3.4.1. Đặc điểm nuôi cấy
Các chủng được nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 28 – 30oC, lắc 200 vòng/phút. Kết quả theo dõi cho thấy các chủng đều phát triển tốt, đặc biệt là khi nuôi qua đêm. Thông qua giá trị đo OD ở bước sóng 540 nm theo các thời điểm nuôi cấy khác nhau thì cho thấy chủng B 3.7 có khả năng phát triển tốt nhất (Hình 6).
So sánh giữa khả năng kháng khuẩn và khả năng sinh trưởng của các chủng
Bacillus thì thấy rằng: không phải khả năng sinh trưởng mạnh là khả năng kháng khuẩn mạnh. Chẳng hạn chủng B 3.7 có giá trị OD tăng cao theo thời gian song khả năng kháng khuẩn lại giảm xuống. Trong khi chủng B 3.10 thì khả năng kháng khuẩn lại tăng theo thời gian, cao nhất ở 24h nuôi cấy. Qua những kết quả trên, có thể thấy là khả năng sinh trưởng và khả năng sinh ra chất ức chế của các chủng Bacillus khác nhau là khác nhau trên cùng điều kiện nuôi cấy.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 6 12 24
Thời gian (giờ)
K h ả n ăn g s inh tr ưởn g O D 540 B 1.1 B 2.2 B 3.7 B 3.10
Hình 6. Khả năng sinh trưởng của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B 3.10) theo thời gian nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30oC 3.3.2. Đặc điểm hình thái
Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu, ở độ phóng đại 100X của 4 chủng Bacillus. Kết cho cho thấy cả 4 chủng đều thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương (bắt màu tím Violet) và có hình que (trực khuẩn). Đây là những đặc điểm đặc trưng thuộc chi Bacillus.
Một số hình ảnh nhuộm Gram tế bào của các chủng Bacillus được minh họa trong hình 7 và 8, cũng như hình P.3 và P.4 trong Phụ lục.
Trên môi trường thạch đĩa (LB), khuẩn lạc của 4 chủng Bacillus mọc tốt và đều. Sau 2 ngày nuôi ở 37oC, khuẩn lạc các chủng có các đặc điểm hình thái khác biệt như được trình bày trong bảng 6 và được minh họa trong hình 9 và 10, cũng như các hình P.5 và P.6 trong Phụ lục.
Hình 7. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 2.2 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình 8. Tế bào nhuộm Gram của chủng B 1.1 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình 9. Khuẩn lạc chủng B 3.7 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Hình 10. Khuẩn lạc chủng B 3.10 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Bảng 6. Đặc điểm hình thái của 4 chủng Bacillus (B 1.1, B 2.2, B 3.7, B 3.10) sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Đặc điểm khuẩn lạc
Màu sắc Hình dạng Đường kính (mm)
B 1.1 Hơi nâu Tròn đều 3 – 4
B 2.2 Xanh nâu Không tròn đều, phát triển kéo thành
chuỗi, có vòng sáng quanh khuẩn lạc 5 – 6
B 3.7 Trắng sữa Tròn đều, nhẵn 2 – 3
B 3.10 Xám xanh Không tròn đều và có ria ở bờ mép, có
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Từ các mẫu tôm sú (P. monodon) thu thập ở chợ Vĩnh Hải, Nha Trang, Khánh Hòa, đề tài đã phân lập được 4 chủng Bacillus có khả năng kháng 6 chủng Vibrio spp.
2. Khả năng kháng Vibrio của các chủng Bacillus tăng theo thời gian nuôi cấy và đạt cực đại sau 24h.
3. Chủng Bacillus sp. B 3.7 có khả năng sinh trưởng mạnh nhất trong khi chủng
Bacillus sp. B 3.10 có khả năng kháng Vibrio spp tốt nhất.
4. Bốn chủng B 1.1, B 2.2, B 3.7 và B 3.10 có các đặc điểm sinh học đặc trưng của chi vi khuẩn Bacillus: tế bào hình que, Gram dương và sinh nội bào tử (kháng nhiệt ở 85oC trong 15 phút).
Kiến nghị
Hướng nghiên cứu tiếp theo:
1. Định danh các chủng Bacillus đã được tuyển chọn.
2. Phát hiện gen độc tố và nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Vibrio
trên tôm sú.
3. Thử nghiệm khả năng kháng Vibrio của các chủng Bacillus trong điều kiện in vitro.
4. Thử nghiệm các chủng Bacillus trên tôm sú được cảm nhiễm Vibrio.
5. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic từ các chủng Bacillus đã được thử nghiệm thành công.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ thủy sản (2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, 296 tr. 2. Đặng Phương Nga, Nguyễn Thị Yên, Đỗ Thu Phương, Nguyễn Bá Tú và Lại
Thúy Hiền (2007), “Khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Vibrio trong nước nuôi tôm của Bacillus subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K”, Tạp chí công nghệ sinh học 5(3): 383 – 390.
3. Đặng Phương Nga, Vương Thị Nga, Phạm Thị Hằng và Lại Thúy Hiền (2006), “Khả năng đối kháng với Vibrio trong nước nuôi tôm của một số chủng vi khuẩn lựa chọn”, Tạp chí công nghệ sinh học 4(3): 379 – 387.
4. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004), “Bệnh học thủy sản”, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 224 – 231.
5. Đỗ Thị Liên, Đỗ Thị Tố Uyên và Trần Văn Nhị (2008), “Một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn quang hợp tía thuộc chi Rhodobacter có khả năng loại bỏ Sulfide phân lập từ vùng ven biển Quảng Ninh”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(4): 497 – 504.
6. Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Đăng Phúc Hải, Bùi Văn Đạt và Võ Văn Nha
(2009), “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có đặc tính Probiotic trong tạo chế phẩm nuôi tôm sú”, Tạp chí khoa học và công nghệ, số 74.
7. Lại Thúy Hiền, Nguyễn Bá Tú, Đỗ Thu Phương, Phạm Thị Hằng, Nguyễn Thị Yên, Vương Thị Nga, Võ Mai Hương, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thu Thủy và
Bùi Lê Thanh Nhàn (2008), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học Nitrobact ứng dụng trong xử lý nước nuôi tôm tại Thừa Thiên Huế”, Tạp chí công nghệ sinh học 6(2): 249 – 256.
8. Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trương Thị Hồng Vân và Lê Tấn Hưng
(2003), “Khảo sát khả năng cạnh tranh và đối kháng của vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic BIO II với vi khuẩn gây bệnh cho tôm”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội, tr. 353 – 357.
9. Lương Đức Phẩm (1998), “Công nghệ vi sinh vật”, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 112 – 154.
10.Nguyễn Văn Hảo, Cao Thành Trung, Nguyễn Viết Dũng và Lê Hồng Phước
Bộ”, Hội thảo toàn quốc về nghiên cứu và ứng dụng khoa học công nghệ trong nuôi trồng thủy sản, Vũng Tàu.
11.Phạm Văn Ty và Vũ Nguyên Thành (2007), “Công nghệ sinh học, Tập năm, Công nghệ vi sinh và môi trường”, NXB Giáo dục, Hà Nội, tr. 135 – 167.
12.Trần Linh Thước (2008), “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm”, NXB Giáo Dục, Tp. Hồ Chí Minh, 232 tr.
Tài liệu tiếng Anh
13.Arulampalam P, Yusoft FM, Sarift M, Law AT and Srinivasa Rao PS (1998), “Water quality and Bacterial population in a tropical marine cage culture farm”,
Aquacult Res 29: 617 – 624.
14.Balcázar JL and Rojas-Luna T (2007), “Inhibitory Activity of Probiotic Bacillus subtilis UTM 126 Against Vibrio Species Confers Protection Against vibriosis in Juvenile Shrimp (Litopenaeus vannamei)”, Curr. Microbiol 55: 409 – 412.
15.Gordon RE (1973), “The Genus Bacillus”, Handbook of Microbiology, I, pp. 71 – 88.
16.Lai Thuy Hien, Do Thu Phuong, Vu Phuong Anh, Dang Phuong Nga, Pham Thi Hang, Vuong Thi Nga, Le Thi Nhi Cong, Nguyen Thi Yen, Pham Van Muong and Nguyen Ba Tu (2005), “Application of CNSH probiotic for bioremediation of industrial shrimp farming area in Hoanghoa, Thanhhoa”,
Regional Symposium on Chemical Engineering, Hanoi.
17.Moriarty D (1998), “Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds”, Aquacult 164: 351 – 358.
18. Moriarty DJW (1999), “Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria”, Proceeding of the 8th International Symposium on Microbial Ecology, Halifax, Canada.
19.Ravi AV, Musthafa KS, Jegathammbal G, Kathiresan K and Pabdidan SK
(2007), “Screening and evaluation of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic vibrios in marine aquaculture”, Lett Appl Microbiol 45: 219 – 223. 20.Rengpipat S, Tunyanun A, Fast AW, Piyatiratitivorakul S and Menasveta P
(2003), “Enhanced growth and resistance to Vibrio challenge in pond-reared black tiger shrimp Penaeus monodon fed a Bacillus probiotic”, Dis Aquat Org 55: 169 – 173.
21.Sarker A, Khan SN, Naser MN and Karim MM (2008),“Isolation of Probiotic Bacteria from Natural Sources to Control Diseases in Shrimp Aquaculture”, Food Safety & Hygience, pp. 129 – 135.
22. Smith P and Davey S (1993), “Evidence for the competitive exclusion of Aeromonas salmonocda from fish with stress-inducible furunculosis by a fluorescent Pseudomonas”, J Fish Dis 16: 521 – 524.
23.Stein T (2005), “Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions”, Mol Microbiol 56(4): 845 – 857.
24.Thompson FL, Iida T and Swings J (2004), “Biodiversity of Vibrios”, Microbiol Mol Biol Rev 68(3): 403 – 431.
25.Verschuere L, Rombaut G, Sorgeloos P and Verstraete W (2000), “Probiotic bacteria as biologycal control agents in aquaculture”, Microbiol Mol Biol Rev
PHỤ LỤC
Hình P.1. Mẫu tôm sú dùng phân lập Bacillus và Vibrio
Hình P.2. Vòng kháng Vibrio V 1.1 của chủng Bacillus B 3.10 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC
Hình P.3. Tế Tế bào nhuộm Gram của chủng B 3.10 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình P.4.Tế Tế bào nhuộm Gram của chủng B 3.7 sau 24h nuôi cấy trên môi trường LB, lắc 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 37oC
Hình P.5.Khuẩn lạc chủng B 1.1 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC
Hình P.6.Khuẩn lạc chủng B 2.2 sau 48h nuôi cấy trên môi trường LB, ở nhiệt độ 37oC