Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus kháng vibrio gây bệnh trên tôm sú (penaeus monodon)

Mục tiêu chung của đề tài là: lựa chọn được những chủng Bacillus kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú để đưa vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao năng suất và phá

 TS Nguyễn Văn Duy, người thầy đã nhiệt tình chỉ bảo, hướng dẫn chính cho tôi

 Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện khóa luận tại trường

 Chị Nguyễn Minh Nhật – Cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm luận văn tại phòng thí nghiệm

 Các bạn trong nhóm sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học của khóa 48, 49, 50 Viện Công nghệ sinh học và môi trường, đã giúp đỡ nhiều cho tôi Các bạn lớp 48 CNSH, phòng 304.K5 – những người bạn đồng hành luôn bên cạnh và giúp

đỡ tôi trong suốt 4 năm học tập và sống tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

Cuối cùng, gia đình và người thân luôn là những người tôi khắc ghi sự biết ơn vô hạn vì công lao sinh thành, nuôi dưỡng, và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

Nha Trang, 25/6/2010

Sinh viên

Dư Thị Lưu

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về Vibrio 2

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Vibrio 2

1.1.2 Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản 3

1.2 Tổng quan về Bacillus 9

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus 9

1.2.2 Bacillus – nhóm vi khuẩn đối kháng Vibrio 10

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus kháng Vibrio trên tôm nuôi 13

1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài 13

1.3.2 Những nghiên cứu ở trong nước 14

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Vật liệu 16

2.1.1 Mẫu tôm sú 16

2.1.2 Môi trường 16

2.1.3 Thiết bị chuyên dụng: 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 17

2.2.1 Phân lập Bacillus 17

2.2.2 Nuôi cấy và bảo quản các chủng Bacillus 17

2.2.3 Phân lập Vibrio 18

2.2.4 Nuôi cấy và bảo quản các chủng Vibrio 18

2.2.5 Tuyển chọn các chủng Bacillus kháng Vibrio 18

2.2.6 Nhuộm Gram 19

2.2.7 Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi 19

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 Phân lập Bacillus từ mẫu tôm sú 20

3.2 Phân lập Vibrio từ mẫu tôm sú 21

3.3 Tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính kháng Vibrio 22

3.3.1 Tuyển chọn vòng 1 - khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio 22

3.3.2 Tuyển chọn vòng 2 – khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio 24

3.3.3 Khả năng kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus theo thời gian nuôi cấy 25

3.4 Đặc điểm sinh học của 4 chủng Bacillus được tuyển chọn 28

3.4.1 Đặc điểm nuôi cấy 28

3.3.2 Đặc điểm hình thái 29

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

(Đơn vị hình thành khuẩn lạc)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 Số lượng các chủng Bacillus trên tôm sú 20 Bảng 2 Số lượng các chủng Vibrio trên tôm sú 21 Bảng 3 Hoạt tính kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng Bacillus

trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC 23

Bảng 4 Hoạt tính kháng 6 chủng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường

LB, ở nhiệt độ 37oC 25

Bảng 5 Hoạt tính kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB sau

24h nuôi cấy, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC 26

Bảng 6 Đặc điểm hình thái của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7, B 3.10)

sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng

Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn

(D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC 23

Hình 2 Khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio (V 1.1, V 1.3, V 2.1, V 2.4, V 3.1 và

V 3.3) của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính

vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC 25

Hình 3 Hoạt tính kháng Vibrio V 1.3 của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7

và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC 27

Hình 4 Vòng kháng Vibrio V 1.1 của 4 chủng Bacillus lựa chọn sau 24h nuôi

cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC 27

Hình 5 Vòng kháng Vibrio V 1.1 của chủng Bacillus B 1.1 sau 24h nuôi cấy

trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC 28

Hình 6 Khả năng sinh trưởng của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B

3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ

28 – 30oC 29 Hình 7 Tế bào nhuộm Gram của chủng B 2.2 sau 24h nuôi cấy trên môi trường

LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC 30 Hình 8 Tế bào nhuộm Gram của chủng B 1.1 sau 24h nuôi cấy trên môi trường

LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC 30 Hình 9 Khuẩn lạc chủng B 3.7 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ

37oC 31 Hình 10 Khuẩn lạc chủng B 3.10 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt

độ 37oC 31

MỞ ĐẦU

Nuôi trồng thủy sản được phát triển rất mạnh ở các nước châu Á, Mỹ La tinh và Đông Nam Á Ở Việt Nam, năm 2002 chính phủ quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên, trong đó ngành nuôi tôm là ngành mũi nhọn, nhằm mục đích: tăng kim ngạch xuất khẩu, chuyển đổi cơ cấu kinh tế, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao hiệu quả sử dụng đất và tạo công ăn việc làm cho người lao động Năm 2002, Việt Nam đã xuất khẩu trên 2

tỷ USD từ sản phẩm thủy sản, trong đó tôm chiếm 50%, đứng hàng thứ 5 trên thế giới, và đang phấn đấu đạt 4,5 – 5 tỷ USD vào năm 2010 Năm 2004 sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt mức 1,4 triệu tấn/năm, chiếm 68% tổng sản lượng thủy sản Diện tích nuôi trồng thủy sản mỗi năm một tăng, tính đến năm 2005 đạt 750 nghìn ha (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

