Đề cương công nghệ sinh học

Đề cương công nghệ sinh học

ĐỀ CƯƠNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẦN I CÁC KỸ THUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

Câu 1 Khái niệm về Enzym giới hạn? Cách đặt tên, kiểu cắt, tần suất cắt? Ứng

dụng của Enzym giới hạn trong công nghệ gen?

Trả lời

1 Khái niệm Enzym giới hạn (Restriction enzym) – RE

- Là enzym chỉ cắt ADN tại những trình tự đặc hiệu (vị trí nhất định) do chúng chỉnhận biết được 1 trình tự đặc trưng và cắt trình tự đó tại 1 điểm cố định

- Các RE có vị trí cắt rất đặc hiệu nhưng lại không đặc hiệu về loài nghĩa là chúng

có khả năng cắt bất kỳ loại ADN nào tách chiết từ các nguồn khác nhau

2 Cách đặt tên (cho RE loại II: loại phổ biến nhất hiện nay)

Tên gọi của các RE được quốc tế quy định:

- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tiên trong tên chi vi khuẩn mà từ đó RE được pháthiện

- Tiếp theo là 2 chữ đầu của tên loài không viết hoa

- Sau đó là một chữ viết hoa chỉ tên chủng

- Cuối cùng là chữ số La Mã chỉ thứ tự RE được phát hiện

3 Kiểu cắt (cho RE loại II)

4 Tần suất cắt (cho RE loại II)

Giả thiết sự sắp xếp của các bazo là ngẫu nhiên thì xác suất để 1 đoạn trình tựđược nhận biết là 1/4n (n là số nu của chuỗi được nhận biết)

Như vậy chuỗi trình tự càng ngắn bao nhiêu thì xác suất nó tình cờ xuất hiệntrong 1 đoạn ADN càng lớn bấy nhiêu

Vd: Đoạn cần nhận biết có 4 nu thì cứ 44 = 256 cặp bazo sẽ gặp lại đoạn đó 1 lần

5 Ứng dụng (cho RE loại II)

Điều quan trọng của các RE kiểu II là tác động của nó không bị sai lệch Khimột mẫu ADN được xử lý bằng một trong những RE này thì toàn bộ các điểm nhậnbiết đều bị cắt Như vậy có thể xây dựng các bản đồ giới hạn của ADN cho các RE khicho ADN bị cắt bởi từng RE riêng lẻ cũng như tổ hợp của các RE này

Bằng cách này có thể thiết lập được các bản đồ giới hạn cho các phân tử ADNkhác nhau

Câu 2 Vector nhân dòng là gì? Nêu tiêu chuẩn của 1 vector nhân dòng? Trình bàycấu trúc di truyền và nguyên tắc chọn lọc của vector plasmid sử dụng trong công

nghệ gen?

Trả lời

1 Khái niệm vector nhân dòng

Sau khi tách chiết ADN, cắt chúng bởi các E giới hạn thì công đoạn quan trọngtiếp theo là nhân bản các đoạn ADN đã cắt thành nhiều bản đồng nhất và sắp xếpchúng thành từng dòng riêng Quá trình này gọi là tách dòng gen hoặc nhân dòng

gen

Trong thực tế các đoạn ADN lạ không thể tự duy trì và nhân bản trong tế bào chủnếu như nó được chuyển vào TB mới chỉ ở dạng 1 đoạn ADN đơn Các đoạn ADNmuốn tái bản trong TB chủ mới cần phải được gắn vào 1 vector nhân dòng

Vector nhân dòng thực chất là 1 phân tử ADN có gốc tái bản và có thể nhân lên trong TB chủ đã chọn

2 Tiêu chuẩn của 1 vector nhân dòng

- ADN của vector nhân dòng lý tưởng là chỉ có một điểm nhận biết một RE

nào đó Nếu địa điểm này >1 thì sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này.

- Tất cả vector nhân dòng phải có một hay nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc nhưtính kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu => Nhận biết, chọn lọcđược những tế bào đã nhận được vecto nhân dòng

- Các vector nhân dòng phải có ít nhất một điểm tái bản, để đảm bảo chúng cóthể tự nhân lên trong tế bào chủ mới.

