Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn
Các chủng Bacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường LB, lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30oC. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram).
Chuẩn bị tiêu bản
Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 95o. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh
trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 45o và từ từ hạ xuống).
Soi kính hiển vi
Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu. Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng. Chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh.
Trường hợp quan sát vi sinh vật nhuộm Gram (sử dụng vật kính 100X): đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét.
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập Bacillus từ mẫu tôm sú
Từ các mẫu tôm sú thu thập từ chợ Vĩnh Hải, Thành phố Nha Trang (xuất xứ từ huyện Ninh Hòa – Khánh Hòa), chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 18 chủng
Bacillus. Phân lập và thuần khiết Bacillus đã được tiến hành trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC, trong đó có trải qua giai đoạn gia nhiệt ở 80 - 85oC trong 15 phút để tiêu diệt các tế bào sinh dưỡng, chỉ còn lại bào tử Bacillus chịu nhiệt. Số lượng các chủng Bacillus phân lập được trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Số lượng các chủng Bacillus trên tôm sú
Kí hiệu mẫu Số chủng phân lập được
M1 4
M2 8
3.2. Phân lập Vibrio từ mẫu tôm sú
Chúng tôi tiến hành phân lập các chủng Vibrio song song với phân lập các chủng
Bacillus trên cùng các mẫu tôm sú giống nhau. Bằng cách sử dụng môi trường chọn lọc TCBS, 6 chủng Vibrio đã được phân lập và thuần khiết. Số lượng cụ thể được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2.Số lượng các chủng Vibrio trên tôm sú
Kí hiệu mẫu Số chủng phân lập được
M1 2
M2 2
3.3. Tuyển chọn các chủng Bacillus có hoạt tính kháng Vibrio 3.3.1. Tuyển chọn vòng 1 - khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio 3.3.1. Tuyển chọn vòng 1 - khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio
Trong lần tuyển chọn này, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm 18 chủng Bacillus đã phân lập về hoạt tính đối kháng với 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3). Các chủng Bacillus
được nuôi trên môi trường lỏng LB, lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28- 30oC). Các chủng Vibrio được tiến hành đồng thời, nuôi trên môi trường APW, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Tiến hành thử hoạt tính kháng Vibrio của Bacillus
khi các chủng Bacillus có giá trị OD540 đạt khoảng 0,8 – 1,0, và các chủng Vibrio có giá trị OD540 đạt khoảng 0,4 - 0,6. Trang đều 0,1ml chủng Vibrio lên bề mặt đĩa thạch LB, đục các lỗ có đường kính 5 mm lên môi trường đã cấy Vibrio và cho 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Bacillus vào lỗ thạch. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 37oC trong tủ ấm.
Tính đối kháng của các chủng Bacillus được đánh giá thông qua kích thước vòng kháng khuẩn (D – d, mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính lỗ thạch. Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, các đĩa nuôi cấy được đem ra đọc kết quả.
Kết quả từ bảng 3 cho thấy có 10 chủng Bacillus có hoạt tính kháng lại sự phát triển của 2 chủng Vibrio nói trên, chiếm 55,56%. Thông qua kết quả cho thấy tỷ lệ các chủng Bacillus có khả năng kháng lại sự phát triển của 2 chủng Vibrio (V3.1 và V3.3) là rất cao. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra mật độ của vi khuẩn tại thời điểm đem thử hoạt tính. Kết quả cho thấy mật độ của vi khuẩn Vibrio ở khoảng 103 – 104 CFU/ml dịch nuôi cấy và vi khuẩn Bacillus có mật độ vào khoảng 105 – 106 CFU/ml dịch nuôi cấy. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Ravi và cs (2007).
Qua bảng 3 và hình 1 cho thấy chủng Bacillus B 3.8 có khả năng kháng 2 chủng
Bảng 3. Hoạt tính kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng Bacillus trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
D – d (mm) V 3.1 V 3.3 B 1.1 15 17 B 1.2 11 13,5 B 1.3 14,5 16 B 2.1 12,5 10 B 2.2 13,5 15 B 2.3 11 10 B 3.7 13 12 B 3.8 16 20 B 3.9 17,5 10 B 3.10 13 14 0 5 10 15 20 25 B 1.1 B 1.2 B 1.3 B 2.1 B 2.2 B 2.3 B 3.10 B 3.7 B 3.8 B 3.9 Chủng Bacillus H o ạ t tín h k h á n g Vi b rio D - d (m m ) V 3.1 V 3.3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 1. Khả năng đối kháng 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3) của 10 chủng Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2
3.3.2. Tuyển chọn vòng 2 – khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio
Với mục đích tuyển chọn được các chủng Bacillus có khả năng đối kháng với các chủng Vibrio nên việc thử hoạt tính với 2 chủng Vibrio là chưa đủ độ tin cậy. Vì vậy chúng tôi tiếp tục tiến hành thử hoạt tính kháng của 10 chủng Bacillus được tuyển chọn ở vòng 1 với 6 chủng Vibrio phân lập được từ tôm sú.
Phương pháp tiến hành tương tự như ở phần tuyển chọn lần 1. Ở vòng 2 này sẽ tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn của 10 chủng Bacillus được tuyển chọn ở vòng 1 với 6 chủng Vibrio (V 1.1, V 1.3, V 2.1, V 2.4, V 3.1 và V 3.3).
Kết quả từ bảng 4 và hình 2 cho thấy có 4/10 chủng Bacillus có hoạt tính kháng lại cả 6 chủng Vibrio, chiếm 40%. Cả 4 chủng Bacillus đều có hoạt tính kháng với tất cả các chủng Vibrio đã phân lập được nên chúng tôi sẽ chọn 4 chủng này để nghiên cứu về một số đặc điểm sinh học của chúng.
Kết quả của 2 vòng tuyển chọn cho thấy, ở vòng 1 thì chủng Bacillus B 3.8 là có hoat tính kháng mạnh nhất với 2 chủng Vibrio (V 3.1 và V 3.3), nhưng lại không có hoạt tính kháng với cả 6 chủng Vibrio ở vòng tuyển chọn lần 2. Nó không có khả năng kháng 2 chủng Vibrio V 2.1 và V 2.4. Điều này cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của mỗi chủng Bacillus với các chủng Vibrio khác nhau là khác nhau.
Ở vòng tuyển chọn lần 2 này, qua hình 2 và bảng 4 cho thấy chủng B 3.10 là chủng
Bacillus có khả năng kháng Vibrio mạnh nhất với đường kính vòng kháng bình quân là 15,25 mm. Kết quả này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của Balcázar và Rojas-Luna (2007). Họ đã nghiên cứu hoạt động kìm hãm của chủng probiotic Bacillus subtilis UTM 126 chống lại các loài Vibrio gây bệnh trên tôm thẻ chân trắng. Các vòng kháng khuẩn trên đĩa thử nghiệm đo được cũng có đường kính vào khoảng 10 – 15 mm.
0 5 10 15 20 25 B 1.1 B 2.2 B 3.10 B 3.7 Chủng Bacillus H o ạ t tín h kh á n g V ib r io D - d (m m ) V 2.1 V 1.1 V 1.3 V 2.4 V 3.1 v 3.3
Hình 2. Khả năng đối kháng 6 chủng Vibrio (V 1.1, V 1.3, V 2.1, V 2.4, V 3.1 và V 3.3) của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB, được xác định bằng đường kính vòng
kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC
Bảng 4.Hoạt tính kháng 6 chủng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC D – d (mm) V 2.1 V 1.1 V 1.3 V 2.4 V 3.1 V 3.3 B 1.1 13 11,5 12,5 10 15 17 B 2.2 12 18,5 11 20 13,5 15 B 3.10 18 10 22,5 14 13 14 B 3.7 14 14 20 10 13 12
Chúng tôi đã tiến hành thử khả năng kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus theo các mốc thời gian nuôi cấy khác nhau: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ và 30 giờ. Kết quả từ hình 3 cho thấy vi khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 28 – 30oC, lắc 200 vòng/phút có khả năng kháng tốt nhất, cho vòng kháng Vibrio rõ và đều nhất. Qua bảng 5 cho thấy chủng B 3.10 có hoạt tính kháng các chủng Vibrio mạnh nhất sau 24h nuôi cấy.
Bảng 5. Hoạt tính kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus trên môi trường LB sau 24h nuôi cấy, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
D – d (mm) V 2.1 V 1.1 V 1.3 V 2.4 V 3.1 V 3.3 B 1.1 13 16,5 19 17 15 14 B 2.2 15 13,5 16,5 16 15,5 14,5 B 3.10 19 16,5 22 14 16,5 22,5 B 3.7 13,5 8,5 12 11 13 9,5
Một nghiên cứu về khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1, Đặng Phương Nga và cs (2007) đã nghiên cứu được rằng chủng HY1 phát triển cực đại sau 20h nuôi cấy, tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn đạt cực đại sau 24h. Sở dĩ Bacillus có khả năng kháng khuẩn là nhờ khả năng sinh ra chất ức chế và enzyme ngoại bào, mà những sản phẩm này chỉ sinh ra mạnh nhất sau quá trình tăng trưởng của vi khuẩn. Nếu thời gian nuôi cấy quá dài thì vi khuẩn đi vào pha chết, số lượng tế bào giảm, điều này cũng ảnh hưởng xấu đến khả năng kháng khuẩn của Bacillus. Những đặc điểm này phần nào lý giải cho kết quả nghiên cứu trên. Như vậy 2 kết quả nghiên cứu này là phù hợp nhau.
Hình ảnh vòng kháng Vibrio của 4 chủng Bacillus lựa chọn được minh họa trong hình 4 và 5, cũng như hình P. 2 trong Phụ lục.
0 5 10 15 20 25 6 12 24 30
Thời gian (giờ)
H o ạ t tí nh kh á n g V ib ri o D - d (mm ) B 1.1 B 2.2 B 3.7 B 3.10
Hình 3. Hoạt tính kháng Vibrio V 1.3 của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Hình 4. Vòng kháng Vibrio V 1.1 của 4 chủng Bacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC
B 3.10
B 1.1
B 3.7
Hình 5.Vòng kháng Vibrio V 1.1 của chủng Bacillus B 1.1 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC
3.4. Đặc điểm sinh học của 4 chủng Bacillus được tuyển chọn 3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy 3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy
Các chủng được nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 28 – 30oC, lắc 200 vòng/phút. Kết quả theo dõi cho thấy các chủng đều phát triển tốt, đặc biệt là khi nuôi qua đêm. Thông qua giá trị đo OD ở bước sóng 540 nm theo các thời điểm nuôi cấy khác nhau thì cho thấy chủng B 3.7 có khả năng phát triển tốt nhất (Hình 6).
So sánh giữa khả năng kháng khuẩn và khả năng sinh trưởng của các chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bacillus thì thấy rằng: không phải khả năng sinh trưởng mạnh là khả năng kháng khuẩn mạnh. Chẳng hạn chủng B 3.7 có giá trị OD tăng cao theo thời gian song khả năng kháng khuẩn lại giảm xuống. Trong khi chủng B 3.10 thì khả năng kháng khuẩn lại tăng theo thời gian, cao nhất ở 24h nuôi cấy. Qua những kết quả trên, có thể thấy là khả năng sinh trưởng và khả năng sinh ra chất ức chế của các chủng Bacillus khác nhau là khác nhau trên cùng điều kiện nuôi cấy.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 6 12 24
Thời gian (giờ)
K h ả n ăn g s inh tr ưởn g O D 540 B 1.1 B 2.2 B 3.7 B 3.10
Hình 6. Khả năng sinh trưởng của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30oC 3.3.2. Đặc điểm hình thái
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu, ở độ phóng đại 100X của 4 chủng Bacillus. Kết cho cho thấy cả 4 chủng đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím Violet) và có hình que (trực khuẩn). Đây là những đặc điểm đặc trưng thuộc chi Bacillus.
Một số hình ảnh nhuộm Gram tế bào của các chủng Bacillus được minh họa trong hình 7 và 8, cũng như hình P.3 và P.4 trong Phụ lục.
Trên môi trường thạch đĩa (LB), khuẩn lạc của 4 chủng Bacillus mọc tốt và đều. Sau 2 ngày nuôi ở 37oC, khuẩn lạc các chủng có các đặc điểm hình thái khác biệt như được trình bày trong bảng 6 và được minh họa trong hình 9 và 10, cũng như các hình P.5 và P.6 trong Phụ lục.
Hình 7. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 2.2 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình 8. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 1.1 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình 9. Khuẩn lạc chủng B 3.7 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Hình 10. Khuẩn lạc chủng B 3.10 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7, B 3.10) sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Đặc điểm khuẩn lạc
Màu sắc Hình dạng Đường kính (mm)
B 1.1 Hơi nâu Tròn đều 3 – 4
B 2.2 Xanh nâu Không tròn đều, phát triển kéo thành
chuỗi, có vòng sáng quanh khuẩn lạc 5 – 6
B 3.7 Trắng sữa Tròn đều, nhẵn 2 – 3
B 3.10 Xám xanh Không tròn đều và có ria ở bờ mép, có
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ các mẫu tôm sú (P. monodon) thu thập ở chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa, đề tài đã phân lập được 4 chủng Bacillus có khả năng kháng 6 chủng Vibrio spp.
2. Khả năng kháng Vibrio của các chủng Bacillus tăng theo thời gian nuôi cấy và đạt cực đại sau 24h.
3. Chủng Bacillus sp. B 3.7 có khả năng sinh trưởng mạnh nhất trong khi chủng
Bacillus sp. B 3.10 có khả năng kháng Vibrio spp tốt nhất.
4. Bốn chủng B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B 3.10 có các đặc điểm sinh học đặc trưng của chi vi khuẩn Bacillus: tế bào hình que, Gram dương và sinh nội bào tử (kháng nhiệt ở 85oC trong 15 phút).
Kiến nghị
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
1. Định danh các chủng Bacillus đã được tuyển chọn.
2. Phát hiện gen độc tố và nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Vibrio (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
trên tôm sú.
3. Thử nghiệm khả năng kháng Vibrio của các chủng Bacillus trong điều kiện in vitro.
4. Thử nghiệm các chủng Bacillus trên tôm sú được cảm nhiễm Vibrio.
5. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng Bacillus đã được thử nghiệm thành công.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ thủy sản (2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, 296 tr. 2. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú và Lại
Thúy Hiền (2007), “Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K”, Tạp chí công nghệ sinh học 5(3): 383 – 390.
3. Đặng Phương Nga, Vương Thị Nga, Phạm Thị Hằng và Lại Thúy Hiền (2006),