Tôm sú (tên khoa học: Penaeus monodon) là một loài động vật giáp xác được nuôi

để lấy thực phẩm P monodon là loài tôm được nuôi rộng rãi nhất trên thế giới Hàng năm

hơn 900.000 tấn tôm sú được tiêu thụ, hai phần ba số đó đến từ các trại tôm ở Đông Nam

Á

Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam (VASEP), năm 2009 tôm

là mặt hàng thủy sản xuất khẩu duy nhất tăng cả về lượng và giá trị so với năm 2008 và đưa ra dự báo: năm 2010, tôm sú vẫn là sản phẩm xuất khẩu chủ lực, kim ngạch dự kiến sẽ đạt 1,4 tỉ USD

Tuy nhiên, ngành nuôi trồng thủy sản đang gặp khó khăn lớn dẫn đến thất bại ở nhiều cơ sở nuôi trồng Nguyên nhân chính là do ô nhiễm môi trường nước ao nuôi, dịch bệnh và hệ thống sinh thái bị phá hủy Vấn đề ô nhiễm nước ao nuôi là do lượng thức ăn thừa tôm không sử dụng được lớn, tôm bài tiết, lột xác nhiều và xác của những động vật thủy sinh phù du trong môi trường nhiều Khi ao nuôi bị ô nhiễm là cơ hội cho những nhóm vi sinh vật có hại phát triển mạnh mẽ, không kiểm soát được và hậu quả là vật nuôi

bị bệnh Vì vậy, việc xử lý môi trường trong quá trình nuôi nhằm cải thiện môi trường nước và phòng bệnh là cấp thiết

Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, nhất là ở tôm sú Các bệnh vi khuẩn đó là bệnh đầu vàng, thân đỏ, đốm trắng và phát sáng Các bệnh này càng trở nên nghiêm trọng do ảnh hưởng của hiện tượng El Nino làm tăng

nhiệt độ môi trường, trong đó bệnh phát sáng hiện đang gây hậu quả rất nặng nề Bệnh này

do nhóm vi khuẩn Vibrio gây ra ở tôm sú và một số loài tôm khác Bệnh xuất hiện từ giai

đoạn ấu trùng, tôm bột đến tôm trưởng thành ở trong cả bể ương và ao nuôi

Trước đây, người nuôi thường sử dụng hóa chất, kháng sinh để xử lý môi trường ao nuôi và phòng bệnh Nhưng dùng nhiều hóa chất và kháng sinh gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và con người Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc kháng sinh còn gây ra vấn đề về dư lượng kháng sinh trong vật nuôi, vi phạm vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Do đó, cần chọn một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: phân hủy các chất hữu cơ thừa, đối kháng với vi khuẩn gây bệnh…đã được áp dụng Một trong những

nhóm vi khuẩn có những đặc tính này là vi khuẩn Bacillus

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon)”

Mục tiêu chung của đề tài là: lựa chọn được những chủng Bacillus kháng Vibrio

gây bệnh trên tôm sú để đưa vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao năng suất và phát triển bền vững cho ngành nuôi trồng thủy sản nói chung, nghề nuôi tôm sú nói riêng

Mục tiêu cụ thể của đề tài là:

 Phân lập các chủng Bacillus và Vibrio trong ruột tôm sú

 Tuyển chọn các chủng Bacillus đối kháng Vibrio gây bệnh trên tôm sú

 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Bacillus lựa chọn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về Vibrio

1.1.1 Đặc điểm sinh học của Vibrio

Chi Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là nhóm vi khuẩn có dạng hình que hay hình dấu phẩy, kích thước tế bào 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6 µm Vibrio không hình thành bào tử và có khả năng chuyển động nhờ một tiên mao hay nhiều tiên mao mảnh (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

Là các vi khuẩn bắt màu Gram âm, sống kỵ khí tùy ý, có phản ứng catalase và oxidase dương tính, lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S (Trần Linh Thước,

2008) Hầu hết các loài của chi Vibrio đều phân bố trong môi trường nước mặn, thích hợp

ở 20 – 40‰, có loài còn có thể phát triển ở độ mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa

cho nghề nuôi động vật thủy sản biển, đặc biệt giáp xác nuôi ven biển và trên biển Môi

trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose) là môi trường chọn lọc của Vibrio spp Dựa vào màu sắc khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc này, Vibrio được chia làm 2 nhóm:

nhóm có khả năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu vàng; nhóm không có khả

năng lên men đường sucrose và có khuẩn lạc màu xanh lá cây Vibrio là vi khuẩn đặc trưng

cho vùng nước biển ấm, phát triển mạnh ở nhiệt độ 25 – 30oC (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) Các loài Vibrio có mật độ cao trong môi trường nước, bao gồm cả cửa sông, vùng

nước ven biển và trầm tích biển và khắp nơi trong nuôi trồng thủy sản Một số nghiên cứu

cho thấy Vibrio xuất hiện với mật độ dày đặc trong sinh vật biển, như san hô, cá, động vật thân mềm, tôm, cỏ biển, bọt biển và động vật nổi (Thompson và cs, 2004) Kết quả nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, vi khuẩn Vibrio tồn tại rất phổ biến ở nước biển ven bờ, mật độ Vibrio trong nước biển ven bờ có thể tăng lên nhiều lần vào các ngày biển động do bão, gió

mùa hay áp thấp nhiệt đới (Đỗ Thị Hòa, 1997)