3 Cấu trúc di truyền

- Là các phân tử ADN nhỏ, mạch vòng, nằm ngoài NST của TB vi khuẩn và cókhả năng tự nhân bản do có chứa 1 trình tự như 1 gốc tái bản ADN

- Thường chứa 1 số gen có tính đặc thù rất cao

+ Một số mang thông tin về giới tính và có thể chuyển từ TB này → TBkhác qua tiếp hợp

+ Một số mang đặc tính chống chịu với kháng sinh

+ Một số có gen đặc hiệu có khả năng sử dụng các chất trao đổi bất thường+ Một số không mang gen mã hóa bất kỳ chức năng nào

- Kích thước plasmid dao động từ 1→vài trăm kb

4 nguyên tắc chọn lọc của vector plasmid

Câu 3 Nhân dòng gen (Cloning gen) là gì ? Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen

bằng vector plasmid?

Trả lời

1 Khái niệm nhân dòng gen

Sau khi tách chiết ADN, cắt chúng bởi các E giới hạn thì công đoạn quan trọngtiếp theo là nhân bản các đoạn ADN đã cắt thành nhiều bản đồng nhất và sắp xếpchúng thành từng dòng riêng Quá trình này gọi là tách dòng gen hoặc nhân dòng gen

2 Trình bày kỹ thuật nhân dòng gen bằng vector plasmid

 Chọn plasmid : thường dùng pUC có các đặc tính sau :

+ Chứa đoạn gen kháng kháng sinh (ampicillin)+ Chứa đoạn gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen này mã hóa cho

β galactosidase, enzym này + X - gal sẽ cho màu xanh)

 Cắt pUC = RE cùng loại đã cắt ADN

 Trộn các đoạn ADN + plasmid theo tỷ lệ thích hợp

 Ủ hỗn hợp trên : 10 – 150C trong 6h với E ligase

 Xử lý vỏ ngoài vi khuẩn = CaCl2 nhằm tăng hoạt tính tiếp nhận plasmid

 Tạo hỗn hợp VK + plasmid đã gắn ADN trong điều kiện lạnh

 Đưa hỗn hợp trên vào 400C trong 90s: sự phân chia TB xảy ra, plasmid sẽ

tự tiếp xúc với các TB VK

 Ngay lập tức đưa hỗn hợp vào lạnh, sốc lạnh sẽ khiên cho plasmid đi vào

và cố định trong TB VK

 Chuyển hỗn hợp này vào đĩa petri (đĩa petri có chứa môi trường nuôi cấy

VK + bổ sung chất kháng sinh + cơ chất cho phản ứng tạo màu) ủ 1 đêm ở

370C

Nguyên tắc chọn khuẩn lạc VK có chứa ADN đã chuyển

 VK có chứa plasmid đã chuyển nạp thì mới tồn tại được trên môi trường vàsinh khuẩn lạc

 Mặt khác, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu là vùng bị cắt để gắn ADNngoại vào

Khuẩn lạc có màu xanh là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn ADN lạ

Khuẩn lạc có màu trắng là khuẩn lạc có chứa đoạn ADN lạ được ghép vào Do

đó cần tách lấy khuẩn lạc màu trắng và lưu giữ chúng riêng rẽ

Câu 4 Trình bày phương pháp lai Southern Blot?

Trả lời

1 Khái niệm

- Được Edwin Southern đề xuất năm 1975

- Cho phép xác định sự có mặt của những trình tự nu/ 1 đoạn ADN trong một hỗnhợp các đoạn ADN khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò (ADN mẫu dò)

đã được đánh dấu P32 với đoạn ADN có chứa trình tự bổ sung với mẫu đó

2 Các bước trong Southern Blot: bao gồm 7 bước

 Bước 1: Chiết tách ADN, cắt ADN => thu được hỗn hợp các đoạn cắt AND

khác nhau

điện thế 1,5V/cm chiều dài gel

= cách xử lý gel điện di 20ph trong NaOH 0,4M

lọc (màng lai) Tấm lọc này sẽ giữ chặt các đoạn ADN được chuyển lên Quátrình này được thực hiện với dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,4M

đánh dấu (P32 hoặc chất gây phản ứng màu), thực hiện ở buồng lai (65 - 680Ctrong 6 – 12h)

không tham gia phản ứng lai

 Bước 7: Phát hiện vị trí lai nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi Nơi xảy ra phản

ứng sẽ mang hoạt tính phóng xạ Khi đặt phim lên tấm lọc, nơi có phản ứng lai

sẽ phát xạ vào phim, tráng phim thu được các vết đen tại nơi phát xạ chính làđịa điểm lai

Câu 5 Trình bày kỹ thuật RFLP và ứng dụng?

