ú Trng thỏi ú c trỡ cho n cht nhum ỏnh du (thng l xanh bromphenol) b sung vo mu trc a vo gel chy ti u cui ca gel Cỏc axit nucleic trờn gel thng hin th nhum bng ethidium bromide v c quan sỏt di ỏnh sỏng tia t ngoi Cỏc axit nucleic hin lờn dng bng mu trng cú th chp nh c v ghi nhn li Kớch thc cỏc bng ADN c so sỏnh vi ch th di truyn (DNA marker) c cho vo cựng lỳc vi sn phm PCR mt l riờng bit, cnh cỏc l dựng phỏt hin cỏc sn phm PCR ADN marker hay c dựng nht l ADN thc khun th Lamda, cú chiu di 43 kb, c ct bng enzyme gii hn HindIII ADN ca thc khun th Lamda c HindIII ct thnh phõn on cú di nh sau: 23,1kb; 9,4kb; 6,5kb; 4,3kb; 2,3kb; 2,0kb; 0,56kb v 0,125kb Trờn thc t hin th trờn thch agarose, ch nhỡn c bng, cũn bng cú chiu di 0,125kb thỡ rt khú phỏt hin Nh ch th di truyn ny ngi ta cú th xỏc nh c di ca on PCR sn phm Cỏch tin hnh - Chun b gel agarose 1%: ly 0,4 g thch agarose nguyờn cht cho vo ci ong thu tinh chu nhit, vo ú 40 ml m TAE 1ln (1ìTAE) Cho vo lũ vi súng t núng chy phỳt cho agarose tan chy ht B sung àl ethidium bromide vo thch ó tan chy vo h thng in di, gi lc cú nhiu rng vo v ngp Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 22 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th rng lc khong 0,5 cm v ngui nhit phũng Khi ngui, cỏc rng lc s to thnh cỏc ging chỳng ta cho mu vt vo kim tra - Dỡm ngp khay cú thch hp in di cha m TAE ln (m cung cp ion cho in trng hot ng) - Tra mu: ly 5àl sn phm, trn ch th mu (Thng l xanh Bromophenol v glycerol) vi mu v tra riờng bit vo tng ging thch - Tra ch th phõn t: ging riờng bit khỏc cho 10 àl (0,5àg) ch th phõn t (DNA marker) (ADN ca thc khun th Lamda ct bng enzyme gii hn HindIII) - Chy in di 100-120V 25-30 phỳt - Ra gel bng nc ct, sau ú soi qua tia cc tớm v chp nh 2.5 Qui trỡnh PCR DEDENATURATION 93C - DENATURATION 95C 93C - 95C ANNEALING 37C - 65C 25-35 CYCLES 25-40 cycles DENATURATION 93C - 95C EXTENSION 72C C s lý thuyt PCR l mt phn ng sinh húa ph thuc nhit , s dng c im ca quỏ trỡnh chộp ADN vi s tham gia ca mt loi enzyme ADN-polymerase chu nhit, cú on ngn ADN mt si lm mi v dựng cỏc on ADN mch n lm khuụn tng hp nờn si mi b sung vi nú Vỡ vy u quỏ trỡnh tng hp ADN cn cung cp on mi oligonucleotit (cú di 6-30 nucleotit) on ny gn kt vi ADN lm khuụn ti im u chộp v c enzyme ADN-polymerase iu khin tng hp nờn mt si ADN c thự Cỏc si ADN mch n c to theo cỏch n gin l nõng nhit lờn trờn 900C (92-980C) m thng l chui xon kộp ADN bung Phn ng PCR c thc hin trờn mỏy MJ Thermal cycler PCT-100 (MJ Research, USA) Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 23 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Thnh phn ch yu ca phn ng PCR, gm: - ADN lm khuụn - Hai on mi xỏc nh cỏc im bt u tng hp ADN - Enzyme chu nhit ADN-polymerase (hin dựng ph bin nht l Taq, chit xut t vi khun chu nhit Thermus aquaticus) - Hn hp ca tt c tin cht deoxynucleotit ( dng dNTP) - Mụi trng m cung cp ion Magiờ (Mg2+) v nc tinh khit (khụng cú ADNaza, ARNaza ) (Dung tớch tng s cho mt phn ng PCR thụng thng l 50l v 