Sản xuất axit lactic

Axit lactic là axit tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy ở người, động vật, thực vật và vi sinh vật.Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Điển Sheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua.Năm 1857, Louis Pasteur (18221895) chứng minh quá trình lên men lactic là gây nên bởi vi sinh vật.Năm 1878, Joseph Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic, nay gọi là streptococcus lactic.

Sản xuất axit lactic

I. Giới thiệu

1. Lịch sử phát hiện

Axit lactic là axit tồn tại rộng rãi trong tự nhiên, được tìm thấy ở người, động vật, thực vật

và vi sinh vật

Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Điển Sheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa

bò lên men chua

Năm 1857, Louis Pasteur (1822-1895) chứng minh quá trình lên men lactic là gây nên bởi

vi sinh vật

Năm 1878, Joseph Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đặt tên là Bacteriumlactic, nay gọi là streptococcus lactic

2. Giới thiệu về axit lactic

Axít lactic hay axít sữa có tên IUPAC là 2-Hydroxypropanoic acid là một hợp chất hóa họcđóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh

Axit lactic là một axít carboxylic với công thức hóa học CH3CH(OH)COOH Trong dung

dịch, nó có thể mất một proton từ nhóm acid, tạo ra ion lactate CH3CH(OH)COO− Axit lactictồn tại dạng tinh thể, không màu, mùi nhẹ, tan trong nước và cồn Khối lượng phân tử của axitlactic là 98,08 Nhiệt độ sôi là 1220C Nhiệt độ nóng chảy 16,80C

Do chứa một nguyên tử cacbon không đối xứng nên trong tự nhiên axit lactic tồn tại haidạng đồng phân L(+) và dạng D(-) hay dạng raxemic Tính chất hóa lý của hai đồng phân nàykhông khác nhau nhưng khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của chúng thì khác nhau, do đótính chất sinh học của chúng là hoàn toàn khác nhau Ở tế bào người và động vật thì chỉ tồn tạidạng axit lactic L(+)

3. Ứng dụng của axit lactic

 Axit lactic là một loại axit hữu cơ có nhiều ứng dụng nhất

 Axit lactic được dùng trong bảo quản và chế biến thực phẩm như làm sữa chua; muối chua rau

củ, làm nem chua

 Do vị chua dễ chịu và đặc tính bảo quản, một lượng lớn axit lactic được sử dụng trong côngnghiệp thực phẩm Nó được sử dụng như một chất gia vị đối với các loại đồ uống nhẹ, tinh dầu,dịch quả, mứt, xiro cũng như ngành đóng hộp hoa quả và cá.

 Axit lactic được dùng để axit hóa rượu vang hoa quả nghèo axit, axit hóa dịch đường quá trongcông nghiệp rượu mạnh và để sản xuất bột chua trong ngành bánh mì

 Axit lactic được dùng trong công nghiệp thuộc da, công nghiệp dệt và công nghiệp đồ nhựa nhưsản xuất chỉ khâu tự hủy hoặc làm tiền chất để tạo ra polyme sinh học có thể tự phân hủy

 Axit lactic có thể trở thành một hoá chất để sản xuất este lactate, propylene glycol, propylen oxit,axit acrylic, 2,3-pentanedione, acidacetaldehyde propanoic, và dilactide

 Trong phẫu thuật chỉnh hình người ta thường sử dụng loại vật liệu có tên là Purasorb Purasorb làmột hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic Nó giúp gắn các phần xương lại với nhaukhi xương định hình Purasorb sẽ tự tiêu hủy

II. Sản xuất axit lactic

1.1 Các vi sinh vật có thể lên men lactic acid:

- Vi sinh vật mà có thể sản xuất axit lactic có thể được chia thành hai nhóm : vi khuẩn vànấm Các vi sinh vật được lựa chọn cho các điều tra gần đây của sản xuất công nghệ sinh học củaaxit lactic được liệt kê trong Bảng 1

Bảng 1 Vi sinh vật được sử dụng để nghiên cứu gần đây của công nghệ sinh học sản xuấtaxit lactic

1.2 Vi khuẩn lên men lactic acid:

1.2.1 Đặc điểm hình thái:

- Vi khuẩn lactic được Pasteur tìm ra từ sữa bị chua Vi khuẩn lactic thuộc về họLactobacteriaceae và được xếp vào 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và

Leuconostoc Do những đặc điểm riêng, Bifidobacterium, cũng thuộc họ này, nay được xếp vào

họ Actinomyctales Nhóm vi khuẩn này gồm nhiều loại khác nhau về hình dạng, sinh lí và khảnăng lên men

- Chúng gồm những loài có cơ thể đơn bào, kích thước nhỏ, có dạng hình cầu, hình que ngắn haybầu dục Hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiệnnuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào

- Thuộc loài Gram dương, phần lớn không có khả năng chuyển động, không sinh bào tử

1.2.2 Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa:

- Chúng có thể lên men được các loại đường monosaccharid hoặc disaccharid nhưng không lênmen được tinh bột (trừ loài Lactobacillus delbrueckii có khả năng đồng hoá được tinh bột) Một

số vi khuẩn lactic không lên men được saccharose, số khác lại không sử dụng được maltose Vikhuẩn lactic lên men dị hình có thể sử dụng được pentose và acid citric

- Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong môi trường,như vậy khả năng chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau pH từ 4,5-6,8 Đa số các trựckhuẩn đồng hình tạo acid cao hơn (khoảng 2 – 3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%) Các trựckhuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4 (cầu khuẩn không thể phát triển được trong môitrường này) Hoạt lực lên men tốt nhất là trực khuẩn ở vùng pH = 5,5 – 6

- Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của loài vi khuẩn lactic ưa ấm (Mesophil) là khoảng 25 – 35 0C, ưanhiệt (Thermophil) khoảng 40 – 55 0C và ưa lạnh thì thấp hơn 5 0C Khi gia nhiệt khoảng 60 – 80

0C, thì hầu hết vi khuẩn lactic bị chết sau 10 – 30 phút

- Các Bifidobacterium thực chất là kị khí, còn các vi khuẩn lactic khác, là sinh vật kỵ khí khôngbắt buộc Do đó, trong thực tế khi nồng độ oxygen thấp thì hoạt động sống được duy trì bìnhthường, nhưng không bắt buộc luôn phải như vậy.

- Độ ẩm dễ tạo điều kiện kỵ khí cho vi khuẩn lactic làm cho acid lactic tích lũy nhanh chóng trongquá trình lên men

- Vi khuẩn lactic được chia thành hai nhóm: nhóm vi khuẩn lên men lactic đồng hình và nhóm vikhuân lên men lactic dị hình

1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic

Trong quá trình lên men môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu suất và thờigian của quá trình nuôi cấy cũng như ảnh hưởng đến giá thành của sản phẩm Vi sinh vật sinh

trưởng và phát triển trong điều kiện môi trường có đầy đủ các thành phần thiết yếu như C, H, N

và O Mặt khác trong thành phần cũng phải có các nguyên tố vi lượng và một số tiền chất khác

để kích thích sựu phát triển của tế bào vi khuẩn

1.2.3.1 Nguồn cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon từ các monosaccarit(glucose, fructose, manose, galactose), disaccarit (saccarose, lactose, maltose) đến cácoligosaccarit Tốc độ lên men các loại mono-, di- và oligosaccarit giảm dần theo độ phức tạpcủa các hydratcacbon, còn đối với nguồn cacbon là polysaccarit (tinh bột, dextrin) thì cầnthủy phân trước khi thực hiện quá trình lên men

Nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào vàsinh ra axit lactic và các sản phẩm khác

Khi nhân giống người ta thường dùng các loại đường mono- hoặc disaccarit để vikhuẩn có thể thích nghi và phát triển nhanh chóng mà vẫn không ảnh hưởng tới khả năng lenmen đối với các nguồn cacbon thông thường

ít loài vi khuẩn lactic có khả năng tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nito vô cơ

Nguồn axit amin có thể được bổ sung vào môi trường dạng protein và được đồng hóadưới dạng peptid nhờ vào tác dụng của enzym protease và peptidase ngoại hay nội bào.Trong công nghiệp thường dùng dịch nấm mem thủy phân vì có hàm lượng nito cao, có 16loại axit amin trong đó có 8 loại axit amin không thay thế đồng thời giải quyết được các vấn

đề về kinh phí sản xuất và giá thành sản phẩm

1.2.3.3 Các muối vô cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Các chất vô cơ và các chất khoáng chỉ cần một lượng rất nhỏ nhưng ảnh hưởng lớn đếnquá trình sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn Ví dụ như với Lactobacilus, Mn2+, Mg2+, Fe2+làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzymprotease thủy phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào

Đa số các vi khuẩn lactic cần hàng loạt các vitamin như riboflavin, tiamin, axit folic,biotin… để sinh trưởng và phát triển vì khả năng sinh tổng hợp của các vi khuẩn lactic thuộcloại yếu Do vậy hàm lượng vitamin của môi trường giữ một vai trò quan trọng trong sự tổng hợpcác axit amin Vì vậy môi trường nuôi cấy thường bổ sung dịch cà chua, cao nấm men vì chúngchứa nhiều axit amin và các vitamin

Ngoài ra các axit béo cũng ảnh hưởng lên quá trình sinh trưởng của vi khuẩn lactic theo cơchế còn chưa được biết rõ

1.2.3.4 Oxi

Vi khuẩn lactic hầu hết là các vi khuẩn phát triển trong điều kiện yếm khí Có một số loài

có thể phát triển trong điều kiện có oxi Tuy nhiên theo nghiên cứu cho rằng vi khuẩn lactic pháttriển tốt nhất trong điều kiện có nồng độ oxi thấp

1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của vi sinh vật:

Các quá trình lên men dù khác nhau về cơ chế, điều kiện nhưng đều bị ảnh hưởng bởi cácnhân tố:

+ Nhiệt độ: Mỗi loài vi sinh vật đều có một yêu cầu nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển

của mình Đa số vi khuẩn lactic có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-40 oC Ảnh hưởngcủa nhiệt độ có lẽ nhiều nhất là đến các phản ứng enzyme Trong một khoảng nhiệt độ nào đó thìtốc độ phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì sẽ xảy ra sự biếntính protein

- Ví dụ: Vi khuẩn lactic, nhiệt độ từ 30-32oC, nhiệt độ không thích hợp enzyme giảm, đôikhi xảy ra hiện tượng lên men phụ

+ pH của môi trường: Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng,

chịu tác động mạnh của pH Mỗi enzyme đều có vùng pH tối ưu mà tại đó hoạt lực của enzyme

là cao nhất Các vi khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là: Lactobacillus, 5,5-6,2;Pediococcus, 5,5-6,5; Leuconostoc, 6,3-6,5 Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic

có thể chịu được là khác nhau Chẳng hạn Lactobacillus có thể chịu được pH = 3,2-3,5;Pediococcus có thể chịu được pH = 3,5-4,4; Leuconostoc có thể chịu được pH<5 pH<4 hầu hết

vi khuẩn lactic ngừng hoạt động

+ Nồng độ dịch men: Trong lên men lactic cơ chế của quá trình lên men chứa khoảng 10%

đường Nếu nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường sinh tổng hợp; chứa đủ các chất, nhưng lại thiếumất một thành phần dinh dưỡng cần thiết, sinh trưởng phát triển của vi sinh vật sẽ không thể xảy

ra Nếu nồng độ cơ chất dư thừa, tốc độ phát triển của vi khuẩn sẽ giảm xuống, thạm chí bịngừng lại hoàn toàn

+Oxy: Nó quyết định chiều hướng lên men diễn ra theo kiểu yếm khí hay kỵ khí.

1.2.5 Lactobacillus delbrueckii.

Lactobacillus delbrueckii là loài điển hình của chi Lactobacillus Nó bao gồm ba phânloài : delbrueckii , bulgaricus , và lactis Trong khi các phân loài bulgaricus và lactis là hầu nhưchỉ có trong sữa , phân loài delbrueckii có ở các nguồn thực vật Nó không thể lên men lactose vàphân hủy casein và do đó, không thể phát triển trong sữa, không được sử dụng trong chế biếnsữa Trong môi trường dịch thể chúng có khả năng tạo ra khoảng 70% acid lactic từ đường.Đặc điểm:

+ Vi khuẩn này thường gặp trên hạt đại mạch

+ Chúng là Gram dương, không thể tự di chuyển, không hình thành bào tử , lên men đồnghình bắt buộc và chỉ sản xuất D (-)-lactic acid

+ Môi trường nuôi cấy: MRS.

+ nhiệt độ bảo quản: 4oC

Chúng là loài chỉ tạo ra 1 loại đồng phân quang học của acid lactic (D) và có thể sử dụng

cơ chất tinh bột

1.2.6 Cơ chế hoạt động của vsv-vi khuẩn lên men lactic:

- Vi khuẩn axit lactic có thể được phân thành hai nhóm: lên men đồng hình và lên men dịhình

+ Trong khi các LAB lên men đồng hình chuyển đổi glucose hầu như chỉ thành acid lactic,các LAB lên men dị thể biến đường thành ethanol và CO2 cũng như axit lactic (Hình 2)

+ LAB dị hình thường chuyển hóa glucose thông qua con đường Embden-Meyerhof (tức làđường phân)

Fig 2 Metabolic pathways of homofermentative (solid line) and heterofermentative

(dotted line) lactic acid bacteria: P, phosphate; ADP, adenosine 5'-diphosphate; ATP, adenosine5'-triphosphate; NAD+, nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, nicotinamide adeninedinucleotide (reduced form); (1), lactate dehydrogenase; (2), alcohol dehydrogenase

Cụ thể:

1.2.6.1 Lên men lactic đồng hình (điển hình):

+ Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men trong đó các sản phẩm axit lactic tạo rachiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men và một lượng nhỏ axit acetic, aceton, di-acetyl, …+ Phương trình chung biểu diễn quá trình lên men:

C6H12O6 2 CH3CHOHCOOH + 21,8.104 J

+ Trong quá trình lên men lactic đồng hình, glucoza được chuyển hoá theo chu trìnhEmbden-Mayerhoff, vi khuẩn sử dụng cho qui trình này tất cả các loại enzym aldolase, cònhydro tách ra khi dehydro hoá triozophophat được chuyển đến pyruvat Vì trong vi khuẩn lênmen lactic đồng hình không có enzyme cacboxylase cho nên axit pynivic không phân huỷ nữa

mà tiếp tục khử thành axit lactic

+ Có thể xem lên men lactic đồng hình tiến hành theo hai giai đoạn :

Giai đoạn 1: thời kỳ sinh trưởng cấp số mũ của vi khuẩn, từ hexoza nhờ sự oxi hoá

photphoglyceraldehyde kèm theo việc khử pividinnucleotide (PN) để tạo axit photphoglyceriaic.PCH2-CHOH + H2O + PN  P.CH2CHOG-COOH + PNH2

Giai đoạn 2: do chất nhận hydro là PN-H2 tăng mà thế oxy hoá khử của môi trường giảmxuống dẫn đến sự nhường hydro từ PN-H2 cho axit photphoglycerinic để khử nó thành axitlactic

CH2OP-CHOH-COOH + H2O ( PN-H2 )  CH3CHOHCOOH + H3PO4 + PN +H2O

+ Tuỳ thuộc vào tính đặc hiệu quang học của enzym lactate- dehydrogenase và sự có mặtcủa lactataxemase mà loại axit lactic dạng nào được tạo ra D(-), L(+) hoặc DL

1.2.6.2 Lên men lactic dị hình (không điển hình):

+ Lên men lactic dị hình là quá trình lên men trong đó ngoài sản phẩm axit lactic còn tạo ramột lượng đáng kể các sản phẩm phụ như axit acetic, etanol, axit xucxinic, CO2,………

+ Phương trình chung biển diễn quá trình lên men:

C6H12O6  CH3CHOHCOOH + HOOC(CH2)COOH + CH3COOH + C2H5OH +CO2 …

Trong đó, axit lactic chiếm khoảng 40%, axit xucxinic khoảng 20%, rượu êtylic và axitacetic 10% các laọi khí 20% đôi khi không có các khí mà thay vào đó là sự tích luỹ một lượng

ít axit foocmic Như vậy, các sản phẩm phụ khác nhau đáng kể tạo thành trong quá trình lên menlactic dị hình chứng tỏ rằng quá trình này phức tạp hơn so với lên men lactic đồng hình

+ Trong vi khuẩn lên men lactic dị hình không có các enzyme cơ bản của sơ đồ marehof là aldolase triozophotphatizomerase bước đầu phân giải đường glucose ở những vikhuẩn này theo con đường pentozophotphat, tức là thông qua glucose-6photphat, 6-photphogluconat và ribulose-5-photphat chuyển thành xilulose -5-photphat, hợp chất này tiếp tụcbiến đổi thành photphoglyceraldehyde và acetylphotphat dưới tác dụng của enzymepentozophotpho xelolase Những vi khuẩn dị hình thành axit acetic kèm theo sự tổng hợp ATP.Acetylphophat được khử thành etanol thông qua acetyldehyt photphoglyceraldehyde thông quaaxit pynivic mà tạo thành axit lactic.

Embden-+ Axit lactic được tạo thành từ axit pynivic do sự tiếp nhận trực tiếp hydrogen từdehydrase theo phương trình :

CH3COCOOH + dehydrase-H2  CH3CHOHCOOH + dehydrase

+ Axit xucxinic tạo thành từ axit pynivic do tác dụng với CO2 và tiếp theo là sự tiếp nhậnhydrogen từ dehydrase theo phương trình sau:

CH3COCOOH + CO2  COOH-CH2-CO-COOH

COOHCH2COCOOH+2 Dehydrase -H2 COOH(CH2 )2 COOH + H2O + 2Dehydrase+ Etanol và axit acetic tạo thành nhờ men aldehydrase từ acetaldehyde theo phương trình

2 CH3CHO + H2O + aldehydrase  C2H5OH + CH3COOH + aldehydrase

+ Việc sinh ra các khí liên quan đến điều kiện yếm khí tỉ lệ các hợp chất phụ sinh ra phụthuộc vào môi trường dinh dưỡng và các loại vi khuẩn lactic

Theo quan điểm tiến hoá sinh lý trong vi sinh vật học người ta cho rằng lên men lacticđồng hình là hướng tiến hoá độc lập của lên men dị hình

1.3 Những nghiên cứu cụ thể để nâng cao hoạt lực, năng suất của loại vsv đó: (nói

chung cho vi các khuẩn)

- Hầu hết LAB được sử dụng trong sản xuất thương mại axit lactic thuộc về chiLactobacillus, ví dụ như L delbrueckii…

Để nâng cao hoạt lực, năng xuất, có thể:

a. Dựa vào nghiên cứu các điều kiện lên men tối ưu, ví dụ: cơ chất thích hợp với từng loại vi khuẩn.

+ Schepers et al đã sử dụng L helveticus để sản xuất axit lactic từ lactose và whey phomát được cô đặc , và Burgos - Rubio et al báo cáo điều tra động học của chuyển đổi cơ chấtkhác nhau thành acid lactic với việc sử dụng của L bulgaricus Hujanen và Linkhông đã nghiêncứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy và các nguồn nitơ trong sản xuất axit lactic bởi L casei , vàRoukas và Khôngtzekidou cũng đã sử dụng dòng này để sản xuất axit lactic từ nước whey được

đề protein hóa bởi trộn lẫn các sự nuôi cấy của các tế bào tự do và đồng cố định Fu và Mathews

đã nghiên cứu mô hình động học của sản xuất axit lactic từ lactose bằng lên men bởi lên mengián đoạn L plantarum và Bustos et al đã sử dụng L pentosus để sản xuất axit lactic từ chất thảicủa trái nho xén nhỏ Các chủng của L amylophilus sản xuất – amylase được sử dụng thườngxuyên cho việc chuyển đổi trực tiếp của tinh bột thành acid lactic

+ Trong số các chi Lactobacillus, L delbrueckii đã xuất hiện phổ biến trong nhiều cuộcđiều tra về sản xuất axit lactic Khôngtzanmanidis et al đã sử dụng L delbrueckii NCIMB 8130cho sản xuất axit lactic từ mật đường củ cải Monteagudo et al và Göksungur và Güvenç cũng đã