Trả lời

1 Kỹ thuật RFLP

Khi cắt ADN nhân bằng các RE sẽ sản sinh ra hàng triệu đoạn cắt xếp liên tụccạnh nhau theo kích thước khi điện di Nếu như đưa các đoạn này lên điện di rồinhuộm màu và xem xét dưới ánh sáng tử ngoại, con người không thể quan sát thấy sựphân cách giữa các đoạn cắt

Để giải quyết vấn đề này, người ta không thể so sánh sự sai khác của toàn bộ

đoạn cắt mà chỉ so sánh sự sai khác về một trình tự nu bất kỳ nào đó trên các băng điện di

Một đoạn ADN nào đó lấy từ thư viện mẫu đã nhân dòng sẽ được sử dụng làmmẫu dò để phát hiện ra trình tự nu tương ứng trên các băng điện di

Tiến hành phản ứng Southern Blot (trình bày phản ứng này đã nói ở câu 4)

So sánh sự hiện diện của các vị trí lai sẽ phát hiện được tính đa hình của cácđoạn cắt

2 Ứng dụng

 Phát hiện được sự có mặt của gen cần tìm trong hệ gen sinh vật nghiên cứu

 Phát hiện được sự đa dạng ADN của các cá thể khác nhau

 Phát hiện các đột biến

 Phát hiện các thể lai soma qua dung hợp TB trần

 Lập bản đồ giới hạn của một gen



Câu 6 Phương pháp xác định trình tự nu của ADN? Cho ví dụ minh họa?

Trả lời

1 Phương pháp Maxam Gilbert

Dựa trên phân giải hóa học: Sử dụng hóa chất để phân hủy ADN tại vị trí các

bazơ nitơ khác nhau → các đoạn có chiều dài khác nhau 1 nu

Các bước tiến hành:

 Bước 2: Đánh dấu phóng xạ P32 tại đầu 5’

 Bước 3: Chia các sợi đơn thành 4 mẫu riêng rẽ và xử lý với hóa chất đặc hiệu đểphá hủy 1 hoặc 2 trong 4 loại bazơ (tức là thay đổi trật tự gốc phosphat)

 Bước 4: Xử lý tiếp các mẫu này với piperillin để bẻ gãy ADN tại các bazơ đã bị phá hủy

 Bước 5: Điện di riêng rẽ 4 mẫu này Khi đó sự phân bố các đoạn này trên điện di

đồ tương ứng với kích thước của chúng có chiều dài hơn kém nhau 1 nu

 Bước 6: Đưa gel hiện hình rồi đọc các băng hình trên phim để xác định trình tự sợi đơn ADN

Đọc tiếp mạch bổ sung còn lại

2 Phương pháp Sanger (phương pháp enzym)

Dựa vào hoạt động của enzym ADN polymerase (xúc tác để gắn các đoạn

ADN chỉ chênh lệch nhau 1 nu)

- Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quátrình kéo dài ADN khi tổng hợp Nhân tố này là các 2,3 didesoxynucleotit

triphosphat (ddNTP)

+ Các phân tử này có thể kết hợp vào chuỗi ADN đang tổng hợp bìnhthường nhưng không kết hợp được với phân tử desoxynucleotit

triphosphat (dNTP) tiếp theo

+ Khi trộn lẫn lượng nhỏ ddNTP với 4 loại dNTP rồi tiến hành tổng hợpnhờ enzym ADN polymerase → cho một loạt các đoạn ADN được kếtthúc 1 cách đặc hiệu bởi gốc ddNTP

- Tiến hành thí nghiệm tương tự cho 4 phản ứng tổng hợp ADN tách rời, mỗiphản ứng bổ sung 1 loại ddNTP khác nhau → các đoạn ADN kết thúc bằnggốc ddNTP và hơn kém nhau 1 nu

- Chạy điện di các đoạn này rồi hiện hình chúng → Ta có thể xác định trình tựchuỗi ADN

3 Giải trình tự gen bằng phương pháp tự động

- Nguyên tắc chung của máy là giải trình gen tự động là dựa theo cơ sở của

phương pháp Sanger

- Quá trình tổng hợp được thực hiện nhờ máy PRC có các hóa chất tiêu chuẩn vàphần mềm xử lý số liệu

- Máy đọc trình tự trên cả 2 mạch đơn nên kết quả rất chính xác

Câu 7 Trình bày kỹ thuật PCR và ứng dụng?

Trả lời Nêu được các ý sau :

 Kỹ thuật PCR : Khái niệm, nguyên tắc, chu trình (sơ đồ), yêu cầu cần thiết, yếu tố ảnh hưởng

sợi đơn mới (65 – 75Tổng hợp các sợi ADN0 C, 2 - 5ph

Gắn mồi vào các sợi đơn (30 - 65 0 C, 30s) Biến tính mẫu ADN thành các sợi

đơn (94 0 C trong 5ph)

Một chu trình gồm khoảng 30 – 35 chu kỳ là đủ, nếu kéo dài thêm chu kỳ khôngnhững số sản phẩm tăng không đáng kể mà tăng thêm cả sự sai sót.

- 2 mồi phải có trình tự bổ sung với 2 đầu của đoạn ADN cần nhân dòng (mốixuôi và mồi ngược)

- Khoảng cách giữa 2 mồi này không quá 1kb để tránh hiện tượng bắt cặp giữacác mồi

- Các mồi có kích thước ít khác nhau

- Giúp tách nhanh và chính xác từng gen hoặc từng đoạn ADN riêng biệt

- Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quantrọng

- Chẩn đoán nhanh, nhạy, chính xác các bệnh di truyền

- Giúp xác định giới tính của động vật và người ở giai đoạn phôi thai sớm

- Khôi phục các gen của các loài sinh vật cổ xưa

- Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, thủ phạm hình sự

Câu 8 Kỹ thuật RAPD: nguyên lý và ứng dụng?

Trả lời

1 Nguyên lý

- Phương pháp RAPD thực chất là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng

kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này sẽ

bắt cặp một cách ngẫu nhiên vào ADN ở bất kỳ vị trí nào mà tại đó có trình tự

bổ sung với nó

- Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nu thì xác suất bắt gặp 1 trình tự bổsung với nó trong mạch ADN (được cấu tạo từ 4 nu) là 1/410 = 1/ 1.048.576

- Giả sử một bộ gen đơn bội của lúa có kích thước 550.000 Kb = 550.000.000

bp, vậy khả năng mồi ngẫu nhiên (gồm 10 nu) có thể có 550.000.000/1.048.576 = 524 vị trí bắt cặp

- Do mồi gắn với ADN ở 2 điểm khác nhau trên các sợi đơn đối diện của ADNkhuôn nên sẽ có 262 đoạn ADN khác nhau được nhân Như thế số băng điện disản phẩm PCR rất phong phú

quá trình sao chép ngược cADN được thu thập và lưu giữ trong các ngân hàng cADN

Kỹ thuật tạo thư viện mẫu cADN

chỉ chứa desoxythimidin (Oligo dT) Gồm các công đoạn sau :

 Chiết xuất toàn bộ ARN của TB gồm : mARN, tARN, rARN

 Cho hỗn hợp này đi qua phễu chiết gắn xenlulo – oligo dT

 Các mARN sẽ bị giữ lại trong phễu do hình thành liên kết A – T

 Dùng dung dịch NaCl để đẩy tARN + rARN ra khỏi phễu

Tách riêng được mARN

chảy qua phễu, các mARN sẽ được giải phóng do liên kết A – T bị phân giải

 Bước 3 - Dùng các mARN này làm khuôn với sự có mặt của Enzym sao chépngược + các nguyên liệu → Quá trình tổng hợp ADN xảy ra

=> Thu được các cADN

 Bước 4 - Các cADN sẽ tiếp tục được nhân dòng và tập hợp thành các thư việncADN Để tìm ra các cADN cần thiết, người ta có thể sử dụng các phươngpháp lai ADN hoặc phản ứng với protein kháng thể

PHẦN II CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

Câu 1 Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ? Khả năng ứng dụng củanuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân và chọn tạo giống cây trồng ?

Trả lời

1 Định nghĩa về công nghệ nuôi cấy mô TBTV

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉchung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật

trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng.

Bao gồm :

 Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành

 Nuôi cấy cơ quan : rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh

 Nuôi cấy phôi : phôi non và phôi trưởng thành

 Nuôi cấy mô sẹo (callus)

 Nuôi cấy TB đơn

 Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong TBTV sau khi tách vỏ (nuôicấy TB trần)

2 Khả năng ứng dụng

Khả năng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác nhân vàchọn tạo giống cây trồng được thể hiện qua bảng dưới đây

Bộ phận nuôi cấy Mục đích

Đỉnh chồi (Đỉnh sinh trưởng)

- Tạo và nhân nhanh dòng đồng nhất về di truyền

- Làm sạch virus

- Nghiên cứu sinh lý phát triển Hoa cái

(Bầu quả, noãn)

- Thụ phấn trong ống nghiệm phục vụ lai xa

- Tạo đơn bội

- Tạo đa phôi Hoa đực

(Bao phấn và hạt phấn)

- Tạo mô sẹo và cây đơn bội

- Tạo đột biên ở mức đơn bội

- tạo dòng đồng hợp tử Phôi

- Nuôi cấy phôi khi lai xa

- Nhân các dòng lai xa

- Phá ngủ nghỉ của hạt

Mô sẹo

- Tạo phôi vô tính

- Nuôi cấy TB đơn và tách TB trần

- Tạo cây có biến dị soma

Tế bào

- Tạo đột biến ở mức độ TB

- Tạo TB trần để lai vô tính

- Biến nạp gen

- Nuôi cấy TB đơn

Câu 2 Cơ sở của nuôi cấy TBTV? Phân tích tác động của môi trường đến sự

phát sinh hình thái của mô nuôi cấy?

Trả lời

1 Cơ sở của nuôi cấy TBTV

Cơ sở khoa học là:

+ Tính toàn năng của tế bào

+ Tính phân hóa và phản phân hóa

1.1 Tính toàn năng của tế bào.

 Haberland (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng: mỗi một tế bào bất kỳ của một

cơ thể sinh vật đa bào đều có tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoànchỉnh

 Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền

cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó

 Vì vậy trong một điều kiện nhất định, một tế bào bất kỳ đều có thể phát triểnthành một cá thể hoàn chỉnh Đó chính là tính toàn năng của tế bào

1.2 Sự phân hóa và phản phân hóa

 Sự phân hóa của tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phôi sinh thành các tế

bào của các mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau VD: Mô dậulàm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ,

 Quá trình phân hóa có thể biểu thị:

Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào chuyên hóa

 Tuy nhiên các tế bào khi đã được phân hóa thành các mô riêng biệt với cácchức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào Đó chính là sự phản phân hóa của tế bào.

Sơ đồ thể hiện sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào:

 Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chếcác gen Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúcphân tử AND của mỗi tế bào khiến quá trinh sinh trưởng phát triển của cơ thểthực vật luôn được hài hòa

 Mặt khác khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô

sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa gen của tế bào

2 Phân tích tác động của môi trường nuôi cấy đến sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy bao gồm nhiều thành phần có tác động rất lớn đến sựsinh trưởng phát triển của mô nuôi cấy trong đó sự tác động của các chất điềutiết sinh trưởng có ý nghĩa quan trọng quyết định đến sự phát sinh hình thái

mô nuôi cấy

- Hai nhóm cơ bản trong chất điều tiết sinh trưởng là auxin và cytokinin Khi

tỷ lệ auxin/cytokinin thay đổi sẽ tác động rõ rệt lên hình thái của mô nuôicấy Cụ thể như:

> 1 → Phát sinh rễ Cytokinin Auxin < 1 → Phát sinh chồi

~ 1 → Mô sẹo (callus)

Phân hóa tế bào

Tế bào chuyên hóa

Phản phân hóa tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn