tóm tắt luận án nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thuộc chi bách bộ (stemona) mọc ở lào

Cây Bách Bộ thuộc loại cây bụi, mọc hoang ở các vùng đồng bằngNam Bộ Việt Nam, Lào, Đông Bắc Thái Lan, là một loài cây thuốc quí.Theo kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ Lào, người ta đã sử dụ

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Khoa học kĩ thuật càng phát triển, đời sống con người ngày càngđược cải thiện Tuy nhiên sự phát triển quá nóng đã dẫn đến sự ô nhiễmmôi trường; nhiều chứng bệnh nan y mới phát sinh, nhiều loài vi khuẩnmới, nhờn thuốc xuất hiện nguy cơ gây ra những đại dịch đe dọa toàncầu Các dược phẩm chữa trị bệnh nan y hiện nay còn rất hạn chế về chủngloại, giá thành cao và thường có các tác động phụ không mong muốn, gâytổn hại cho các tế bào lành Điều này thôi thúc các nhà khoa học khôngngừng nghiên cứu tìm ra các dược phẩm mới, hiệu quả hơn, an toàn hơn,trong đó ưu tiên nghiên cứu các hoạt chất từ tự nhiên

Cây Bách Bộ thuộc loại cây bụi, mọc hoang ở các vùng đồng bằngNam Bộ Việt Nam, Lào, Đông Bắc Thái Lan, là một loài cây thuốc quí.Theo kinh nghiệm dân gian ở Nam bộ Lào, người ta đã sử dụng phần củcủa cây Bách Bộ để làm thuốc chữa nhiều loại bệnh có hiệu quả như: cácbệnh về da, ung thư gan… ngoài ra củ Bách Bộ còn có khả năng làm thuốcdiệt sâu bọ, mối mọt… Việc nghiên cứu về cây Bách Bộ ở Lào còn rất hạnchế: phần lớn chỉ dùng ở mức nghiên cứu phân loài thực vật mà thôi; chưa

có bất kỳ công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học, hoạt tính sinhhọc của cây Bách bộ Lào Vì những lý do trên đây, trong khuôn khổ Luận

án tiến sĩ hóa học này, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài thuộc chi Bách Bộ (Stemona) mọc ở Lào”.

2 Các đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của luận án gồm củ của ba loài thuộc chi Bách

Bộ thu hái tại Lào, gồm củ Bách Bộ thân đứng S.cochinchinensis, Bách Bộ

lá nhỏ S.pierrei, Bách Bộ thân leo S.tuberosa.

3. Những đóng góp mới của luận án

a Lần đầu tiên từ củ Bách Bộ thân đứng (S cochinchinensis) thu hái tại

tỉnh Savannakhet (Lào), đã phân lập và xác định cấu trúc của 12 hợpchất, trong đó có 1 chất mới là 1-(3-hydroxy-2-metoxyphenyl)-2-(3’-

hydroxy-5’-metoxy-2’,4’-đimetylphenyl)etan (K8), còn lại là 11 chất đã

biết gồm β-sitosterol (K1), Sesamin (K2), 3 cinnamat (K3, K4, K6), 1

dẫn xuất bibenzyl (K5), 2 stilbenoit (K7, K9), Pinoresinol (K10) và 2 ancaloit (K11, K12).

b Lần đầu tiên từ củ Bách Bộ lá nhỏ (S pierrei) thu hái tại tỉnh Savannakhet

(Lào), đã phân lập và xác định cấu trúc của 7 hợp chất, trong đó có 2 chất

mới, Stemobenzofuran A (K13), metyl metoxyphenyl)propylat (K18)., còn lại là 5 hợp chất đã biết là Sesamin

1’-hydroxy-1’-(4-hydroxy-3-1

(K2), Stemanthren B (K14), Syrigaresinol (K15), 2 Axit thơm (K16, K17).

c Lần đầu tiên từ củ Bách Bộ thân leo (S tuberosa) thu hái tại tỉnh Attapu

(Lào), đã phân lập và xác định được cấu trúc của 6 hợp chất Tất cả 6 chất

này đều là chất mới, bao gồm: Stemophenanthren A-D (K19-K22), Stemostemanthren E (K23) và Stemobenzofuran B (K24).

