Nhập môn công nghệ sinh học 2

Nhập môn công nghệ sinh học

Chương 2

Công nghệ DNA tái tổ hợp

I Mở đầu

Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ

sự phát triển của các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh học ở mức độ phân tử Từ đó, cho phép phân lập, phân tích và thao tác trên các nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế các loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen

Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong những năm đầu 1970 là sự phát triển then chốt (key development) không chỉ cho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình mà ngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning) Phương thức tạo dòng này đã báo hiệu một kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích và khai thác các phân tử nucleic acid

Tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp những hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động của gen Từ những ứng dụng đầu tiên của chúng, các phương pháp xây dựng thư viện gen (gene library) được hình thành và phát triển, và hiện nay được xem như là nền tảng cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân

tử Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) để khuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh hơn nhưng trong nhiều trường hợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn còn hữu ích và là một yêu cầu tuyệt đối Những phần dưới đây cung cấp một bức tranh tổng quát về các quá trình cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp

II Phân lập đoạn DNA/gen

Một số phương pháp phân lập gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã được sử dụng là:

1 Tách các đoạn DNA từ genome

Phương pháp này được thực hiện như sau: DNA hệ gen (genomic DNA) của một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) bằng enzyme hạn chế rồi gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library)

Thông thư

-

(clone)

(physical mapping)

2 Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA

Đoạn DNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA được gọi là

Sợi đ

3 Phân lập đoạn DNA bằng phương pháp PCR

Ngoài hai phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng rất phổ biến phương pháp PCR để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của

sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó Phương pháp PCR đơn giản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao

2.1.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu một bư

các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA)

AAAAAA 3’ mRNA

AAAAAA 3’ mRNA TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất

Biến tính nhiệt và xử lý RNase H để phá hủy sợi mRNA

Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất trên khuôn mẫu mRNA

Mô (ví dụ: não)

Sinh tan tế bào

và tinh sạch mRNA

in vitro đ

20 nucleotide

▪ Nguyên tắc của PCR

Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở

vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus

tide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn DNA nhất

, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng P

-5’

Nguyên tắc của PCR được trình

đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác định Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thu

- , qua đó từ 10-6

g DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1

PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:

phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn (single strands) Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó)

gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ

) và trên các đ đôi đó (khuôn mẫu và primer) enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu

Hình 2.2 Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’ 3’ Các primer

có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá v

Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do

Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai (của bacteriophage) tiếp quản bộ máy tổng hợp

Gen đích

DNA khuôn mẫu

Khuếch đại theo hàm mũ

Chu kỳ 35

2 2 = 4 2 3 = 8 2 4 = 16 2 36 = 68 tỷ bản sao bản sao bản sao bản sao

protein của tế bào DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bởi các enzyme hạn chế

Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng

chứa 4 hoặc 6 cặp nucleotide Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E coli cắt trình

tự GAATTC, enzyme TaqI của Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA (Hình

2.3) Hiện nay, có trên 900 enzyme hạn chế khác nhau đã được tinh sạch từ hơn 230 chủng vi khuẩn Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 2.3:

Pvu II ( Proteus vulgaris ) Eco RI ( Escherichia coli )

Rs AI ( Rhodopseudomonas sphaeroides ) Taq I ( Thermus aquaticus )

Hình 2.3 Các kiểu cắt và nhận biết trình tự nucleotide của enzyme hạn chế

(A1): tạo ra đầu bằng và (A2): tạo ra đầu so le với trình tự 6 nucleotide (B1): tạo

ra đầu bằng và (B2): tạo ra đầu so le với trình tự 4 nucleotide

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng (Hình 2.3, A1 và B1)

- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng

để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính) (Hình 2.3, A2 và B2)

Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng-sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai (foreign DNA) dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA

2 Các vector được dùng để tạo dòng các đoạn DNA

in vitro

Trong thực tế, các đoạn DNA được gắn với nhau để tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp thường không phải là các đoạn ngẫu nhiên của DNA hệ gen,

mà thay vào đó là một trong các đoạn DNA mang một gen từ sinh vật eukaryote hoặc vi khuẩn và một đoạn DNA khác thường là một phân tử vector (vector molecule) hoạt động như là một vật truyền để chuyển gen quan tâm vào trong một vi khuẩn hoặc một tế bào eukaryote Hai loại vector được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi

khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn (bacteriophage, viết tắt là phage)

2.1 Plasmid vector

1-

2.4 Plasmid vector pUC19 Vùng tạo dòng (từ 396-447) được gắn vào gen

lacZ’, nhưng không can thiệp vào chức năng của gen

2.5 Plasmid vector pGEM -T Easy Loại vector này đã được mở sẵn ở

vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn các sản phẩm

PCR do chúng có mang hai đầu A

AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT

EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI HincII PstI SphI HindIII

SmaI XmaI AccI SalI 1 lacZ’ ThrIleMetThr(Met)