1.1.2 Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản

Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi

khuẩn Vibrio spp gây ra Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp

hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường

như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

Vibrio là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với động vật nuôi thủy sản V anguillarum, V salmonicida, và V vulnificus là ba trong số những tác nhân gây bệnh chính cho vài loài cá, và V harveyi là tác nhân gây bệnh chủ yếu cho tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và tôm sú Penaeus monodon Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên

cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột

ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson và cs, 2004)

Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá và động vật thân mềm nước mặn phát triển, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi

thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

a) Tình hình dịch bệnh ở tôm sú nuôi trên thế giới và tại Việt Nam

Trong hơn một thập niên qua, sản lượng thủy sản từ khai thác và nuôi trồng tăng đáng kể đạt 120,7 triệu tấn năm 1995 Nếu tính từ năm 1989 sản lượng gia tăng hàng năm khoảng 15,6 triệu tấn Hầu hết sản lượng gia tăng đến từ nuôi trồng thủy sản (FAO, 1997) Riêng đối với nghề nuôi tôm, từ năm 1984 đến năm 1995 sản lượng tăng hàng năm khoảng 16,8%, trong đó chủ yếu là nghề nuôi tôm sú (sản lượng tôm sú nuôi trong năm

1995 chiếm khoảng 96,3% tổng sản lượng tôm nuôi)

Tuy nhiên từ năm 1990 - 1995 sản lượng tôm nuôi có xu hướng giảm sút do các nguyên nhân từ sự suy thoái môi trường, quản lý ao nuôi không hợp lý và sự thất thu do dịch bệnh (FAO, 1997) Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ 733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996

và đến năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn (World Shrimp Farming, 1997) Tại Việt Nam trong hai năm 1994 - 1995 hiện tượng tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994)

Các chương trình nghiên cứu trên tôm nuôi ở Đồng bằng Sông Cửu Long cho thấy các tác nhân gây bệnh chính bao gồm nhóm vi khuẩn vibrios và các virus quan trọng như MBV (Monodon Baculovirus) và WSSV (White Spot Syndrom Virus) (Nguyễn Văn Hảo

và cs, 1997) Sự giảm sút sản lượng tôm nuôi liên quan đến bệnh vi khuẩn thường do chính

nhóm vi khuẩn phát sáng gây ra (Ruangpan, 1987) Vấn đề này dường như khá phổ biến ở các nước châu Á, nơi mà việc nuôi tôm được xem là hoạt động chính yếu Dựa vào khoảng

49 đặc tính kiểu hình và khoảng 210 mẫu phân lập đại diện đã xác định vi khuẩn gây bệnh

là Vibrio harveyi, Vibrio cholerae dòng Albensis và Photobacterium leiognathi

Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa sông và vùng nước lợ (Sodthongkong, 1996) Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao

nuôi tôm có nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Sae-Oui và cs, 1987; Songsrem và cs, 1990; Ruangpan và cs, 1997) Chất thải từ hệ thống tiêu hóa, trứng của tôm mẹ được nghi

ngờ là nguồn chứa vi khuẩn phát sáng (Shariff và Subasinghe, 1992) Hơn nữa vùng gần

bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla - Pitogo và cs, 1990)

Trước đây, nhóm vibrios được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội, nghĩa là chỉ gây bệnh trong điều kiện môi trường xác định (Lightner, 1988) Tuy nhiên gần đây qua nhiều ổ dịch

xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra cho thấy loài này dường như được xem

là vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải là vi khuẩn cơ hội (Lightner và cs, 1992) Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng

b) Một số bệnh điển hình ở cá, tôm nuôi

Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi

động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ Ở Việt Nam ngay từ những năm 1989 – 1990, các nhà nghiên cứu đã phát hiện rằng: bệnh vibriosis, đặc biệt là bệnh phát sáng rất phổ biến trong các trại sản xuất tôm sú giống và trong ao nuôi thương phẩm ở Việt Nam, có thể gặp ở bất kì ở một cơ sở sản xuất nào (Đỗ Thị Hòa, 1995, 1997) Hầu như các loài động vật thủy sản nuôi nước lợ, mặn đều có thể bị nhiễm và chịu tác

hại của bệnh vibriosis, như: các loài tôm he và tôm thẻ (Lightner, 1996; Liopo và

cs, 2001) Các loài tôm hùm châu Mỹ và tôm hùm châu Á đều có thể nhiễm bệnh do Vibrio (Fisher, 1997; Roald, 1981; Bowser, 1981; Đỗ Thị Hòa, 2001) Các loài cua

biển cũng thường xuyên chịu ảnh hưởng của bệnh này: cua xanh đã bị chết với tỷ lệ

> 50% do Vibrio (Tukiash, 1970); loài cua đá đã bị chết do cảm nhiễm Vibrio ở

nhiệt độ 20oC sau 24h (Newman và Feng, 1982) Các loài cá biển nuôi có giá trị kinh tế ở khu vực châu Á như cá mú, cá chẽm, cá hồng… đều chịu tác hại của bệnh

này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cs, 2001) Một số bệnh ở động vật thủy sản do Vibrio gây ra như sau:

 Bệnh xuất huyết lở loét ở một số cá biển

Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều

quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường

bị bệnh này Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở

các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V alginolyticus,

và V anguillarum (Phan Thị Vân và cs, 2000) Ngoài ra có những thông báo khác

về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V anguillarum, V vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa

và cs, 2004)