d Lần đầu tiên từ đã thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hợp chất tinhsạch phân lập từ 3 loài Bách Bộ của Lào Kết quả nghiên cứu cho thấy 3

chất K21, K22 và K23 có hoạt tính kháng sinh, gây độc 4 bốn dòng tế

bào ung thư ở mức độ khá (IC50 từ 4,49 đến 63,65 µg/ml), 5 chất K7, K8, K9, K19 và K20 gây độc tế bào ung thư KB ở mức trung bình (IC50=20,67-82,30 µg/ml)

4 Bố cục của luận án

Luận án gồm 140 trang với 31 bảng số liệu, 71 hình, 6 sơ đồ, 101 tàiliệu tham khảo (9 tiếng Việt, 92 tiếng Anh) Bố cục luận án: Mở đầu (2trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (25 trang), Chương 2: Nguyên liệu vàcác phương pháp nghiên cứu (6 trang), Chương : Thực nghiệm (20 trang),Chương 4: Kết quả và thảo luận (77 trang), Kết luận (2 trang)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung về họ Bách Bộ Stemonaceae

1.1.1 Phân loại Bách Bộ

Họ Bách Bộ (Stemonaceae) thuộc bộ Dứa dại (Pandanales), lớp thực vật một lá mầm (Monocosts) ngành hạt kín (Angiosperms) [1,3,4, 51] Bách Bộ được chia thành bốn chi là Croomia Torr., Stemona Lour., Stichoneuron Hook F và Pentastemona Steenis Trong đó, chi Stemona là lớn nhất với trên 30 loài, chi Pentastemona có thể là một chi thuộc họ

Bách Bộ hoặc có thể xếp thành một họ riêng [7,9] Các loài Bách Bộ phân

bố rải rác khắp các châu lục, nhưng chủ yếu là ở các vùng trung du, miềnnúi các vùng có khí hậu nhiệt đới, nóng ẩm như Trung Quốc, Việt Nam,Lào, Campuchia, Thái Lan … [16,24] Dưới đây là một số khóa phân loạithực vật của họ Bách Bộ đã được công bố

Bảng 1.1: Bảng phân loài Thực vật chi Croomia WCSP (Word Checklist of

Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Croomia heterosepala (Baker) Okuyama

2 Croomia Japonica Miq.

3 Croomia pauciflora (Nutt.) Torr.

Bảng 1.2: Bảng phân loài thực vật chi Stichoneuron Hook F theo WCSP (Word

Checklist of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

Bảng 1.3: Bảng phân loài thực vật chi Pentastemona theo WCSP (Word Checklist

of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Pentastemona egregia (Schott) Steenis

2 Pentastemona sumatrana Steenis

Bảng 1.4: Bảng phân loài thực vật chi Stemona.Lour theo WCSP (Word Checklist

of Selected Plant family) đến ngày 1/1/2011

1 Stemona angusta I.R.H.Telford 2 Stemona aphylla Craib

3 Stemona australiana (Benth.)

C.H.Wright 4 Stemona burkillii Prain

5 Stemona cochinchinensis Gagnep 6 Stemona collinsiae Craib

7 Stemona curtisii Hook.f 8 Stemona griffithiana Kurz

9 Stemona hutanguriana Chuakul 10 Stemona Japonica (blume)Miq.

11 Stemona Javanica (Kunth) Engl 12 Stemona kerrii Prain

13 Stemona kurzii Prain 14 Stemona lucida (R.Br.) DuyfJes

15 Stemona mairei (H.Lév.) K.Krause 16 Stemona parviflora C.H.Wright

17 Stemona phyllantha Gagnep 18 Stemona pierrei Gagnep

19 Stemona prostrata I.R.H.Telford 20 Stemona sessilifolia (Miq.)Miq.

21 Stemona squamigera Gagnep 22 Stemona tuberosa Lour.

23 Stemona tuberosa var moluccana

(Blume) ined 24 Stemona tuberosa var tuberosa

1.1.2 Giới thiệu chi Stemona

Như đã giới thiệu, chi Stemona là chi lớn nhất trong họ Bách Bộ với

khoảng trên 30 loài Ở Việt Nam, theo tài liệu [1,6] số lượng loài Bách Bộ

trong chi Stemona được tìm thấy là 6 loài Đó là các loài Stemona

cochinchinensis Gagnep (Bách Bộ Nam Bộ), Stemona collinsiae Craib.

(Bách Bộ hoa tím), Stemona pierrei Gagnep (Bách Bộ lá nhỏ), Stemona

phyllantha Gagnep (Bách Bộ hoa trên lá), Stemona saxorum Gagnep.

(Bách Bộ đứng, Bách Bộ đá) và Stemona tuberosa Lour (Bách Bộ thân

leo) [55,71,75]

Theo các tài liệu [23,24,62] tại Lào hiện có 11 loài thuộc chi Stemona là: S tuberosa., S phyllantha Gagnep., S squamigera Gagnep., S cochinchinensis Gagnep., S pierrei Gagnep., S saxorum Gagnep., S collinsae Craib., S aphylla Craib., S burkillii Prain., S griffithiana Kurz

và S kerrii Craib Các loài này phân bố rải rác ở vùng núi miền bắc, đồng

bằng miền trung và miền nam nước Lào

3

1.1.3 Công dụng

Theo y học cổ truyền [2,5,65], Bách Bộ có vị hơi đắng ngọt, tính ôn.Thuốc có khả năng trị ho do hư lao, thường dùng trong trị lao phổi, khíquản viêm mãn tính, ho gà, nhuận phế, sát trùng, trị giun đũa, giun kim.Theo kinh nghiệm dân gian, nhân dân các bộ tộc Lào đã sử dụng toàn bộcây Bách Bộ làm thuốc giảm sốt, chữa bệnh bại liệt, tê và bệnh sẩy thaicho gia súc, làm tê liệt giun rất có hiểu quả Ngoài ra còn sử dụng làmthuốc diệt côn trùng để bảo vệ mùa màng, cây trồng

1.2 Thành phần hóa học của cây Bách Bộ

Phần lớn các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Bách Bộ đềutập trung ở phần củ Bách Bộ do phần này chiếm tỷ trọng lớn nhất so vớitoàn bộ cây và các hoạt chất chính đều tập trung tại đây Các nghiên cứutrong nước và quốc tế đều chỉ ra rằng, hoạt chất chính trong củ Bách Bộ làcác stilbenoit, stemanthren, stemofuran và các ancaloit [32,58,59,67]

1.2.1 Tình hình nghiên cứu ở Lào

Với cây Bách bộ, hầu hết các nghiên cứu ở Lào mới chỉ dừng lại ởmức đánh giá hoạt tính sinh học của các cặn chiết, chưa có tài liệu khoahọc nào công bố về thành phần hóa học của cây Bách Bộ mọc ở Lào

1.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam năm 1996 TS Vũ Ngọc Kim là người đầu tiên nghiên

cứu thành phần hóa học của 3 loài S tuberosa, S saxorum, S peirrei và đã

chiết tách, xác định cấu trúc của một alcaloit có công thức cấu phân tử là

C22H33NO4 và đặt tên chất này là Tuberostemonine L-G [9]

Trong những năm 2000, PGS.TS Phạm Hữu Điển và các cộng sự đãtập trung nghiên cứu thành phần hóa học của 4 loài Bách Bộ của Việt

Nam: S.tuberosa, S.collinsae, S.saxorum và S.cochinchinensis và đã phân

lập được trên 30 ancaloit, [47,49,51,60,62,79] Trong đó, từ loài

S.cochinchinensis, các tác giả đã phân lập được một ancaloit có cấu trúc khung mới, đặt tên là cochinchistemonine [79].

1.2.3 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Cho đến nay, ngoài một số hợp chất tự nhiên khác như gluxit (chiếm 2,3%

trọng lượng khô), lipit (0,83%), protit (9%), các axit hữu cơ [17,39,61] từ

củ Bách Bộ người ta đã phân lập và xác định được cấu trúc của trên 100ancaloit [26, 45,46] Các ancaloit từ Bách Bộ thường rất đa dạng về cấutrúc là do tính đa dạng về loài, phần khác – do điều kiện thổ nhưỡng, khíhậu ảnh hưởng rất lớn đến sự đa dạng về cấu trúc khung

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

2.1 Đối tượng và các phương pháp nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Tên khoa học của các mẫu thực vật được Thạc sĩ sinh học NguyễnThế Anh, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam giúp xác định Các mẫu tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Hóa học hợpchất thiên nhiên, Bộ môn Hóa hữu cơ, Khoa hóa học, Trường ĐHSP HàNội

Mẫu cây Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis được thu hái

tại tỉnh Savannakhet (CHDCND Lào) vào tháng 10 năm 2010, số tiêu bản

là KPN-01.2010

Hình 2.1: Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis

Mẫu cây Bách Bộ lá nhỏ Stemona pierrei được thu hái tại tỉnh

Savannakhet, CHDCND Lào vào tháng 6 năm 2011, mẫu tiêu bản sốKPN-02.2011 Tên khoa học của mẫu cây được Thạc sĩ sinh học NguyễnThế Anh, Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam xác định

5

Hình 2.2: Bách Bộ lá nhỏ Stemona pierrei

Hình 2.3: Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa

Mẫu cây Bách Bộ thân leo Stemona tuberosa được thu hái tại tỉnh

Attapu, CHDCND Lào vào tháng 7 năm 2011, mẫu tiêu bản số 03.2011 (tên khoa học của mẫu cây được TS Sinh học Nguyễn Thị Liên.Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Việt Nam giúp định

KPN-tên) 2.1.2 Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Mẫu củ cây Bách Bộ được làm sạch, thái nhỏ, phơi trong bóngmát, sấy khô ở nhiệt độ 400C, sau đó được nghiền mịn Bột mẫu củ đượcngâm chiết bằng hỗn hợp dung môi MeOH: H2O (80:20) ở nhiệt độphòng (3 lần, 24 giờ/lần) và chiết siêu âm nhiều lần (6-8 lần, 45phút/lần) Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,thu được cặn chiết metanol Sau đó cặn chiết metanol đem chiết lần lượt

với các dung môi có độ phân cực tăng dần hexan, etyl axetat,

n-butanol, cất loại dung môi áp suất giảm, thu được các cặn chiết tương ứng

2.1.3 Phương pháp phân tích, chiết tách, phân lập các chất

Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây cũng như cácphân đoạn chiết được thực hiện bằng các phương pháp sắc kí khác nhaunhư phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC), phương pháp sắc kí cột thường(CC), sắc kí cột đảo pha, sắc kí lỏng điều chế (prep HPLC)

2.1.4 Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất

Độ quay cực: đo trên máy Polartronic D (Haensch, Jasco P-2000series), điểm nóng chảy: đo trên thiết bị Boetis B-545 Các phương phápphổ: IR JASCO FT/IR-5300, NMR (1D, 2D) Brucker Avance 500 MHz,

MS, Fourier FT-ICR-MS Variance 320-MS Các thiết bị này hiện có ởTrường ĐHSP Hà Nội và Viện Hàn Lâm KHCN Việt Nam

Ngoài ra trong luận án có sử dụng đến thiết bị Phổ khối lượng phângiải cao biến đổi Furie ghi trên máy Brucker Apex III (FT-ICR-MS) đặt tạiViện Hóa sinh thực vật Leibniz, Halle, CHLB Đức Phổ tử ngoại khả kiến(Uv-vis) được đo trên thiết bị Shimadzu UV-1650PC Instrument trongMeOH đặt tại Bộ môn Hóa lý, khoa Hóa học, Trường ĐHSP Hà Nội

2.1.5 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

* Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào: Được tiến hành trên 4

dòng tế bào ung thư người, gồm tế bào ung thư biểu mô KB, tế bào ung thưphổi Lu, tế bào ung thư vú MCF-7 và tế bào ung thư cơ vân tim RD Phépthử gây độc tế bào được tiến hành trên khay 96 giếng; mẫu thử (cao chiếthay các hợp chất phân lập được từ Bách Bộ) được pha loãng ở các nồng độ

khác nhau là 128µg/ml; 32 µg/ml; 8 µg/ml; 0,5 µg/ml

* Phương pháp thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn: được tiến hành

tại Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam theo các phương phápsau: Phương pháp định lượng chất kháng sinh (CKS) bằng vi sinh vật (VSV).Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh: phương pháp đục lỗ (hay còngọi là khuyếch tán trên đĩa thạch) hoặc phương pháp MIC như đã trình bày

ở trên

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1 Củ Bách Bộ thân đứng (S cochinchinensis)

3.1.1 Chiết và phân lập các chất từ củ Bách Bộ thân đứng

3,0 Kg bột khô từ củ Bách Bộ thân đứng (Stemona cochinchinensis)

được chiết trong các dung môi hữu cơ như sơ đồ 3.1

Sơ đồ 3.1 Ngâm chiết củ Bách Bộ thân đứng Stemona cochinchinensis

Chạy cột sắc ký để phân lập các chất tinh sạch theo sơ đồ 3.2 sau:

Sơ đồ 3.2 Chiết tách các chất từ cặn n-hexane củ Bách Bộ thân đứng S.

CH2B3(K4) 7mg

CH2B2(K3) 4mg

CH2B1(K2) 9mg

CH2 1,3g

SKC / n: E/4:1

CH2B

CH2C2(K5) 9mg

HPLC/ n:E /1:1 HPLC/ n:E /2:1

CE2 165mg

SKC / n: E/1:1

CE2B 77mg

CE2B1 (K10) 7mg

CE2B2 (K11) 9mg

CE2B3 (K12) 5mg

HPLC / n:

E/3:7

Cặn EtOAc (CE:7.67g)

SKC/n:E/4:1

CE1 0,61g

CE1D1 (K9) 17mg

CE1C1 (K8) 4mg

SPD /C:M/1:1 HPLC/ n: E/3:2:1

SKC / n: E/ 3:1

CE1A

(K6) 88mg

CE1B (K7) 83mg

CE1C 181mg CE1D 72mg

3.3 Củ Bách Bộ thân leo (S tuberosa)

Sơ đồ 3.6 Phân lập các hợp chất từ cặn n-hexan củ Bách Bộ thân leo

SKC/ n: E/3:1

PH3 322mg

PH3C1 (K13) 4mg

HPLC n: E/3:2

PH1 414mg

PH1B1 (K2) 5mg

PH1B 56mg

HPLC/ n: E/3:1

PE1 657mg

PE3 325mg

PE4 233mg

SKC n:E/5:1 SKC/n:E/3:1 SKC/n:E/2:1

HPLC/n:E/1:1 HPLC/n:E/1:1

HPLC/n:E/2:1 HPLC/n:E/3:2

PE4A 43mg

PE3B 53mg

PE1B

83mg PE1D 69mg

PE4A2 (K18) 5mg

PE3B2 (K17) 5mg

PE3B1 (K16) 3mg

PE1D2 (K12) 6mg

PE1D3 (K15) 7mg

PE1D1 (K11) 7mg

PE1B1

(K14)

7mg

PE1B2 (K7) 5mg

Cặn EtOAc (PE: 6.67g)

SKC n:E/ 6:1

TH5 0.78g

SKC/n:E/3:2

HPLC/n:E/1:1

TH5B 57mg

TH5B4 (K24) 9mg

TH5B1 3mg

TH2 1.27g

TH2C 97mg

TH2C4 (K22) 12mg

TH2C5 (K23) 5mg

TH2C3 (K21) 6mg

Cặn n-hexan (TH:14.76g)

SKC/ n:E/ 10:1

3.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học

21 Chất được thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn; 8 chất được thửkhả năng gây độc 4 dòng tế bào ung thư Kết quả được chỉ ra ở Bảng 4.18

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

K1 là chất kết tinh màu trắng, hình kim, tan tốt trong clorofom,

n-hexan Dựa vào phổ 1H NMR (hình 4.1) chúng tôi xác định được K1 là

β-sitosterol,một trong số các sterol rất phổ biến trong giới thực vật

Hình 4.1: Phổ 1H NMR của chất K1 trong CDCl3

 K2 (Sesamin):

Phổ NMR của K2 được đưa ra ở hình 4.2 và bảng 4.1

Hình 4.2 Phổ 1H và 13C NMR của K2 đo trong CDCl3

K2 xác định được là Sesamin, hợp chất này trước đây đã được phân

1

3 1' 2' 4'

Hình 3.3 Phổ 1H NMR của K3 đo trong CDCl3

7' 9

1 O O

O

O 1' 2' 8

2 6

6' 4'

4

3 1' 3' 5'

Hình 4.5 Phổ 1H NMR của K5 đo trong CDCl3

Hình 4.7 Phổ 1H và 13C NMR của K7 đo trong CDCl3

Phổ NMR của K9 được chỉ ra trên hình 4.8.và bảng 4.4

3 1' 3' 5'

H3CO HO

CH3OH

CH3

H3CO

1" 2"

1 2

4

1' 2'

4'

Hình 4.8 Phổ 1H và 13C NMR của K9 đo trong CDCl3

1

4 5

1" 2"

1' 4' 6'

H3CO

CH3

H3CO

OCH 3 OH

CH 3 OH

CH 3 OCH 3