400 420 440 460

2.6 Plasmid vector pBluescript II SK (+/-) Vector này mang vùng tạo

dòng (multiple cloning sites-MCS) ở vị trí từ 598-826 trên gen lacZ’, và các vị trí

gắn primer khác nhau dùng cho phân tích trình tự đoạn DNA ngoại lai

, DNA của plasmid được

in vitro

TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC…

…GGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC…

…CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC

M13-20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site…

…KS primer binding site… SK primer binding site

T3 primer binding site M13 reverse primer binding site

BssHII T7 Promoter KpnI DraII XhoI SalI

ApaI EcoO1091

ClaI HindIII EcoRV EcoRI PstI SmaI BamHI SpeI XbaI EagI BstXI SacII SacI

Bsp1061 NotI

T3 Promoter BssHII β-gal α-fragment

2.2 Bacteriophage vector

Có hai loại bacteriophage thường được sử dụng là và M13, tuy

nhiên chương này chỉ trình bày loại phổ biến hơn là bacteriophage

các chức năng khác nhau đã được trình bày trên sơ đồ cIII, N, cI, cro và cII: các

gen liên quan đến hoạt động điều hòa, miễn dịch tiền phage, siêu nhiễm O và P:

các gen tổng hợp DNA Q: gen điều hòa chức năng muộn S và R: các gen phân

giải tế bào vật chủ P L : promoter bên trái, P R : promoter bên phải, L-cos: đầu dính

bên trái, R-cos: đầu dính bên phải

(recipient) Phage vector

L-cos

A W B C D E FI FII Z U V G T H M L K I

J Đầu Đuôi

P L P R ori A…………J b att int xis red gam cIII N cI cro cII O P Q S R

Vùng điều hòa và miễn dịch

Vùng sao chép DNA Vùng phân giải vật chủ

Vùng điều hòa chức năng muộn

R-cos

in vitro (in vitro

(Hình 2.8)

Hình 2.8 Vector EMBL 3 Vector này được thiết kế từ phage mang các vị trí

nhận biết cho ba enzyme SalI, BamHI và EcoRI

3 Gắn đoạn DNA vào vector

3.1 Gắn các đoạn cDNA

đư, chẳng hạn như: b

5’…GGATC TGGGT CGACG GATCC GGGGA ATTCC CAGAT CC…3’

SalI BamHI EcoRI

(homopolymetric tailing)

(linkers và adapter)

vector Sợi đ(ví dụ: đoạn Klenow của DNA polymerase

2.9

Đoạn Klenow tạo đầu bằng cho cDNA sợi đôi và enzyme nuclease S1 cắt vòng cặp tóc Các linker thứ nhất và thứ hai được gắn tuần tự vào hai đầu của cDNA, sau đó đoạn cDNA này sẽ được cắt cùng enzyme hạn chế với vector tạo dòng có vị trí nhận biết trên hai linker nhân tạo Cuối cùng đoạn cDNA có hai đầu tương đồng

được gắn với vector và biến nạp vào E coli

cDNA sợi đôi Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow

Bổ sung linker thứ nhất

Cắt bằng nuclease S1

Sửa chữa bằng cách xử lý với đoạn Klenow hoặc bằng DNA polymerase của bacteriophage T4

Bổ sung linker thứ hai

Gắn với plasmid vector

Biến nạp vào tế bào khả biến E coli

Cắt bằng enzyme hạn chế

3.2 Gắn các sản phẩm PCR

Trong một số trường hợp nhất định có thể thay thế phương pháp tạo dòng truyền thống bằng phương pháp PCR, vì PCR cho phép sản xuất ra một lượng lớn đoạn DNA mong muốn và sau đó có thể tạo dòng đoạn DNA này trong các vector plasmid hoặc phage thích hợp Phương thức tạo dòng cho các sản phẩm PCR hoàn toàn giống tạo dòng các đoạn DNA thu được từ những thao tác DNA truyền thống, và có thể được tạo dòng với đầu bằng hoặc đầu kết dính (so le) DNA polymerase ổn nhiệt như Taq polymerase đã khuếch đại các sản phẩm PCR có gốc A lồi ra ở đầu 3’ Như vậy, có thể tạo dòng sản phẩm PCR vào trong các dT vector (được gọi là tạo dòng dA:dT) Điều này cho thấy việc bổ sung các gốc A vào đầu cuối có thể giúp gắn thành công sản phẩm PCR với vector đã được chuẩn bị các gốc T lồi ra (Hình 2.10) Phản ứng được xúc tác bởi DNA ligase, như trong một phản ứng gắn truyền thống