20l) Cú giai on (3 bc iu chnh nhit ) cho chu k: - Bung liờn kt ca ADN: c thc hin nhit 90-980C vi giõy n vi phỳt Ti nhit ny, cỏc phõn t ADN mch kộp s b tỏch to nờn cỏc si n dựng lm khuụn cho cỏc on mi bỏm vo v enzyme taq polymerase xỳc tỏc tng hp - Mi bỏm (hay cũn gi l vi mi): Sau bc 1, lp tc nhit c h xung 37-680C cỏc on mi bỏm vo vi cỏc trỡnh t b sung tng ng trờn cỏc phõn t ADN lm khuụn - Tng hp (hay cũn gi l kộo di): Nhit lp tc c nõng lờn 68-720C (thụng thng l 720C) vi chc giõy n vi chc phỳt cỏc si ADN va c tng hp xon vo to nờn ADN si kộp, chớnh l sn phm PCR C nh vy, phn ng xy 25-35-40 chu k v tip tc cho n chu k cui cựng Sau chu k cui, nhit c trỡ 720C 5-10 phỳt cho tt c cỏc si n ADN cú phn ng xon li to nờn sn phm PCR Cui cựng nhit h xung 40C bo qun sn phm Cỏch tin hnh phn ng PCR Thnh phn mụi trng: + PCR master mix: 25àl + Primer 1: 2àl + Primer 2: 2àl Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 24 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th + Khuụn: + Nc tinh khit: Tng s: Chu trỡnh nhit: 3àl 18àl 50àl 940C phỳt 94 C 30 giõy 52 C 30 giõy 35 chu k 72 C phỳt 72 C 10 phỳt Kớ hiu mu: OV1 PCR1 2.6 Kim tra sn phm PCR Sn phm PCR c kim tra bng in di trờn gel agarose 1% 2.7 Tinh sch sn phm PCR (purification) Tinh sch sn phm PCR bng b QIA quick PCR purification kit Cỏch tin hnh - Thờm 200àl PB (x /sp) vo 40àl sn phm - trn u bng pipetman - Chuyn ct, ly tõm 13000 vũng/1 phỳt phỳt , b di - Thờm 750àl PE, ly tõm 13000 vũng/1 phỳt phỳt, b di - Ly tõm tip 13000 vũng/1 phỳt phỳt, b di - Chuyn ct sang epp mi - Thờm 30àl EB, ly tõm 13000 vũng/1 phỳt phỳt - Sn phm PCR tinh sch thu c cựng vi EB nm di, gi 200C Kớ hiu mu v gi -20oC cho n s dng 2.8 Phng phỏp to dũng Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 25 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th 2.8.1 Ni sn phm PCR vo plasmid vect (ligation) C s lý thuyt Vect s dng lai l pCR2.1TOPO (Invitrogen) cú c im l cú u li T ó c thit k sn Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 26 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th Cu trỳc ca vector pCRđ2.1TOPO Sn phm PCR cú u A u 3OH- V trớ ni sn phm PCR c gn vo gia v trớ lacZ lm bt hot lacZ khụng cho nú sn xut enzyme -galactosidase Enzyme -galactosidase cú tỏc dng xỳc tỏc thu phõn mt loi hoỏ cht l X-gal to nờn mu xanh v vi khun khụng mang plasmid tỏi t hp s to nờn khun lc mu xanh Nu sn phm ni thnh cụng vo gen lacZ thỡ s lm bt hot hot ng ca gen ny vỡ th vi khun mang vect tỏi t hp s khụng phõn hu c cht X-gal v khun lc s mang mu trng nuụi trờn mụi trng cú cha X-gal Thnh phn lai + TOPO vect: 1àl + Nc tinh khit: 1àl + Sn phm PCR: 3àl + Dung dch mui: 1àl Tng s: 6àl Gi 10 phỳt 2.8.2 Chuyn np v nuụi cy trờn mụi trng thch C s lý thuyt ca quỏ trỡnh chuyn np T bo s dng chuyn np l t bo kh bin (competent cells): t bo E coli chng K-12 ó c x lý cho mng t bo mng plasmid d i vo nguyờn sinh cht T bo E coli s dng l DH5T1 Gen mó hoỏ cho enzyme nuclease ca chng ny ó b loi b, ú trỏnh c hin tng ct b cỏc on ADN ngoi lai Mc khỏc, lp thnh t bo cng c bin i vi mc ớch tng kh nng tip nhn cỏc ADN l quỏ trỡnh bin np H enzyme t bo cng rt phự hp vi vect tỏch dũng pCR2.1 Chớnh vỡ vy, khụng nhng kh Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 27 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th nng chộp ca vect t bo din rt thun li m kh nng nhõn plasmid ngoi lai t bo E coli DH5T1 cng rt ln Plasmid nguyờn sinh cht s cựng nhõn lờn vi t bo ch c nuụi mụi trng dinh dng Cỏc bc tin hnh (thc hin iu kin vụ trựng, t cy Lamine) + Ly 3àl sn phm lai chuyn vo ng t bo kh bin (100àl) + ỏ 45 phỳt, sock nhit 420C 45 giõy, lp tc chuyn vo ỏ phỳt + Thờm 150 àl dung dch SOC (dung dch giu dinh dng), lc 370C gi 30 phỳt Nuụi cy trờn mụi trng thch: - Tri a: Mụi trng thch LB (Luria-Bertani) 1,5%: B sung thờm nuụi cy + agar agar 1,5% + Kanamicine hoc ampicilin: 50100àl (theo t l 1:1 so vi th tớch mụi trng LB) + X-gal: 200àl (theo t l 2:1 so vi th tớch mụi trng LB) Pha X-gal formamide: 400mg/10 ml, trỏnh ỏnh sỏng Kh trựng tht sch que cy bng cỏch lau cn 70% hoc nhỳng cn h trờn ngn la ốn cn Ly khong 200 àl dung dch ó c chuyn np trờn tri u trờn mt thch LB agar Cỏc a petri c t t m 370C 18-20 gi, chuyn sang 40C 2-3 gi cho vic phõn bit mu c rừ rng Kớ hiu trờn a 2.8.3 Chn lc khun lc v nuụi cy mụi trng lng Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 28 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th C s lý thuyt Chn lc vi khun tỏi t hp thc hin bng phng phỏp: chn lc theo phn ng c cht nhm loi tr nhng vi khun khụng chuyn np thnh cụng vect tỏi t hp v chn lc theo phng phỏp khỏng sinh nhm loi tr nhng vi khun khụng chuyn np c bt k vect v cỏc loi vi khun nhim khỏc Theo c ch X-gal Chn nhng khun lc cú mu trng mang vect tỏi t hp, khụng chn nhng khun lc cú mu xanh Vi khun E.coli khụng cha plasmid tỏi t hp thỡ s cú gen lacZ hon chnh sn xut enzyme -galactosidase v s phõn hu c cht X-gal cú mụi trng to nờn dn xut indol, dn xut ny ngoi mụi trng s b oxy hoỏ cho mu xanh Nu cú on ADN ngoi lai (ADN ca PCR nhõn vựng gen mong mun) xen vo gia gen lacZ thỡ gen ny s b bt hot, enzyme -galactosidase khụng c sn xut vỡ th mc dự cú X-gal mụi trng nhng c cht ny khụng b phõn hu, khụng to nờn dn xut indol v khun lc cú mu trng Theo c ch khỏng sinh T bo E coli nguyờn thu khụng tip nhn c plasmid tỏi t hp nuụi cy trờn thch cho dự cú X-gal hay khụng, nu khụng cú khỏng sinh c ch chỳng phỏt trin thnh khun lc cú mu trng v d nhm ln vi khun lc ca vi khun tỏi t hp Do vy ngi ta phi dựng khỏng sinh (Kanamycin hoc Ampicilin) loi tr chỳng Chỳng s b khỏng sinh tiờu dit, cũn vi khun tip nhn plasmid pCR2.1 cú cha gen sn xut enzyme phỏ hu khỏng sinh nờn tn ti v phỏt trin thnh khun lc Cỏch tin hnh (thc hin t cy vụ trựng Lamine) Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 29 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th - Khun lc mu trng trờn mụi trng LB agar c la chn nuụi cy cỏc ng cha mụi trng LB - B sung 10àl Kanamycin chn lc dũng cú mang gen khỏng khỏng sinh - Cú th b sung thờm 7àl X-gal vo mụi trng loi b nhng ng mụi trng cú mu xanh (on gen cha insert vo vect) m chn lc khun lc b ln hoc chn lc khun lc cú nhõn hi xanh - Sau cy khun lc, ng mụi trng c lc 220 vũng/phỳt trong1620 gi 370C cho vi khun nhõn lờn Thnh phn mụi trng LB lng tng t nh mụi trng LB agar nhng khụng b sung agar 2.9 Tỏch chit ADN plasmid tỏi t hp C s lý thuyt Trong vi khun tỏi t hp cú hai h gen c nhõn lờn: ú l h gen ca chớnh vi khun ch v h gen ca plasmid tỏi t hp Tỏch ADN plasmid tỏi t hp chớnh l thu nhn h gen ca plasmid v loi tr h gen vi khun ch m chỳng ta khụng cn Cú nhiu cỏch khỏc nhau, s dng nhiu thnh phn v dng c khỏc nhng núi chung tt c u theo nguyờn tc c túm tt nh sau: t bo vi khun phi b phỏ v gii phúng cỏc thnh phn t bo, ú cú ADN Cỏc loi ARN phi b phỏ hu (ARNaza), cỏc thnh phn t bo quan v ADN phõn t lng ln c lm kt ta (mui axetat) v loi b chỳng Thnh phn plasmid l cỏc vũng ADN cũn li hn hp dung mụi s Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 30 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th c thu nhn bng phng phỏp ta cn hoc hp th trờn mng lc ch gi li ADN ca plasmid Cỏc bc tin hnh tỏch bng phng phỏp QIA Prep Spin Kit ca hng Qiagen: - Ly 1,5-2ml dung dch t bo vi khun tỏi t hp ó c nuụi cy qua ờm (lc nh ng nuụi cy vi khun, y vo ng eppendorf (90%) 2ml - Ly tõm 10000-13000 vũng/phỳt 4-5 phỳt thu ly t bo, b mụi trng bờn trờn, gi li cn t bo bờn di (Nu thu c t bo ớt thỡ thu v ly tõm ln) - Thờm 250àl dung dch P1 vo ng cú cha cn t bo ho tan cn, dựng pipet hỳt nh nhng lờn xung vi ln cho phn cn u dung dch - Thờm 250àl dung dch P2 vo ng eppendorf trờn ly gii t bo, lc ton b ng vi ln, nhit phũng 3-4 phỳt (khụng quỏ phỳt) - Thờm 350àl dung dch N3, trn ton b ng bng cỏch lc xuụi ngc ng vi ln, ly tõm 13000 vũng/phỳt 10 phỳt Lp cn kt ta mu trng bỏm dc theo thnh ng gm cỏc thnh phn hu hỡnh t bo, cỏc loi mui vụ c v nhiu thnh phn khỏc ADN ca plasmid tỏi t hp cú phn dch trờn - Chuyn ton b phn dch bờn trờn (khong 800àl) lờn trờn mng ca ct lc t ng hng (collection tube) Khi chuyn khụng c ng n cn ta mu trng bỏm dc theo thnh ng - Ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, b dch di Khi ly tõm, ADN ca plasmid tỏi t hp mang in tớch õm c gi li mng lc theo c ch liờn kt tớch in - Thờm 500 àl dung dch PB lờn trờn mng lc mng lc cú ADN ca plasmid - Ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, b phn di - Thờm 750àl dung dch PE lờn trờn mng lc tip tc mng lc - Ly tõm 13000 vũng/phỳt phỳt, b phn di - Ly tõm tip 13000 vũng/phỳt phỳt cho mng cha ADN ca plasmid tỏi t hp tht khụ, b phn di.Chuyn ct lc sang ng eppendorf mi - Thờm 50àl dung dch EB lờn trờn mng lc, nhit phũng 3-4 phỳt - Ly tõm 13000 vũng/phỳt 1-2 phỳt ADN ca plasmid tỏi t hp s thụi cựng vi dung dch EB v chỳng ta thu c ADN ca plasmid tỏi t hp 2.10 Kim tra ADN tỏi t hp ADN ngoi lai l sn phm PCR c dũng hoỏ vo plasmid (vect) pCR2.1 v s c chuyn np, nhõn lờn t bo E coli Plasmid pCR2.1 ca hóng invitrogen cú di l 3,9kb Ti hai u ca vựng tip nhn ADN ngoi lai, ngi ta b trớ hai im ct ca