 Bệnh hoại tử cục bộ ở giáp xác

Bệnh này còn có thể có các tên gọi khác: bệnh vỏ, bệnh đốm nâu, đốm đen, bệnh hoại tử phụ bộ Ở cua biển khi bị bệnh này gọi là bệnh rỉ sắt, bệnh hoa mai Giáp xác khi bị bệnh này thường có một số dấu hiệu sau: xuất hiện các vùng mềm trên vỏ kitin, sau đó tạo nên các điểm nâu, đen hay trắng, tại đó vỏ kitin bị ăn mòn, các phần phụ (chân bò, chân bơi, râu…) và đuôi tôm có thể phồng lên rồi mòn cụt dần Sắc tố Melanin bị khuếch đại, sự mờ đục của đốt bụng thứ 6 và xuất hiện sắc tố đen nâu trên mô gan tụy Bệnh này có thể xảy ra ở các giai đoạn khác nhau: tôm

mẹ, tôm thịt, ấu trùng và hậu ấu trùng trong các trại giống Cũng có trường hợp bệnh xảy ra kèm theo một số dấu hiệu khác trong các ao nuôi tôm như: tôm bị bệnh thường bẩn mình, bẩn mang, có màu hồng đỏ trên cơ thể, yếu, bỏ ăn rồi chết Có

nhiều loại Vibrio được phân lập từ bệnh này: Vibrio alginoliticus V

parahaemolyticus, V ordali,…(Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

 Bệnh phát sáng ở ấu trùng tôm

Trong nghề nuôi tôm hiện nay, vấn đề nổi bật nhất là bệnh tôm do vi khuẩn gây ra, nhất là ở tôm sú Trong thời gian gần đây nhiều bà con nuôi tôm sú bị thiệt hại nặng khi mua phải tôm sú giống nhiễm bệnh phát sáng

Khi tôm bị bệnh phát sáng thường yếu, lờ đờ, kém bắt mồi, nặng có thể bỏ ăn, trong bóng tối phát ra ánh sáng xanh liên tục Khi bệnh xảy ra trong các trại giống, tác hại thường lớn, đặc biệt ở các giai đoạn tiền ấu trùng như zoea, mysis Khi bệnh xảy ra ở dạng cấp tính có thể làm tôm ấu trùng chết hàng loạt, tỷ lệ chết có thể lên đến 100% trong bể ấp

do sự nhiễm khuẩn toàn thân Bệnh phát sáng thường gây tác hại lớn ở giai đoạn ấu trùng

và hậu ấu trùng Giai đoạn ấu niên trong ao nuôi thịt cũng có thể bị ảnh hưởng, nhưng tác

hại thấp hơn Từ mẫu tôm bị bệnh phát sáng người ta đã phân lập được Vibrio harveyi, V vulificus và V parahaemolyticus

Để phòng bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây ra người ta thường áp dụng

nhiều biện pháp khác nhau, như: làm tốt công tác vệ sinh trước và sau mỗi vụ nuôi, điều chỉnh độ mặn và nhiệt độ cho ao nuôi, xử lý môi trường trong các giai đoạn nuôi, tăng cường hệ miễn dịch cho động vật nuôi,…

Việc đầu tiên phải làm trước mỗi vụ nuôi là làm tốt công việc sát trùng bể, ao, dụng

cụ và nguồn nước trước mỗi đợt sản xuất Đối với ao nuôi phải cải tạo ao thật kỹ, vét sạch bùn đáy, bón vôi, phơi ao, khoáng hóa nền đáy tiêu diệt mầm bệnh Nguồn nước phải được sát trùng bằng các phương pháp khác nhau: phương pháp cơ học (lọc), phương pháp hóa học (xử lý bằng thuốc sát trùng), phương pháp lý học (sát trùng bằng đèn cực tím), phương pháp sinh học, phương pháp sinh thái để tiêu diệt và kìm hãm sự phát triển của

Vibrio…(Đỗ Thị Hòa và cs, 2004)

Độ mặn và nhiệt độ cao là điều kiện thuận lợi cho Vibrio phát triển mạnh Vì vậy

cần giảm độ mặn trong ao nuôi tôm thịt xuống 15 - 20‰ để kìm hãm sự phát triển của

Vibrio (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) Vào mùa hè nhiệt độ thường cao, để hạn chế khả năng

tăng nhiệt cần duy trì mức nước trong ao nuôi đạt độ sâu từ 1,2 - 1,5m

Ô nhiễm môi trường trong quá trình nuôi do lượng thức ăn dư thừa và do đông vật thủy sản thải ra là yếu tố nguy hiểm dẫn đến phát sinh dịch bệnh Cần xifon đáy và lọc nước để loại bỏ các chất hữu cơ lắng đáy và lơ lửng trong bể ấp và thay nước đáy trong ao

thâm canh Cần lựa chọn thức ăn có chất lượng tốt, xác định khẩu phần thức ăn chính xác, tránh dư thừa Với thức ăn tươi sống cần được sát trùng bằng một số thuốc diệt khuẩn (formalin, iodine) rồi rửa lại bằng nước sạch trước khi cho ấu trùng ăn Có thể dùng chế phẩm vi sinh (probiotic) để cân bằng sinh thái trong hệ thống nuôi và giảm lượng chất thải

hữu cơ trong ao, bể, kìm hãm sự phát triển của Vibrio gây bệnh Không dùng kháng sinh

