Thực tập vi sinh vật học dành cho sinh viên ngành công nghệ môi trường

Thực tập vi sinh vật học dành cho sinh viên ngành công nghệ môi trường Tài liệu dành cho các bạn học tập, nghiên cứu, tham khảo trong quá trình học về môn học này, cũng như tham khảo trong quá trình học tập của mình.

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG Lê Quốc Tuấn Thực Tập VI SINH VẬT HỌC (Dành cho sinh viên ngành Công nghệ Môi trường) Lưu hành nội -2004- MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU I MỤC ĐÍCH Cuốn thực tập vi sinh vật học biên soạn cho sinh viên Ngành Công nghệ Môi trường, Trường Đại Học Nông Lâm – TP Hồ Chí Minh với mục đích giúp sinh viên làm quen với kỹ thao tác phòng thí nghiệm vi sinh vật : Pha chế môi trường; Khử trùng môi trường; Phân lập, Nuôi cấy Bảo quản vi sinh vật…Nội dung thực hành chia làm phần: Phần I Phần thực tập vi sinh đại cương Trong phần sinh viên thực hành chuẩn bị môi trường, thao tác vô trùng phương pháp lấy mẫu bảo quản, nhuộm màu quan sát vi sinh vật Phần II Phần thực tập vi sinh môi trường Trong phần sinh viên tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để phát định lượng chúng Mỗi nhóm chọn đề tài nghiên cứu chủng vi sinh vật có giáo trình thực tập để tiến hành phân tích chúng Kết phần thực tập đánh giá dựa vào mức độ chuyên cần, mức độ hiểu biết nguyên tắc, kỹ thao tác thực tập Kết đánh giá qua kiểm tra viết thực hành phần thực tập II YÊU CẦU Sinh viên phải thực nghiêm túc số quy tắc sau: Không ăn uống phòng thí nghiệm, không ngậm vật dùng để thao tác trình thực hành Mang áo blouse suốt thời gian thực hành, không mang nơi khác Mang găng tay thiết bị bảo hộ trình tiếp xúc với chất độc hại Luôn sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), không hút miệng Sử dụng giấy thấm có tẩm chất khử trùng để lau xung quanh khu vực tiến hành thí nghiệm Nếu lỡ tay làm đổ, nhiễm dịch vi sinh vật lên bàn thực tập tiến hành lau sau khử trùng lại bàn thực tập Khi làm vỡ vật dụng thuỷ tinh, phải mang găng tay để thu gom chúng vào túi rác riêng Loại thải tất chất độc hại nơi quy định Phải cẩn thận thao tác vô trùng với đèn cồn Dập tắt lửa nhu cầu sử dụng thời gian dài Báo cáo với cán hướng dẫn có tình khẩn cấp xảy để giải kịp thời 10 Lau chùi thiết bị, bàn thí nghiệm chất khử trùng, rửa tay xà hoàn tất công việc 11 Trước rời phòng thí nghiệm, cởi áo blouse cho vào túi nilon nhà giặt để sử dụng vào lần thí nghiệm PHẦN : VI SINH ĐẠI CƯƠNG CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THAO TÁC VÔ TRÙNG PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU, PHÂN LẬP VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT BÀI KỸ THUẬT THAO TÁC VÔ TRÙNG Nguyên tắc Vi sinh vật cần nuôi cấy để định danh, khảo sát tính sinh trưởng phát triển Một môi trường nuôi cấy thích hợp cho phát triển nhiều loại vi khuẩn tiến trình thao tác phải hạn chế tối đa việc đưa loại vi khuẩn khác vào Kỹ thuật thao tác vô trùng sử dụng trình nuôi cấy vi sinh vật nhằm loại trừ vi sinh vật gây nhiễm Môi trường, vật dụng cần thiết cho việc nuôi cấy phải khử trùng thích hợp trạng thái vô trùng trước sử dụng Các thao tác vô trùng thực không gian vô trùng tạo lửa đèn cồn Ngọn lửa có tác dụng oxy hoá không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm mở nắp, nút Để đảm bảo tính vô trùng cao, đèn vô trùng đặt không gian cách ly gọi tủ cấy vô trùng Không khí tủ cấy vô trùng khử trùng tia cực tím màng lọc Thông thường, trước sử dụng cần bật đèn cực tím trước 30 – 60 phút bật quạt thông gió tiến hành thao tác Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, người thao tác cần mang găng tay sát trùng trước bắt đầu thao tác Ngoài ra, cần tiến hành sát trùng bề mặt bàn thao tác lau với cồn 700 dung dịch diệt khuẩn khác trước thao tác Nội dung thực hành Sinh viên thực bước chuẩn bị trước thao tác vô trùng thực hành kỹ thuật vô trùng để cấy vi sinh vật Vật liệu - Que cấy vòng, kim cấy Đèn cồn ng môi trường, ống giống Thực hành - Bật đèn cực tím 15 phút sau tắt đèn chờ 10 phút trước tiến hành nuôi cầy - Rửa tay xà bông, lau khô sau khử trùng tay cồn 700 - Khử trùng que cấy, đũa tam giác lửa đèn cồn - Trước cấy cần ghi cẩn thận lên thành bình ống nghiệm petri tên giống vi sinh vật ngày cấy Phương pháp khử trùng que cấy Đốt nóng đỏ đầu que cấy lửa đốt nhẹ phần cán đưa vào bên dụng cụ chứa vi sinh vật Mở nút đưa que cấy khử trùng vào dụng cụ chứa giống Làm nguội que cấy cách áp đầu que cấy vào thành ống nghiệm, bình chứa thuỷ tinh đặt nhẹ lên phần môi trường không chứa vi sinh vật cho nguội trước thu lấy lượng nhỏ sinh khối vi sinh vật Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng Cấy giống từ ống thạch nghiêng (môi trường rắn) sang môi trường lỏng Cấy giống từ môi trường lỏng (dịch nuôi cấy, huyền phù tế bào) lên bề mặt thạch nghiêng BÀI CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG Nguyên tắc Để phân lập, nuôi cấy bảo quản loại vi sinh vật người ta phải sử dụng môi trường dinh dưỡng đặc lỏng Môi trường dinh dưỡng phải đảm bảo thành phần dinh dưỡng thích hợp cho phát triển vi sinh vật Môi trường dinh dưỡng thích hợp môi trường có đầy đủ thành phần vô hữu cần thiết cho vi sinh vật sử dụng mà phải đảm bảo pH, oxy hoá khử thích hợp, không chứa độc tố hoàn toàn vô trùng Vì vậy, cần thiết lập môi trường dinh dưỡng cho loại vi sinh vật cần phải biết rõ nhu cầu chất dinh dưỡng đặc điểm trao đổi chất Cần phải lưu ý nồng độ chất dinh dưỡng để trì cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật Người ta thường gọi tên môi trường cách dựa vào tên người tìm chúng (vd : môi trường Czapek, Hansen, Pikovskaia…) ghi theo nguồn chất dinh dưỡng môi trường (vd : môi trường Glucose-peptone, potato-glucose-agar…) Chủng loại, thành phần đặc tính môi trường pha chế tuỳ thuộc vào số yếu tố sau: - Tuỳ vào mục đích yêu cầu thực tập hay nghiên cứu - Tuỳ nhu cầu dinh dưỡng vi sinh vật Môi trường phân loại dựa vào thành phần tính chất hoá – lý hay công dụng môi trường Dựa vào thành phần phân biệt loại môi trường sau: - Môi trường dinh dưỡng tự nhiên : dùng sản phẩm có sẵn tự nhiên sữa, huyết thanh, khoai tây, cám, đường,…Thành phần hoá học sản phẩm không ổn định phức tạp - Môi trường tổng hợp : dùng hoá chất định với hàm lượng xác định để pha chế môi trường - Môi trường bán tổng hợp : kết hợp với việc dùng sản phẩm tự nhiên hoá chất tổng hợp Dựa vào tính chất vật lý phân biệt loại môi trường sau đây: - Môi trường lỏng hay môi trường dịch thể - Môi trường rắn môi trường chứa 1,5 – 2% agar 10 – 20% gelatin - Môi trường rắn mềm môi trường có chứa 0.35 – 0.7% agar Dựa vào công dụng phân biệt thành môi trường sau : - Môi trường chọn lọc : môi trường đảm bảo phát triển ưu loại nhóm vi khuẩn xác định Ví dụ : môi trường dùng để phân lập nuôi cấy vi sinh vật cố định đạm, vi khuẩn nitrat hoá, vi khuẩn phân giải cellulose,… - Môi trường kiểm định : môi trường cho phép phân biệt số đặc điểm số loại vi khuẩn cần xác định Thường người ta cho vào môi trường kiểm định số chất thị màu số hoá chất giúp cho việc tạo phản ứng màu để quan sát thấy Ví dụ : môi trường lên men đường, môi trường thạch chì… Chuẩn bị môi trường khâu quan trọng việc nghiên cứu vi sinh vật, cần thực cẩn thận xác Trình tự thiết lập môi trường sau: - Cân, đong xác thành phần môi trường - Với môi trường lỏng : chất hoà tan vào nước sau cân đong Đối với môi trường rắn cần bổ sung thêm agar - Môi trường cần phải để dễ quan sát cần thiết phải lọc qua giấy lọc - Tuỳ theo đối tượng sinh vật nuôi cấy tuỳ theo yêu cầu nghiên cứu, môi trường điều chỉnh pH HCl 10% NaOH 10%, dung dịnh khác H3PO4, H2SO4, KOH, Na2CO3…trước khử trùng Việc điều chỉnh theo dõi máy đo pH - Chỉ sử dụng phần dung tích tổng bình chứa để chứa môi trường Với bình cầu thường dùng khoảng 1/3 – ½ dung tích bình; với ống nghiệm thường dùng khoảng 5ml/ống làm môi trường lỏng – 7ml làm môi trường thạch nghiêng Nội dung thực hành Sinh viên thực hành chuẩn bị pha chế số môi trường để nuôi cấy vi sinh vật Vật liệu - Bình tam giác 100ml, ống nghiệm, phễu thuỷ tinh Ống hút 5ml, 10ml, ống đong 100ml Cân, nồi hấp áp lực Thịt bò, lúa, agar Thực hành Các bước chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật : cân, đong, đo xác thành phần môi trường nuôi cấy Dùng cốc thuỷ tinh 500ml cho 200ml nước cất vào cốc, sau cân xác thành phần hoá chất để pha chế môi trường cho vào cốc có nước, vừa cho vào vừa khuấy cho chúng tan ra, cần thiết đun nóng bếp điện có lưới amian Sau đo pH dung dịch vừa pha xong, cho vào bình tam giác 1000ml thêm nước cất đến 500ml Làm nút bông, gói lại đem khử trùng nồi hấp áp lực Phương pháp chuẩn bị số môi trường tự nhiên chúng sẵn phòng thí nghiệm 4.1 Nước chiết thịt 1kg thịt bò nạc, lọc bỏ hết gân mỡ, sau thái nhỏ cho vào cối xay thịt, xay nhỏ Cho vào xoong cho lít nước để tiến hành chiết điều kiện mát lạnh (để tủ lạnh, ngăn làm mát) kéo dài 24 Sau mang đun nhỏ lửa liên tục sôi, trì nhiệt độ sôi 30 phút Lọc lấy nước tiếp tục bổ sung nước cất cho đủ lít phân vào bình bảo quản, trước phải khử trùng 1.5 – atm thời gian 20 phút 4.2 Nước chiết đất Dùng để phát triển nhiều nhóm vi sinh vật đất : lấy 1kg đất màu mỡ (hay đất chỗ nghiên cứu) cho lít nước khử trùng 1200C thời gian 30 phút Sau đem lọc, dịch dạng kiềm thêm K2HPO4 khử trùng 4.3 Nước mạch nha Có thể hoàn toàn chủ động làm phòng thí nghiệm Ngâm thóc cho nẩy mầm, độ dài mầm tốt - 2cm Tách lấy mầm sấy khô Lấy 250mg mẫu khô nghiền nhỏ cho lít nước vào ngâm, trì nhiệt độ 450C (để nồi cách thuỷ, tủ ấm hay đun nhỏ lửa bếp được) Khấy liên tục, thời gian 30 phút, sau thời gian điều chỉnh cho nhiệt độ tăng lên 650C trì Trong thời gian enzyme diastase đường hoá tinh bột, kiểm tra trình đường hoá tinh bột cách sử dụng dung dịch iod Sau đường hoá tinh bột xong đem lọc lấy nước, làm đặc lại cách cho bốc nước, tỉ lệ đường 10% 4.4 Pha chế số môi trường để nuôi cấy vi sinh vật 4.4.1 Môi trường Gause (g.l-1) : dùng để nuôi cấy xạ khuẩn –Actinomycetes KNO3 K2HPO4 MgSO4.7 H2O NaCl FeSO 4.7H2O Agar Tinh Bột Nước Cất pH 1,0 0,5 0,5 0,5 0,01 15,0 20,0 1lít 7,4 4.4.2 Môi trường Czapek ( g.l-1 ) : dùng để nuôi cấy vi nấm NaNO3 3,0 K2HPO4 1,0 KCl 0,5 MgSO4.7H2O 0,5 Sacarose 30,0 FeSO4 0,01 Agar 20,0 Nước cất 1lít * Làm chua 1,8ml acid lactic sau khử trùng 4.4.3 Môi trường TPA + MN (nước chiết thịt – pepton – agar + nước mạch nha) dùng để xác định nhóm vi khuẩn amon hoá hình thành bào tử Thành phần môi trường (g.l-1) Cao thịt Cao maïnh nha Pepton NaCl Agar pH 3 5.0 2.5 20.0 – 7.2 3.4.4 Môi trường TAA ( tinh bột + amon + agar ( thạch )) dùng để xác định nhóm vi khuẩn sử dụng nitơ khoáng Thành phần môi trường (g.l-1) Tinh bột (NH4)2SO4 K2HPO4 MgSO4.H2O NaCl CaCO3 Agar Nước cất pH 10.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 15 1lít 7.0 4.4.5 Môi trường Hutchinson ( g.l-1 ) : dùng để xác định vi sinh vật phân giải cellulose) KNO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl FeCl3 Agar Nước cất pH 2.5 1.0 0.3 0.1 0.1 0.01 15.0 1lít 7.2 –7.3 Dùng NaCO3 20% để điểu chỉnh pH 4.4.6 Môi trường pikovskaia (g.l-1) : dùng để xác định nhóm vi sinh vật phân giải hợp chất phosphore khoù tan Glucoza Ca3(PO4)2 (NH4)2 SO4 NaCl MgSO4 KCl Cao nấm men MnSO4 FeSO4.7H2O Agar Nước cất pH 10.0 5.0 0.5 0.2 0.1 0.2 0.5 Vết Vết 20g lít 7.0 4.4.7 Môi trường Ashby (g.l-1) : dùng để xác định nhóm vi sinh vật cố định nitơ sống tự đất Matitol ( Glucose ) K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl CaSO4 CaCO3 Agar Nước cất pH 20.0 0.2 0.2 0.2 0.1 5.0 20.0 lít 6.5 – 7.0 4.4.8 Môi trường dịch thể Vinograsdski (g.l-1) : dùng để xác định Clostridium pasteurianum – vi khuẩn cố định nitơ tự sống điều kiện yếm khí Glucose K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl 10.0 1.0 0.5 0.5 FeSO4 MnSO4 Nước cất pH Vết Vết lít 6.8 – 7.2 BÀI PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG Nguyên tắc Có thể khử trùng số tác nhân lý hoá nhiệt độ, xạ, lọc hoá chất Nhiệt độ cao tiêu diệt vi sinh vật cách làm biến tính enzyme, nước oxy hóa thành phần tế bào; nhiệt độ thấp ức chế tăng trưởng chúng Có thể khử trùng phương pháp nhiệt khô (sấy 1700C giờ; đốt) nhiệt ẩm (đun 630C 30 phút 720C 15 phút để diệt vi sinh gây bệnh vi sinh gây hỏng thực phẩm; đun sôi 1000C 10 phút để diệt tế bào sinh dưỡng hấp nước 1atm, 1210C 15 – 30 phút để tiệt trùng hoàn toàn) Năng lượng chiếu xạ bước sóng ngắn (tia X, tia gamma) có khả ion hoá phân tử nước tạo gốc tự tác dụng phá huỷ DNA, màng lipid, protein tế bào; tia xạ có bước sóng dài tia tử ngoại tác dụng ion hoá cảm ứng việc tạo thành liên kết base T nucleic acid tạo nên đột biến, gây chết tế bào Các dịch lỏng khử trùng cách lọc qua màng có kích thước giới hạn (0.2μm), cho phép dịch lỏng qua giữ lại tất vi khuẩn vi sinh vật có kích thước lớn Nhiều hoá chất kiểm soát tăng trưởng vi sinh vật Ethylen oxide, triethyl glycol, chất diệt khuẩn, kháng sinh,…được sử dụng để khử trùng, ức chế sống tăng trưởng vi sinh vật Tác nhân khử trùng tuỳ chọn tuỳ vào mục đích vật liệu cần khử trùng Trường hợp cần khử trùng môi trường nuôi vi sinh vật, phương pháp nhiệt ẩm nồi áp suất (1amt, 1210C) thường sử dụng để thành phần hữu môi trường không bị cháy, biến tính nước Trường hợp môi trường chứa chất phân tử lượng nhỏ vitamin, amino acid, huyết chứa protein nhân tố tăng trưởng, phương pháp nhiệt ẩm làm biến tính thành phần này, nên thành phần thường khử trùng riêng phương pháp lọc qua màng Các dụng cụ thuỷ tinh bền với nhiệt nên thường khử trùng phương pháp nhiệt khô tủ sấy Các gạt thuỷ tinh khử trùng cách đốt với cồn 700 que cấy kim loại khử trùng cách đốt trực tiếp lửa 1.1 Khử trùng môi trường nồi hấp áp lực Phương pháp khử trùng gọi phương pháp nhiệt ẩm Khi nhiệt độ tăng cao áp suất tăng lên Phương pháp cho phép diệt tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử vi sinh vật Quá trình tiến hành qua bước: - Kiểm tra bổ sung nước nồi hấp vạch quy định - Xếp dụng cụ vật liệu cần khử trùng vào giá đặt, không nên xếp chặt để nước lưu thông dể dàng - Đậy kín nắp nồi, nồi có ốc vặn phải vặn theo cặp đối xứng - Bật công tắc điện bắt đầu đun nồi hấp - Khi áp suất nồi lên đến áp suất cần hấp bắt đầu tính thời gian 1.0 KH2PO4 MgSO4- 7H2O 0.5 Pepton 5.0 Glucose 10.0 Agar 20.0 Rose bengal 1ml độ pha loãng 1: 300 cho 100ml môi trường Streptomycin 30 microgam/ml môi trường Nước cất lít Pha rose bengal streptomycin pha loãng nước cất, pha 1g rose-bengal 300ml nước cất Sử dụng 1ml dung dịch (1:300) cho 100ml môi trường Chuẩn bị dung dịch streptomycin : lấy 0,3 g streptomycin cho vào bình định mức 100ml lên thể tích nước cất, khử trùng dung dịch, cất bảo quản tủ lạnh sử dụng lấy 1ml cho vào 100ml môi trường Như ta 30 microgam streptomycin/ml môi trường Môi trường : môi trường Czapek ( g.l-1 ) : NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4.7H2O Sacarose FeSO4 Agar Nước cất 3.0 1.0 0.5 0.5 30.0 0.01 20.0 1lít Sau khử trùng, môi trường làm chua cách cho 1.8 ml acid lactic Sau 2- ngày đếm sơ khuẩn lạc vi nấm Sau 5- ngày phân biệt rõ đến giống : penicillium, Aspergillus, Fusarium, Alterharia… Môi trường 3: pepton – glucose – agar (g.l-1) Glucose Pepton KH2PO4 MgSO4.7H2O Agar Nước cất 10.0 5.0 1.0 0.5 20.0 1lít Khi sử dụng xong nhiệt độ môi trường ổ định 480C thí nên thêm 1ml H2SO4 0,5N/100ml môi trường sử dụng Môi trường : khoai tây – glucose - agar ( g.l-1) 200g khoai tây 500ml nước cất cho vào bình tam giác khử trùng 1h lọc qua vải lấy nước thêm 20g glucose + 15g agar bổ xung nước cất cho đủ lít, khử trùng sử dụng 21 Để ức chế phát triển vi khuẩn việc sử dụng rose bengal streptomycin sử dụng chất khác NaCNS (0,25- 0,4 g/lít) oxytetracylin , clotetracylin (2- 5mg/lít ), neomycin, polymycin,…(50mg/lít) Sau thời gian nuôi cấy tủ ấm ,chọn hộp petricó nấm phát triển từ 10-100 CFU /hộp petri để xác định Tính toán kết số lượng nấm/g đất khô tương tự vi khuẩn xạ khuẩn III Xác định vi sinh vật tổng số môi trường TPA : nước chiết thịt ( T) pepton (P) – agar (A-thạch ) Đây môi trường giàu chất dinh dưỡng cho phép phát triển nhiều lọai vi sinh vật dị dưỡng, có nhiều nhóm sinh lý nhóm phân lọai khác vi sinh vật phát triển môi trường Các vi khuẩn gram âm không sinh nội bào tử thuộc giống Pseudomonas Achromobacter, trực khuẩn gram dương sinh bào tử thuộc lọai giống Bacillus, cầu khuẩn thuộc giống Micrococcus Sarcina, lọai vi khuẩn phân nhánh (giống Mycobacterrium) số xạ khuẩn bậc cao (giống Actinomyces, streptomyces) nấm khuẩn ty :Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Alternaria Thành phần môi trường TPA (g.l –1) Cao thòt Pepton NaCl Agar pH 3.0 10.0 5.0 20.0 7.4 – 7.6 điều chỉnh NaOH 10% Các bước tiến hành chuẩn bị nuôi cấy trình bày phần I Nhiệt độ nuôi cấy 27- 30 C, đếm kết vào ngày thứ thứ Sau xác định tổng số vi sinh vật, tiến hành xác định số lượng riêng biệt nhóm vi sinh vật hình thành bào tử không hình thành bào tử PHẦN THỰC HÀNH Sinh viên tiến hành phân lập nuôi cấy vi khuẩn môi trường sau: Môi trường Gause (dùng để nuôi cấy xạ khuẩn) Môi trường Czapek (dùng để nuôi cấy vi nấm) Viết báo cáo kết đạt 22 Bài NHÓM VI KHUẨN AMON HOÁ VÀ VI KHUẨN SỬ DỤNG NITƠ KHOÁNG I Xác định số lượng nhóm vi khuẩn amon hóa hình thành bào tử (Bacillus ) Dịch nuôi cấy sau pha loãng độ pha loãng, khác cần phải diệt vi khuẩn không định hình thành bào tử cách đặt ống thí nghiệm có chứa dung dịch pha loãng vào nước nóng 800C thời gian 10 phút, sau thời gian khử trùng dịch nuôi cấy lại vi sinh vật hình thành bào tử Môi trường 1: TPA + MN (nước chiết thịt – pepton – agar + nước mạch nha) Thành phần môi trường (g.l-1) Cao thịt Cao mạnh nha Pepton NaCl Agar pH 3.0 3.0 5.0 2.5 20.0 – 7.2 Cao thịt cao mạch nha theo tỉ lệ 1:1 Nhiệt độ nuôi cấy : 27 – 300C, xác định sau 48 giờ, đếm khuẩn lạc lạc sơ bộ, sau để tủ ấm điều kiện nhiệt độ phòng để nhóm vi sinh vật tự phân ly đến loài - B mycodes : khuẩn lạc nhẵn , phát triển lan bò khắp bề mặt môi trường - B cereus : khuẩn lạc nhẵn, phân chia hình sóng mép ngòai khuẩn lạc - B magatherium : khuẩn lạc nhẵn, nhày - B aglomeratus : khuẩn lạc nhỏ, màu trắng hay xám trắng, có màu xanh xám xung quanh khuẩn lạc - B idosus : khuẩn lạc có màu vàng xám, khô tạo thành màng môi trường nuôi cấy - B mensentericus, B subtilis : khuẩn lạc nhăn nheo, khô màu xám sáng hay màu vàng cafe Môi trường : Vi khuẩn hình thành bào tử háo khí (g.l-1) : Agar Pepton Nước cất pH 20.0 1.0 lít 6.8 – 7.0 dùng NaOH 10% để điều chỉnh Dịch nuôi cấy phải diệt vi sinh vật không hình thành bào tử Nuôi tủ ấm nhiệt độ 300 C Sau ngày xác định 23 II Xác định nhóm vi khuẩn sử dụng nitơ khoáng Môi trường TAA ( tinh bột - amon - agar ( thạch ) Thành phần môi trường (g.l-1) Tinh bột (NH4)2SO4 K2HPO4 MgSO4.H2O NaCl CaCO3 Nước cất pH 10.0 1.0 1.0 1.0 1.0 3.0 1lít 7.0 Phần thực hành Sinh viên tiến hành việc phân lập nuôi cấy vi khuẩn môi trường sau: Môi trường TPA + MN (dùng để xác định nhóm vi khuẩn amon hóa hình thành bào tử Môi trường TAA (dùng để xác định nhóm vi khuẩn sử dụng nitơ khoáng) Viết báo cáo kết đạt Bài VI SINH VẬT PHÂN GIẢI CELLULOSE VÀ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI HP CHẤT PHOSPHORE I Xác định vi sinh vật phân giải cellulose Lấy mẫu chuẩn bị phân tích phần I Thiết bị dụng cụ : thông thường chuẩn bị để phân tích nhóm sinh vật khác phòng thí nghiệm - Cần phải chuẩn bị : giấy lọc có đường kính tương đương với đường kính hộp petri Môi trường : môi trường Hutchinson - Thành phần môi trường ( g.l-1 ) KNO3 K2HPO4 MgSO4 CaCl2 NaCl FeCL3 Agar Nước cất PH 2.5 1.0 0.3 0.1 0.1 0.01 15.0 1lít 7.2 –7.3 Dùng NaCO3 20% đển điểu chỉnh pH 24 Khử trùng nồi hấp với áp suất atm thời gian 30 phút Đổ môi trường vàp hộp lồng chuẩn bị môi trường dạng lỏng (450C) điều kiện vô trùng, việc cấy ghép dịch huyền phù độ pha loãng thích hợp vào hộp petri, tiến hành phần I, sau cấy dịch huyền phù vào hộp petri, ta dùng kẹp sắt vô trùng gắp giấy lọc tròn (tương đương với độ rộng hộp petri) vô trùng đặt lên bề mặt thạch hộp dùng que cấy vi sinh vật giấy lọc cho giấy lọc phải ép sát vào bề mặt thạch hộp Đặt vào tủ ấm, nuôi cấy nhiệt độ 28 – 300 C sau 10 - 14 ngày đêm xác định kết Đánh giá kết : vi sinh vật phân giải cellulose tính khuẩn lạc mọc khoang giấy lọc, số lượng vi sinh vật (B) 1g đất khô (cơ chất) tính theo công thức A.DF B= W Trong : A : Số lượng khuẩn lạc trung bình /hộp petri DF : Độ pha loãng W : Trọng lượng khô 1g mẫu đất (cơ chất) phân tích Công thức tính độ ẩm đất A% = m1 − m2 x100 m2 m1 : khối lượng đất trước sấy m2 : khối lượng đất sau sấy Công thức tính số lượng tế bào vi sinh vật có gam đất khô tuyệt đối X 100 100 − D Y : số lượng tế bào vi sinh vật có gam đất khô tuyệt đối X : Số lượng tế bào vi sinh vật có gam đất ban đầu D : Độ ẩm đất (%) Y= Chú ý Số lượng khuẩn lạc trung bình tính trung bình cộng số khuẩn lạc hộp cấy từ độ pha loãng, tính hộp lồng chứa từ 15 – 300 khuẩn lạc - Số lượng khuẩn lạc trung bình tính từ trung bình cộng số khuẩn lạc hộp cấy từ độ pha loãng cách tính số khuẩn lạc trung bình độ pha loãng số khuẩn lạc độ pha loãng cao nhân với 10, sau lấy trung bình cộng hai giá trị nêu tỉ số giá trị lơn giá trị nhỏ không lớn Nếu tỉ số lớn hai lấy giá trị nhỏ làm kết - Số lượng vi sinh vật /g đất ( ml dịch ) biểu thị số 1.00 9.99 nhân với 10n , n số mủ thích hợp 10 25 II Xác định số lượng nhóm vi sinh vật phân giải hợp chất phosphore khó tan Việc kiểm tra đánh giá có mặt nhóm vi sinh vật phân giải hợp chất lân khó hoà tan đất, tiến hành thủ tục lấy mẫu chuẩn bị mẫu để phân tích phần I - Môi trường sử dụng để xác định số lượng vi sinh vật phân giải hợp chất phosphore khó tan : Môi trường pikovskaia - Thành phần môi trường (g.l-1) Glucose Ca3(PO4)2 (NH4)2 SO4 NaCl MgSO4 KCl Cao naáu men MnSO4 FeSO4.7H2O Agar Nước cất pH 10.0 5.0 0.5 0.2 0.1 0.2 0.5 Vết Vết 20g lít 7.0 Khử trùng môi trường 1atm (1210C) 30 phút Kiểm tra độ vô trùng môi trường sau ngày để tủ ấm, nhiệt độ 280 - 300C, thủ tục cấy tiến hành phần I Tính kết : Chỉ đếm vi sinh vật có vòng phân giải bao quanh khuẩn lạc, vi khuẩn vòng bao quanh khuẩn lạc vi sinh vật tạp, loại bỏ Chỉ tính kết hộp petri có chứa 20 – 300 khuẩn lạc Số vi sinh vật /g (ml) đất hay chất tính theo công thức phần I PHẦN THỰC HÀNH Sinh viên tiến hành phân lập, nuôi cấy tính toán số lượng vi sinh vật môi trường sau: Môi trường Hutchinson (dùng để xác định vi sinh vật phân giải cellulose) Môi trường pikovskaia (dùng để xác định nhóm vi sinh vật phân giải hợp chất phosphore khó tan) Viết báo cáo kết đạt 26 Bài PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ NHÓM VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH NITƠ SỐNG TỰ DO TRONG ĐẤT I Azotobacter Là vi sinh vật cố định nitơ tự điều kiện hiếu khí đất, thường gặp là: A chrococum, A agile, A vinelandii Sau số môi trường để xác định số lượng phân lập Azotobacter Môi trường : môi trường (g.l-1) Matitol (Glucose) K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl CaSO4 CaCO3 Agar Nước cất pH Môi trường (g.l-1 ) Matitol ( Glucose) K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Cao naám men Agar Nước cất pH Công gô đỏ 1% 20 0.2 0.2 0.2 0.1 5.0 20.0 lít 6.5 – 7.0 10.0 0.5 0.2 0.1 1.0 20.0 lít 6.8 2.5 ml Môi trường : Môi trường Beijerinsk (g.l-1): Matitol ( Glucose) 20.0 K2HPO4 CaCO3 Agar 0.2 5.0 15.0 27 Môi trường : môi trường vinogradski (g.l-1) Nước cất Manitol ( sacaroza) K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl MnSO4 (NH4)2MoO4 FeSO4.7H2O CaCO3 Agar lít 20.0 0.5 0.3 0.3 Vết Vết Vết 3.0 20.0 Môi trường 5: Môi trường Burk (g.l-1) Nước cất Sacarose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4.7H2O NaCl 1lít 20.0 0.64 0.16 0.2 0.2 Na2MoO4 Veát CaSO4.2H2O 0.05 FeSO4.7H2O 0.03 Agar 20.0 Khử trùng môi trường điều kiện at (1210C) 30 phút, phân chia môi trøng vào hộp petri khử trùng Kiểm tra độ môi trường sau ngày để tủ ấm nhiệt độ 280- 300C Chỉ sử dụng hộp petri chứa môi trường không phát thấy tạp nhiễm Mọi thao tác chuẩn bị mẫu phân tích tiến hành theo phần I Một phương pháp khác để xác định có mặt Azotobacter đất, phương pháp cấy núm đất bề mặt môi trường (xem hình dưới) 28 Nguyên tắc phương pháp : đếm xuất Azotobacter núm đất cấy môi trường thạch cứng, từ đánh giá tỉ lệ % xuất hiện, kết luận mức độ giàu, nghèo Azotobacter có đất nghiên cứu Bước tiến hành : Cân 1g đất nghiên cứu cho vào đóa kính khuấy nhão thành chất sền sệt Dùng que cấy 50 núm đất môi trường thạch cứng hộp petri vị trí hộp petri, nuôi tủ ấm 28- 300C Sau ngày xác định % núm đất có khuẩn lạc Azotobacter phát triển (tạo thành núm nhầy màu nâu) II Xác định Clostridium Pasteurianum Là vi khuẩn cố định nitơ tự sống điều kiện yếm khí, phân bố rộng đất Môi trường kiểm tra : môi trường dịch thể Vinograsdski (g.l-1) Glucose K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl 10,0 1,0 0,5 0,5 FeSO4 MnSO4 Nước cất Vệt Vệt lít Cho vào ống nghiệm lượng nhỏ CaCO3, sau cho vào môi trường khử trùng, sau khử trùng cấy dịch thể nghiên cứu vào Nuôi tủ ấm 28- 300C, sau 4-7 ngày xác định Trong trường hợp phát thấy C pasteurianum ống nghiệm có bọt ván Tính kết theo bảng MPN ( Most Probable Numbers ) III Phương pháp lấy mẫu phân tích vi sinh vật vùng rễ Vi sinh vật phát triển xung quanh hệ thống rễ trồng gọi vi sinh vật vùng rễ phân chia làm vùng phát triển : 29 Vùng rễ: Vi sinh vật phát triển triển trực tiếp bề mặt rễ rễ trồng Vùng cạnh rễ : vi sinh vật vùng phát triển đất, trực tiếp cạnh rễ (đất bám rễ) Vùng xung quanh rễ : vi sinh vật phát triển đất xung quanh rễ trồng, cách rễ 1cm Do quy định mà việc lấy mẫu phân tích phải cẩn thận Cách lấy mẫu tiến hành sau : dùng tay xắn vào đất (nếu đất lúa, dùng xẻng, dao …) xung quanh trồng theo cỡ 15 x15 20x20 x15 –20 cm, lấy đất lên Dùng nilon gói phần phần đất rễ mang phòng thí nghiệm xủ lý (thường phải xử lý ngày lấy mẫu) Cho khối đất có rễ ngâm vài vào bình đựng nước sau nhấc nhẹ nhàng khỏi đất, rửa nước vài lần Sau nhặt rễ chết vức chuyển sang bình rộng hơn, rửa nước vô trùng, sau dùng kéo, dao vô trùng cắt nhỏ thành đoạn để giấy lọc Từ đoạn rễ cân 1g cho vào đóa thuỷ tinh chuyển sang nghiền cối sứ vô trùng, chuyển dịch vào bình có chứa 100ml nước cất vô trùng, lắc phút, sau lắng khoảng phút chuẩn bị dịch pha loãng (1:100;1:1000 ) để xác định vi sinh vật rễ Để xác định vi sinh vật đất cạnh rễ ta làm sau : Khi để đất vào bình vài giờ, ta lấy kéo theo đất bám phần rễ, đặt vào bình khác có nước vô trùng , lắc nhẹ thời gian phút, sau nhận dịch đất để lắng, lấy cặn phân tích vi sinh vật độ ẩm, nhẹ nhàng dùng dụng cụ vô trùng gạt lấy đất bám vào rễ Xác định vi sinh vật vùng đất xung quanh rễ, việc lấy đất vùng xa rễ, không tiếp giáp với rễ, bước tiến hành chuẩn bị mẫu để phân tích phần I Nuôi cấy vi sinh vật vùng rễ thường tiến hành môi trường sau : TPA, TAA Trên môi trường TPA thường xác định nhóm vi khuẩn huỳnh quang mang sắc tố (vàng, khuẩn lạc màu đỏ sáng), môi trường TAA thường phát thấy vi khuẩn mang sắc tố màu vàng xạ khuẩn Phần thực hành Sinh viên tiến hành phân lập nuôi cấy vi khuẩn môi trường sau: Môi trường Ashby (dùng để xác định nhóm vi sinh vật cố định nitơ sống tự đất) Môi trường dịch thể Vinograsdski (dùng để xác định Clostridium pasteurianum sống đất điều kiện yếm khí) Viết báo cáo kết đạt Bài 10 30 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP ESCHERICHIA COLI (E coli) E.coli dạng coliform có nguồn gốc từ phân phát triển 44±0.5oC, sinh indol, sinh nhiều acid, không sinh aceoin không dùng citrate làm nguồn carbon Nguyên tắc: E.coli phát khả lên men lactose sinh 44±0.5oC có kết nghiệm pháp IMVIC phù hợp Vật liệu - Pipette khắc vạch 10 ml – ml vô trùng - Que cấy, đèn cồn - Nước muối sinh lý 8.5% đóng ống ml vô trùng - Canh thang Lactose loãng đóng ống có ống sinh hôi - Canh thang BGBL (Brilliant Green Bile Lactose 2%) - Thạch EMB Agar Môi trường nuôi cấy + Canh thang lactose broth (g.l-) Nước chiết thịt 3g Bacto pepton 5g Lactose 5g Nước cất 1000ml pH 6.9 + Môi trường tăng sinh: BGBL (g.l-) Pepton Lactose Mật boø Vebrilliant green pH 10g 10g 20g 0.0133g 7.2 + Môi trường EMB Agar (g.l-) Bacto pepton Lactose K2HPO4 Agar Saccarose Eurin Methylen Blue Nước cất pH 10g 10g 2g 13.5g 5g 0.4g 0.065g 1000ml 7.1 Phần thực hành 31 - Chuẩn bị mẫu: chọn độ nuôi cấy tùy theo loại nước Dùng pipette hút mẫu pha loãng nồng độ khác Cấy chuyển vào ống nghiệm lactose theo mức pha loãng Để tủ ấm 37oC 24-48h Dùng que cấy cấy chuyển ống dương tính vào môi trường BGBL Để tủ ấm 37oC 24-48h Cấy chuyển vào môi trường thạch EMBA ống dương tính Để tủ ấm 37oC 24h lấy đọc kết Trên mặt thạch xuất khuẩn lạc ánh kim 32 Quy trình nuôi cấy 33 Bảng tính số lượng vi khuẩn dựa vào kết kiểm nghiệm Số lượng ống có sinh khí ống có 10 ml ống có ml ống có 0.1 ml 0 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 0 1 0 1 2 0 1 2 3 0 1 0 1 1 2 2 Số lượng /100 ml 3 7 11 11 14 15 20 21 28 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1100 Viết báo cáo kết đạt 34 95% giới hạn tin tưởng Cận