enzyme gii hn EcoRI (GAATTC), vy ct ADN ca plasmid tỏi t hp bng enzyme Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 31 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th ny chỳng ta s cú on ADN: on cú di 3,9kb ca chớnh ADN plasmid, cũn on s cho di tng ng vi sn phm PCR hin th vi cỏc bng mu sỏng trng (vi iu kin chui ADN ca PCR khụng cú im ct khỏc ca E.coRI) Nu ú cú mt hay vi im ct EcoRI thỡ di ca PCR c kim tra s bng tng s bng cng li Sau tỏch c ADN plasmid tỏi t hp, dựng enzyme ct hn ch EcoRI ct ADN plasmid bng cỏch ADN plasmid vi enzyme ny 370C gi Sau ú kim tra li ADN ó c ct trờn gel agarose 1% v kim tra di ca cỏc bng thu c Thnh phn ct ADN plasmid tỏi t hp: + ADN plasmid: 1l + Enzmye EcoRI: 1l 2l + Buffer 10x ca EcoRI: + Nc tinh khit: 16l Tng s: 20l 2.11 Gii trỡnh trỡnh t v x lý s liu C s lý thuyt: Gii trỡnh trỡnh t ADN (DNA sequencing) l quỏ trỡnh xỏc lp v thu nhn thnh phn nucleotit ca cỏc phõn on ADN cn nghiờn cu ú l mt phng phỏp n gin kt hp ba bc ca mt phn ng gm: bung liờn kt, bỏm mi v tng hp si n nucleotit Chui ADN cui cựng thu nhn c bao gi cng c xỏc nh theo chiu Mi mt ln gii trỡnh trỡnh t, chui thụ (chui cú thnh phn ADN ban u cha c x lý) cú di khong vi trm n vi nghỡn nucleotit thụng thng l 500-700 nucleotit, nu gii trỡnh c thc hin trờn mỏy gii trỡnh t ng (automated sequencer) loi hin i nht hin (ABI-377 Avant Genetic Analyzer ca hóng Perkin-Elmer) Thnh phn chy PCR sequence + Big-Dye: 1l + Primer (1pmol): 1,6l + Temple: 1,5l + Nc tinh khit: 5,9l 10l + Enhancer 1x: 10l 20l Tng s: Tinh sch sn phm PCR seq - Lc u ct tinh sch, xoay nh np (~1/2 vũng), b uụi, lp vo tube 2ml - Ly tõm 2800 vũng/phỳt 3,5 phỳt, b dch di, chuyn ct DyeEx vo ng eppendorf 1,5ml Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 32 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th - Chuyn mu ó chy PCR seq (~20l) vo chớnh gia ct theo chiu vỏc ca ct Dye-Ex - Ly tõm 2800 vũng/phỳt 3,5 phỳt Thu c sn phm PCR seq tinh sch di Chuyn sang ng eppendorf 0,5ml Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 33 Tiu lun: Giỏm nh bnh sỏn lỏ gan nh Opisthorchis viverrini bng ch th di truyn gen nad3 ca h gen ty th MC LC M U Chng 1: TNG QUAN V SN L GAN V H GEN TY TH 1.1 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh Vit Nam v trờn th gii 1.1.1 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh trờn th gii 1.1.2 Tỡnh hỡnh bnh sỏn lỏ gan nh Vit Nam 1.2 Gii thiu s lc v h gen ty th 1.2.1 Mt s khỏi nim c bn 1.2.2 Ty th v h gen ty th 1.2.3 Gen nad3 (nicotinamide dehydrogenase) 1.3 Tm quan trng ca vic nghiờn cu bnh sỏn lỏ gan nh bng phng phỏp sinh hc phõn t 1.3.1 Gii thiu chung 1.3.2 Tm quan trng ca vic nghiờn cu bnh sỏn lỏ gan nh bng phng phỏp sinh hc phõn t Chng 2: NGUYấN, VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 2.1 Nguyờn liu v phng phỏp thu nhn mu 2.2 Vt liu 2.3 Phng phỏp nghiờn cu (cú ph lc chi tit) Chng 3: KT QU 10 KT LUN 16 TI LIU THAM KHO 17 PH LC 20 MC LC 34 Hc viờn: Trn Hunh Hi Yn Lp: K29.CSH.DN ngnh Cụng ngh sinh hc 34