(antibiotic) để phòng bệnh, có thể dùng chất khử trùng (formol, BKC…) để diệt khuẩn ngoài môi trường, nhưng phải lựa chọn nồng độ thuốc không ảnh hưởng tới vật nuôi và chỉ dùng khi thật sự cần thiết, coi đó chỉ là giải pháp cuối cùng Khi bệnh đã xảy ra, trước khi

xả bỏ, cần dùng thuốc diệt khuẩn (chlorine, formol) để sát trùng nước, diệt vi khuẩn (Đỗ

Thị Hòa và cs, 2004)

Có thể tăng hệ miễn dịch tự nhiên của động vật nuôi thủy sản bằng quản lý môi trường tốt và bổ sung một số sản phẩm như vitamin C, A, E sẽ kích thích cơ quan tạo kháng thể; hạn chế dùng hóa dược trong nuôi trồng thủy sản Một biện pháp hữu hiệu nhằm tăng sức đề kháng của tôm và các loài động vật thủy sản khác là sử dụng nhóm vi

sinh vật hữu ích gọi là vi sinh vật probiotic (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004) như Zymetin, Dikaku

và Biodream trộn vào thức ăn sẽ giúp cho động vật thủy sản tiêu hoá tốt Các vi sinh vật

này sẽ cạnh tranh thức ăn với các vi khuẩn Vibrio gây bệnh và chiếm địa bàn ở đường ruột của vật nuôi, loại bỏ vi khuẩn Vibrio gây bệnh trong ruột vật nuôi

Với hình thức nuôi các lồng bè, cần lựa chọn nơi đặt lồng có lưu tốc dòng chảy thích hợp để tăng trao đổi nước và loại bỏ các chất thải Thường xuyên làm vệ sinh thành lồng để giảm mật độ vi khuẩn trong lồng Tránh các xây xát do tác động cơ học và kí sinh

trùng Có thể treo túi sát trùng ở góc lồng để diệt khuẩn trong nước (Đỗ Thị Hòa và cs,

2004)

Như vậy để phòng trị bệnh cho động vật thủy sản do Vibrio gây bệnh gây ra cần

thực hiện tốt các biện pháp từ khâu chọn giống ban đầu, cải tạo ao loại bỏ hết các chất hữu

cơ vào đầu vụ và cuối vụ, thực hiện nuôi tôm trong độ mặn thấp, giữ nước có màu xanh vỏ đậu, hạn chế khả năng tăng cao nhiệt độ, không cho ăn dư, tăng cường sức khỏe tôm nuôi bằng thức ăn giàu dinh dưỡng, vitamine và bổ sung chế phẩm probiotic, xử lý môi trường nuôi và có mật độ nuôi phù hợp với trình độ quản lí …

Phương pháp trị bệnh

Khi bệnh vibriosis đã xuất hiện, có thể dùng kháng sinh để trị bệnh Tuy vậy cần

dùng thuốc theo hai hướng (Đỗ Thị Hòa và cs, 2004):

 Diệt vi khuẩn cảm nhiễm bên trong cơ thể bằng cách trộn kháng sinh vào thức ăn như một số kháng sinh thuộc nhóm sulpamid: sulfamethoxine, bactrim, cotrim: 15 – 20g/

kg thức ăn, cho tôm ăn liên tục trong 5 – 7 ngày; oxonilic acid 25%: 2 – 5g/ kg thức ăn, cho ăn trong 5 – 7 ngày

 Giảm mật độ vi khuẩn trong nước và cải thiện điều kiện môi trường bằng một số biện pháp kĩ thuật: xifon đáy, thay nước đáy, dùng một số loại thuốc diệt khuẩn như: benzalkonoum chloride (BKC), iodine… sau đó thay một phần nước trong ao, gây lại màu nước

Tuy vậy ở giai đoạn tiền ấu trùng và hậu ấu trùng, do sức chịu đựng của vật nuôi với thuốc rất kém và khi bệnh đã xảy ra cấp tính, phần lớn tôm trong bể ấp đã bỏ ăn, vì vậy dùng thuốc khó khăn và ít có hiệu quả

Với trình độ kĩ thuật như ngày nay, chưa có phương pháp điều trị nào có thể dập tắt

được các bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra cho động vật thủy sản nhưng có thể lựa chọn các

biện pháp khác nhau để khống chế và ngăn ngừa bệnh

1.2 Tổng quan về Bacillus

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, tế bào hình que và thẳng, kích thước 0,5 –

2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao, bắt màu Gram dương Các loài thuộc chi

Bacillus đặc trưng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào

tử, trong một số trường hợp chỉ hơi phình to lên một chút Mỗi tế bào sinh dưỡng thường chỉ hình thành một nội bào tử Nội bào tử của vi khuẩn được sinh ra không phải để sinh sôi nảy nở mà để chịu đựng với các điều kiện bất lợi Bào tử có màng nhiều lớp, chứa ít nước

tự do và do đó có thể chịu đựng tốt với nhiều tác động bất lợi có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng (Lương Đức phẩm, 1998; Gordon, 1973) Vi khuẩn dinh dưỡng theo kiểu hóa dưỡng hữu cơ, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh

hơn Các tế bào thường có hoạt tính catalase dương tính Nhiều loài Bacillus có khả năng

kháng nhiệt, các pH cực trị, điều kiện khô hạn, tính mặn, chất khử và các phân tử có hại khác (Gordon, 1973)