Hình 2.10 Tạo dòng các sản phẩm PCR bằng phương thức tạo dòng dA:dT

Người ta cũng có thể tạo dòng đầu dính với các sản phẩm PCR Trong trường hợp này các oligonucleotide primer được thiết kế với một vị trí cắt hạn chế được kết hợp chặt chẽ trong chúng Do sự bổ trợ của các primer cần thiết là tuyệt đối ở đầu 3’, nên thông thường đầu 5’ của primer là vùng định

vị của vị trí cắt hạn chế Điều này cần phải được thiết kế với sự chú ý thận trọng do hiệu suất cắt DNA bằng một enzyme hạn chế nhất định sẽ giảm nếu các nucleotide bổ sung thêm cho sự nhận biết của enzyme lại thiếu ở đầu 5’ Trong trường hợp này các phản ứng cắt và gắn giống như các phản ứng truyền thống

4 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn/tế bào vật chủ

Sau khi tạo được vector tái tổ hợp mang gen ngoại lai, việc tiếp theo là biến nạp nó vào tế bào vật chủ Trong trường hợp này tế bào vật chủ thường

được sử dụng là vi khuẩn E coli để khuếch đại một lượng lớn DNA của

plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích về sau

Hai phương pháp được dùng để biến nạp vector tái tổ hợp vào E coli

là điện biến nạp (electroporation transformation) và hóa biến nạp (chemical transformation)

4.1 Điện biến nạp

Đây là kỹ thuật hiệu quả nhất để biến nạp vi khuẩn Hai thông số quan trọng của phương thức này là loại tế bào vi khuẩn và tần số xung điện cần thiết Thể tích của dung dịch tế bào thường được dùng là 30 µL (tương ứng với nồng độ 1010

tế bào E coli/mL) có bổ sung 5 ng plasmid trong một

cuvette có khoảng trống điện cực (electrode gap) 0,1 cm Hiệu suất biến nạp của phương thức này lớn hơn 1 109

thể biến nạp/µg plasmid siêu xoắn và khoảng 1 108

thể biến nạp/µg plasmid được dùng trong phản ứng gắn Tần

số biến nạp khoảng 0,02 cho cả hai loại plasmid Tần số biến nạp thấp đã ngăn cản được sự đồng biến nạp (co-transformation) vào vi khuẩn của hai hoặc nhiều phân tử plasmid

Phương pháp điện biến nạp có một số ưu điểm sau:

- Hiệu suất biến nạp cao

- Có thể dùng một thể tích dịch tế bào nhỏ Thể tích dịch tế bào khoảng 20 µL có thể cho hiệu suất khoảng 109 thể biến nạp

- Phương pháp chuẩn bị tế bào biến nạp rất đơn giản, không sử dụng các kỹ thuật phức tạp và tốn thời gian Hơn nữa, các tế bào dùng để biến nạp

có thể được chuẩn bị trước và bảo quản vô hạn định mà không mất tính khả biến

- Tần số điện biến nạp với DNA siêu xoắn và DNA mạch vòng là giống nhau Do đó, không cần thiết phải dùng vector được tinh sạch cao trong các phản ứng gắn

- Hiệu suất biến nạp phân tử cho DNA mạch vòng rất cao đối với các plasmid có kích thước lên đến 50 kb

Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền

4.2 Hóa biến nạp

Đây là phương thức kinh điển để biến nạp plasmid vào tế bào E coli

Các tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến giúp cho chúng dễ tiếp nhận plasmid Plasmid được đưa vào bằng cách shock nhiệt nhanh (40-50 giây), các tế bào biến nạp sau đó được chọn lọc bằng phương pháp chọn lọc dương tính trên đĩa agar chứa môi trường LB với kháng sinh thích hợp Mỗi khuẩn lạc trên đĩa kháng sinh đại diện cho một thể biến nạp đơn Các tế bào chứa plasmid mang DNA ngoại lai có thể xác định bằng mắt trên đĩa môi trường có bổ sung thêm cơ chất nhiễm sắc thể cho β-galactosidase (X-gal) vì chúng là các khuẩn lạc không màu do sự khử hoạt tính của enzyme bằng cách chèn đoạn DNA ngoại lai

Phương pháp chuẩn bị và bảo quản tế bào khả biến trong hóa biến nạp cũng rất đơn giản Hiệu suất biến nạp của phương pháp này trong khoảng

104-106 thể biến nạp/µg plasmid, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA chèn (DNA ngoại lai) và chủng vi khuẩn được sử dụng Hiệu suất này thích hợp cho các phương thức tạo dòng truyền thống Đối với các phương thức cần hiệu suất biến nạp cao hơn (ví dụ: xây dựng thư viện cDNA, xây dựng thư viện phân tích trình tự DNA ) thì tốt hơn hết là dùng phương pháp điện biến nạp Tuy nhiên, nếu không có sẵn thiết bị biến nạp bằng điện thì vẫn có thể thu được hiệu suất biến nạp cao bằng cách dùng các chủng vi khuẩn thích hợp hơn cho mục đích này và có thể thu được hiệu suất 109

thể biến nạp/µg plasmid

IV Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp

Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng lớn phân tử DNA cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn lại với nhau bằng enzyme DNA ligase Kết quả, hỗn hợp này có plasmid tái tổ hợp lẫn các