Chi Bacillus rất đa dạng về sinh lý và sinh thái Một số chủng là hiếu khí bắt buộc

nhưng một số khác lại là kị khí tùy tiện Các chủng của một số loài sinh trưởng tốt trong môi trường chứa glucose, amonium sulphate và một vài muối khoáng nhưng các chủng khác lại cần nhân tố sinh trưởng Về điều kiện pH, đa số các chủng sinh trưởng tốt ở pH 7

nhưng B alealophilus thì ở pH 9 – 10 và B acidocaldarius thì ở pH 2 – 6 Về nhiệt độ, các

vi khuẩn ưa nóng sinh trưởng thích hợp ở 45 – 75oC hoặc cao hơn, còn các vi khuẩn ưa lạnh sinh trưởng tốt từ - 5 đến 25oC (Gordon, 1973)

Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong đất, nước, không khí do có khả năng hình

thành nội bào tử và đời sống hiếu khí, một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật (Lương Đức phẩm, 1998)

Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ chứa nitơ, như

protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh ra amylase làm loãng tinh bột, biến chất này thành dễ hòa tan và thủy phân tiếp theo thành

các dextrin và các loại đường hợp thành Một số chủng thuộc loài Bacillus subtilis, B mesentericus… có thể có khả năng sinh ra enzym xenlulase và hemixenlulase phân hủy

xenlulose, hemixenlulose (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ngoài các enzym trên, các vi khuẩn còn có khả năng sinh ra bacterioxin – chất có

hoạt tính kháng sinh, như insulin, subtilin từ Bacillus subtilis, bacterioxin từ B licheniformis…Các chất có hoạt tính này thường không dùng trong y tế nên không xảy ra

hiện tượng nhờn thuốc đối với các vi sinh vật gây bệnh Riêng bacitraxin là chất kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi để ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột và kích thích tiêu hóa cũng như tăng trọng của vật nuôi (Lương Đức Phẩm, 1998)

Khả năng gây bệnh của chi Bacillus đối với các sinh vật khác là không phổ biến

Có 4 loài B theringiensis, B larvae, B popilliae, B lentimorbus và một số chủng của B sphaericus gây độc với côn trùng B anthracis được coi là loài duy nhất độc cho người và động vật (Gordon, 1973) (nếu không kể tới B cereus gây viêm đường tiêu hóa qua thức

ăn)

1.2.2 Bacillus – nhóm vi khuẩn đối kháng Vibrio

Phần lớn các loại bệnh trên thủy sản có nguyên nhân từ thức ăn và sự ô nhiễm môi trường sống của thủy sản Việc xử lý ao, hồ bằng hóa chất và lạm dụng thuốc kháng sinh

đã dẫn đến tình trạng các chất này tồn đọng trong môi trường cũng như tích tụ trong cơ thể thủy sản làm ảnh hưởng đến sức sống thủy sản nuôi dẫn đến việc giảm sản lượng nuôi

trồng (Nguyễn Văn Hảo và cs, 2004; Arulampalam và cs, 1998; Walter và Stephenb,

1998) Mặt khác, nhiều loại vi sinh vật trở nên kháng thuốc và trở thành những mầm bệnh nguy hiểm đối với vật nuôi Một trong những hậu quả cực kỳ nghiêm trọng của hoạt động trên là vấn đề dư lượng kháng sinh trong thủy sản đang được nhiều nước như EU, Mỹ, Canada… sử dụng như một rào cản kỹ thuật để hạn chế sản phẩm thủy sản nhập từ Việt

Nam và nhiều nước khác Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các

plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh sẽ truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và người Vì lẽ đó ngày nay nhiều loại kháng sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản Bắt đầu từ năm 2006, cộng đồng châu Âu đã cấm sử dụng tất cả các loại kháng sinh làm thức ăn bổ sung trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

Phương pháp sử dụng các vi khuẩn có lợi, tức là các vi khuẩn probiotic, để loại trừ các vi khuẩn có hại bằng quá trình cạnh tranh ngày càng được sử dụng nhiều hơn để thay thế phương pháp sử dụng kháng sinh

Kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thủy sản

Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác Năm 1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học (Lương Đức Phẩm, 1998)

Cơ sở của việc ứng dụng các loại vi khuẩn probiotic này là khả năng sinh chất ức chế vi khuẩn gây bệnh, cạnh tranh nguồn dinh dưỡng và năng lượng, cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn có hại trên cơ thể động vật nuôi, cải thiện chất lượng nước, là nguồn dinh dưỡng, kích thích tiêu hóa và làm tăng khả năng miễn dịch của động vật nuôi

(Verschuere và cs, 2000)

Các chất ức chế do vi khuẩn probiotic sinh ra bao gồm: các chất kháng sinh, bacteriocin, siderophores, lysozym, protease, hydroperoxit và các acid hữu cơ (làm biến đổi giá trị pH) Sự có mặt của các chất ức chế này trong ruột của vật chủ, trên bề mặt hoặc trong môi trường nuôi đã tạo ra một hàng rào ngăn chặn sự sinh sôi của tác nhân gây bệnh

Các nhà vi sinh học đã đưa ra các bằng chứng sau: Lactobacillus sp có thể sản sinh

bacterocin gây ức chế sinh trưởng đối với các vi khuẩn khác Các vi khuẩn biển có thể sản

sinh enzyme phân giải chống lại Vibrio parahaemolyticus Alteromonas sp dòng B-10-31,

phân lập từ nước biển gần bờ biển của Nhật Bản sản sinh monastatin có tác dụng ức chế

hoạt tính protease của Aermonas hydrophila và V alguillarum (Phạm Văn Ty và Vũ

Nguyên Thành, 2007)

Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể được sử dụng như probiotic để cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại Bản thân vi khuẩn có hại bị loại bỏ thì cũng có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh các chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

Vi khuẩn probiotic có thể ngăn cản sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cạnh tranh dành vị trí bám trên thành ruột hay trên bề mặt các mô khác Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trưng (dựa vào chất bám dính (adhesin) của vi khuẩn và các phần tử thụ thể của thượng bì ruột) và cơ chế không đặc trưng (yếu tố hóa lý học) (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

Kháng nguyên của probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh Chất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả của kháng thể của vật chủ Trong thực nghiệm người ta thấy động vật thí nghiệm được bổ sung

vi khuẩn lactic đã tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột khá rõ rệt Tôm không có khả năng tạo kháng thể vì không có đáp ứng miễn dịch dịch thể Probiotic có tác dụng tăng cường đáp ứng miễn dịch tự nhiên (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007) Việc xử lý nước nuôi thủy sản bằng probiotic đã cho thấy tác dụng giảm được chất hữu cơ trong nước ao nuôi, giảm hàm lượng BOD và giảm độc do amoni, nitrite và H2S, khống chế được vi khuẩn gây bệnh Ngoài các kiểu tác động trên, vi khuẩn probiotic còn góp thêm enzyme cho vật chủ cũng như cung cấp các nguyên tố đa vi lượng cho vật chủ, giúp chúng sử dụng thức ăn hiệu quả hơn và tăng trưởng tốt hơn (Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành, 2007)

Riêng đối với nhóm vi khuẩn Bacillus, chúng có khả năng sinh các chất lipopeptide

và các chất kháng sinh (Stein, 2005; Verschuere và cs, 2000) Chất lipopeptide hoạt động

như chất hoạt hóa bề mặt do vậy tạo điều kiện để cho các tế bào vi khuẩn probiotic tiếp xúc với tế bào vi khuẩn gây bệnh, do vậy các chất kháng sinh có thể xâm nhập vào tế bào

(Verschuere và cs, 2000) Tất cả các loài Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu

cơ chứa nitơ, như protein, khá mạnh nhờ sinh ra protease ngoại bào (Lương Đức Phẩm,

1998), do đó nó có tác dụng lớn trong việc xử lý môi trường cải thiện chất lượng nước ao nuôi

Một số vi khuẩn probiotic chính hay được sử dụng trong nuôi tôm thuộc các chi:

Lactobacillus, Pseudomonas, Nitrobacter và Bacillus (Lai Thuy Hien và cs, 2005; Lê Thị Bích Phượng và cs, 2003; Moriarty, 1999; Smith và Davey, 1993; Verschuere và cs, 2000) Một nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn Bacillus đông lạnh cũng đem lại lợi ích Các lợi ích

đã được chứng minh bao gồm khống chế bệnh dịch bằng vi khuẩn truyền bệnh V harveyi,

thúc đẩy quá trình thực bào, tăng hoạt động của melanin và kháng khuẩn

Các dòng Bacillus spp chọn lọc đã được sử dụng qua thực nghiệm để kiềm chế sự lây nhiễm của các loài Vibrio (Moriarty, 1998; Rengpipat và cs, 1998) Cả Moriarty (1998)

và Rengpipat và cs (1998) đều chỉ ra rằng chế phẩm sinh học có thể có hiệu quả ngăn chặn các loài vi khuẩn phát sáng Vibrio Cơ chế can thiệp có thể là sự kết hợp của sự canh tranh giữa các vi khuẩn và các hợp chất kháng sinh khác nhau do Bacillus spp tạo ra Khi sử dụng vi khuẩn Bacillus spp, mức phát sáng do vi khuẩn V harveyi thấp hay gần như triệt tiêu và cho kết quả nuôi rất tốt Việc bổ sung thêm Bacillus spp đã đem lại lợi ích cho tôm

trong việc chống bệnh phát sáng và khỏe mạnh hơn và dẫn tới việc tăng sản lượng nuôi Rất nhiều chế phẩm sinh học đã được sử dụng rộng rãi trong nuôi tôm, đặc biệt tại khu vực Châu Á Các chế phẩm sinh học hoạt động như một phần trong tổng thể quản lý hoạt động nuôi tôm bền vững nhằm chống lại nguồn gây bệnh trong qui trình nuôi Các chế phẩm sinh học trong nuôi tôm có một vai trò quan trọng trong phân hủy các chất hữu cơ và tác động làm giảm đáng kể lớp bùn và nhớt trong ao Kết quả là cải thiện chất lượng nước, giảm lớp bùn đáy, giảm tỷ lệ mắc bệnh, tăng số lượng vi sinh vật phù du, giảm mùi hôi và sau cùng tăng sản lượng nuôi Qua việc gia tăng sự phân hủy các chất hữu cơ, amino acid

và glucose được giải phóng sẽ cung cấp nguồn thức ăn cho các vi sinh vật có ích Thành phần vô cơ của nitrogen như ammonia, nitrite và nitrate sẽ giảm thiểu Khi chất lượng nước và hệ số chuyển đổi thức ăn được cải thiện, sức khỏe và hệ miễn dịch của tôm sẽ tăng lên về tổng thể có tác dụng ngăn ngừa nguồn gây bệnh hơn là điều trị bệnh

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Bacillus kháng Vibrio trên tôm nuôi

1.3.1 Những nghiên cứu ở nước ngoài

Trong một nghiên cứu của Ravi và cs (2007) đã phân lập được 109 chủng vi khuẩn

từ môi trường nước biển, trầm tích biển và từ ruột cá, trong đó tìm ra được ba chủng (Q,

Q1 và M) có khả năng đối kháng chống lại các chủng Vibrio Dựa vào trình tự 16S rDNA

đã định danh được chủng Q là Paenibacillus spp, chủng Q1 là Bacillus cereus và chủng M

là Paenibacillus polymyxa Hai chủng Paenibacillus spp và B cereus đã được thử nghiệm trên ấu trùng tôm sú và cho kết quả là có hoạt động probiotic kháng lại các loài Vibrio gây bệnh (Vibrio harveyi và Vibrio spp)

Balcázar và Rojas-Luna (2007) đã nghiên cứu hoạt động kìm hãm của chủng

probiotic Bacillus subtilis UTM 126 chống lại các loài Vibrio gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng Kết quả cho thấy B subtilis UTM 126 có hoạt động kìm hãm chống lại ba chủng Vibrio gây bệnh được phân lập từ tôm bệnh, đó là V harveyi, V alginoliticus và V parahaemolyticus Các vòng kháng khuẩn trên đĩa thử nghiệm đo được với đường kính vào

khoảng 10 – 15 mm

Thử nghiệm in vitro nhằm kiểm soát vi khuẩn V harveyi đã được thực hiện bởi Phianphak và cs (1997) bằng cách sử dụng chế phẩm Bacillus S11 trộn vào thức ăn của tôm Kết quả cho thấy tỷ lệ sống của V harveyi còn 74%

1.3.2 Những nghiên cứu ở trong nước

Vi khuẩn lactic và vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn có đặc tính probiotic được sử

dụng nhiều trong các chế phẩm sinh học cho người và động vật Từ các mẫu đất ao nuôi tôm, phân giun làm thức ăn nuôi tôm, từ đường tiêu hóa của tôm, nhóm các nhà nghiên cứu Khuất

Hữu Thanh và cs (2009) đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn lactic và Bacillus Trong đó 18/32 chủng vi khuẩn lactic và 12/28 chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính đối kháng vi khuẩn Vibrio và vi khuẩn kiểm định Trong nghiên cứu này đã xác định trình tự 16S rRNA

của các chủng LPG 5, LRT8, BaD và BaRT Chủng LPG 5 tương đồng 100% với chủng

Lactobacillus acidophilus LH5, chủng LRT8 tương đồng 98% với chủng Lactobacillus helveticus IMAU40107, chủng BaD tương đồng 100% với chủng Bacillus subtilis EBS05, chủng BaRT tương đồng 97% với chủng Bacillus sp RSP-GLU Chế phẩm probiotic tạo

được có hiệu quả tăng sức kháng bệnh của tôm sú ở điều kiện thí nghiệm, tỷ lệ tôm sống tăng khoảng 15%, trọng lượng tôm 120 ngày tuổi tăng khoảng 13% so với đối chứng

Với mục tiêu chọn ra các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh cho tôm để tạo chế phẩm sinh học trong nước nhằm xử lý nước nuôi tôm công

nghiệp, Đặng Phương Nga và cs (2006) đã phân lập và tuyển chọn được 3 chủng vi khuẩn Bacillus sp HY1 có khả năng kháng Vibrio tốt từ môi trường phân lập là nước nuôi tôm Tiếp sau nghiên cứu trên, Đặng Phương Nga và cs (2007) đã tiến hành nghiên cứu khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio của Bacillus subtilis HY1

Ở Việt Nam những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh để cải thiện môi trường nuôi tôm hoặc có tác dụng probiotics còn tương đối ít Trong những năm gần đây Bộ thủy sản đã cho phép lưu hành sử dụng nhiều chế phẩm vi sinh, nhiều nơi đã làm quen với với việc sử dụng các chế phẩm vi sinh này và có kết quả khá tốt, tuy nhiên cần có một sự đánh giá toàn diện về hiệu quả kinh tế và phương pháp sử dụng

Việc phân lập các chủng vi khuẩn probiotic là việc làm mang nhiều tính chất kinh nghiệm, ít cơ sở khoa học, vì vậy có vô số các nghiên cứu về probiotic bị thất bại, điều đó

có thể là do việc lựa chọn các chủng vi sinh không thích hợp Các bước lựa chọn được xác định, nhưng cần phải thích ứng với từng sinh vật chủ và từng môi trường Cần phải hiểu cơ chế hoạt động của probiotic để vạch rõ tiêu chuẩn chọn lọc các probiotic hữu hiệu

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 lít Điều chỉnh pH môi trường đạt 8,5 ± 0,2 Hấp ở 121oC trong 10 phút (Trần Linh Thước, 2008)

1 lít Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút

+ Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS):