Phân lập và tuyển chọn các chủng bacillus spp ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƢỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH: PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG BACILLUS SPP ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT NÔNG NGHIỆP LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: NÔNG LÂM NGƢ NGHIỆP CHUN NGÀNH: NƠNG NGHIỆP Mã số cơng trình: …………………………… (Phần BTC Giải thƣởng ghi) MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT i DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iv MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết nghiên cứu Mục tiêu nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu Phạm vi nghiên cứu Ý nghĩa đề tài khoa học CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chủng Bacillus spp 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên 1.1.4 Đặc điểm hình thái học 1.1.5 Đặc điểm sinh hóa 1.1.6 Đặc điểm tế bào khả sinh bào tử 1.1.7 Khả đối kháng nấm bệnh chủng Bacillus spp 1.1.8 Mức độ an toàn sinh học 14 1.2 Tổng quan chủng nấm gây bệnh đốm trắng long 14 1.2.1 Giới thiệu bệnh đốm trắng 14 1.2.2 Tác hại bệnh đốm trắng: 16 1.2.3 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh 17 1.2.4 Phân loại 18 1.2.5 Đặc điểm hình thái học 18 1.2.6 Lịch sử nghiên cứu 19 1.3 Nấm gây bệnh héo vàng ớt (Fusarium sp.) 21 1.3.1 Giới thiệu bệnh héo vàng ớt 21 1.3.2 Giới thiệu chủng nấm gây bệnh chủ yếu 22 1.3.3 Lịch sử nghiên cứu 23 1.3.4 Phân loại 23 1.3.5 Đặc điểm sinh thái học phân bố tự nhiên 23 1.3.6 Đặc điểm hình thái học 24 1.4 Giới thiệu enzyme ngoại bào 25 1.4.1 Tổng quan Enzyme Chitinase 25 1.4.2 Enzyme Cellulase 28 1.5 Phân giải lân khó tan đất 30 1.5.1 Khái niệm: 30 1.5.2 Sự chuyển hóa lân đất 32 1.5.3Vi sinh vật phân giải lân khó tan 32 1.6 Khả sinh IAA 35 1.6.1 Lịch sử nghiên cứu IAA 35 1.6.2 Khái niệm: 36 1.6.3 Vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng trồng (PGPR) 37 1.6.4 Các chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng trồng (PGPR) 39 1.7 Tình hình nghiên cứu sửu dụng Bacillus spp ứng dụng vào sản xuất nông nghiệp 39 1.7.1 Nghiên cứu nước 39 1.7.2 Nghiên cứu nước 41 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 42 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 42 2.1.2 Vật liệu: 42 2.1.3 Hóa chất 43 2.1.4 Môi trường 43 2.2.Thiết bị dụng cụ 44 2.2.1 Thiết bị 44 2.2.2 Dụng cụ 44 2.3 Bố trí thí nghiệm 45 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 45 2.3.2 Thuyết minh quy trình: 46 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 47 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 47 2.4.2 Phương pháp pha loãng 47 2.4.3 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 48 2.4.4 Phương pháp tăng sinh 49 2.4.5 Phương pháp quan sát hình thái tế bào 49 2.4.6 Phương pháp xác định đặc điểm sinh hóa 51 2.4.7 Phương pháp cấy chuyển để bảo quản giống 57 2.4.8 Phương pháp bảo quản giống giữ lạnh 57 2.4.9 Phương pháp khảo sát khả sinh enzyme ngoại bào (cellulase, chitinase) chủng vi khuẩn 58 2.4.11 Khả phân giải phosphate khó tan 67 2.4.12 Khả sinh IAA 69 2.5.13 Phương pháp đối kháng nấm 70 2.5.13 Đánh giá khả phòng trừ nấm bệnh trái long 71 2.5.14 Đánh giá khả phòng trừ nấm bệnh ớt 72 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 74 3.1 Kết phân lập chủng Bacillus spp từ đất nông nghiệp 74 3.1.1 Đặc điểm hình thái chủng 74 3.1.2 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa chủng 79 3.2 Khả sinh enzyme ngoại bào chủng vi khuẩn 79 3.2.1 Khả sinh enzyme chitinase 79 3.2.2 Khả sinh enzyme cellulase: 81 3.3 Khả đối kháng nấm chủng 84 3.3.1 Khả đối kháng nấm Fusarium sp 84 3.3.2 Khả đối kháng nấm Neoscytalidium dimidiatum gây bệnh đốm trắng long 86 3.4 Khả phân giải lân khó tan chủng 88 3.5 Khả sinh IAA chủng 90 3.6 Đánh giá khả ức chế nấm gây bệnh đốm trắng long chủng vi khuẩn 93 3.7 Hiệu đối kháng nấm Fusarium sp gây chết mầm ớt khả kích thích sinh trƣởng ớt chủng vi khuẩn 97 3.8 Định danh chủng có triển vọng 104 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 107 4.1 Kết luận 107 4.2 Đề nghị 107 TÀI LIỆU THAM KHẢO 108 i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT NB: Môi trƣờng Nutrient Broth NA: Môi trƣờng Nutrient Agar NMSL: Nƣớc muối sinh lý PDA: Môi trƣờng Potato D-glucose Agar PDB: Môi trƣờng Potato D- glucose Broth LBNT: Lây bệnh nhân tạo ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Bacillus spp…………………… ……… Hình 1.2: Triệu chứng bệnh xuất thân, cành long …………… 17 Hình 1.3: Triệu chứng bệnh long chin………………… .18 Hình 1.4 Hình thái nấm Scytalidium dimidiatum dƣới kính hiển vi vật kính 40X….19 Hình 1.5: Đặc điểm hình thái vi nấm Fusarium oxysporum ……………………… 25 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm…………………………………………………… 52 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả phân giải cellulase chủng Bacillus spp……………………………………………………………………………65 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả phân giải chitinase chủng Bacillus spp ………………………………………………………………………… 66 Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ vi khuẩn – dựng đƣờng chuẩn tế bào…………………………………………………………………………………….69 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định mật độ nấm – dựng dƣờng chuẩn nấm….72 Hình 3.1.: Kết nhuộm gram chủng vi khuẩn…………………………….85 Hình 3.2: Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn………………………… 86 Hình 3.3: Đƣờng kính vịng phân giải chitin (cm)………………………………… 89 Hinh 3.4: Đƣờng kính vịng phân giải CMC (cm)………………………………… 91 Hình 3.5: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Fusarium sp.của chủng Bacillus spp…… 93 Hình 3.6: Hiệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium dimidiatum chủng Bacillus spp……………………………………………………………………………95 Hình 3.7: Hàm lƣợng photphat khó tan chủng Bacillus spp phân giải…… 97 Hinh 3.8: Lƣợng photphat chủng Bacillus spp phân giải theo thời gian…………97 Hình 3.9: Khả sinh IAA chủng vi khuẩn……………………………… 99 Hình 3.10: Khả sinh IAA chủng Bacillus spp…………………………100 Hình 3.11: Chỉ số bệnh hại long sau ngày…………………………… 104 Hình 3.12: Chỉ số bệnh hại long sau 10 ngày…………………………….105 Hình 3.13: Chiều cao qua nghiệm thức…………………………………….109 Hình 3.14: Chiều dài rễ qua nghiệm thức……………………………………….110 iii Hình 3.15: Số qua nghiệm thức…………………………………………… 111 Hình 3.16: Kết giải trình tự gen 16S mẫu BPS6………………………… 112 Hình 3.17: Kết tra cứu BLAST SEARCH (NCBI) chủng BPS6…… 113 Hình 3.18: Kết giải trình tự 16S chủng BTA7…………………………… 113 Hình 3.19: Kết tra cứu BLAST SEARCH (NCBI) chủng BTA7…… 114 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số thử nghiệm sinh hóa đặc trƣng Bacillus spp……………… Bảng 1.2: Các chất kháng sinh đƣợc tổng hợp số loài Bacillus spp …….12 Bảng 3.1: Hình dạng khuẩn lạc chủng vi khuẩn phân lập đƣợc……… 82 Bảng 3.2: Kết thử nghiệ sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập đƣợc….88 Bảng 3.3: Khả sinh enzyme chitinase chủng vi khuẩn phân lập… 89 Bảng 3.4: Khả sinh enzyme cellulase chủng vi khuẩn phân lập… 90 Bảng 3.5: Hiệu ức chế nấm Fusarium sp chủng vi khuẩn……… 92 Bảng 3.6: Hệu lực ức chế nấm bệnh Neoscytalidium Dimidiatum…………… 94 Bảng 3.7: Khả phân giải photphate khó tan sau khoảng thời gian…….96 Bảng 3.8: Khả sinh IAA chủng Bacillus spp …………………….99 Bảng 3.9: Chỉ số bệnh đốm trắng long nghiệm thức………….102 Bảng 3.10: Tỷ lệ (%) nảy mầm, tỷ lệ (%) sống sót, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cây………………………………………………………………………….107 Bảng 3.11: Sự phát triển ớt qua nghiệm thức…………………… 108 MỞ ĐẦU 1.Tính cấp thiết nghiên cứu Trong năm gần đây, nông nghiệp Việt Nam ngày đƣợc nhiều nƣớc giới biết đến với mặt hàng nông sản xuất chủ lực nhƣ: lúa, gạo, cà phê, hồ tiêu, ớt, long, vú sữa đáp ứng đƣợc tiêu chí chất lƣợng nƣớc giới Tuy nhiên, nơng nghiệp nƣớc ta cịn dựa chủ yếu vào phân bón thuốc bảo vệ thực vật hóa học Hệ quả, nơng dân khơng tốn nhiều chi phí cho hóa chất mà đa dạng hệ vi sinh vật đất chất lƣợng đất bị suy giảm nghiêm trọng Vì vậy, biện pháp sinh học đƣợc tập trung nghiên cứu thay dần biện pháp hóa học Các kết nghiên cứu cho thấy lồi vi khuẩn Bacillus có khả đối kháng với nhiều lồi nấm gây bệnh bảo vệ trồng, chống lại vi sinh vật gây bệnh, đồng thời tạo điều kiện cho trồng sinh trƣởng phát triển tốt (Dunlap et al, 2013; Jamil Shafi et al., 2017; Radhakrishnan et al., 2017) Do đó, nhiều chủng Bacillus đƣợc sản xuất thành chế phẩm nhiều nƣớc giới Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng Bacillus để tạo phân bón vi sinh đƣợc quan tâm triển khai (Phạm Văn Toản, 2002) Tuy nhiên, việc sử dụng Bacillus để trừ bệnh hại hạn chế, chủ yếu nhập chế phẩm từ nƣớc Mặt khác, hiệu lực đối kháng bệnh chủng Bacillus biến động Xuất phát từ lý trên, sinh viên tiến hành đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus spp ứng dụng sản xuất nông nghiệp.” Mục tiêu nghiên cứu + Phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme ngoại bào tuyển chọn chủng có khả sinh enzyme mạnh từ nguồn đất + Thực số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh hóa đặc trƣng cho chủng Bacillus spp để tuyển chọn chủng mong muốn, loại vi sinh vật có nguy gây bệnh + Khảo sát khả sinh tổng hợp IAA khả phân giải lân khó tan chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 73 Means with the same letter are not significantly different Duncan Grouping Mean B C B C B C B C B C N MAU 2.0000 NT1BM06 2.0000 NT3BM06 2.0000 NT2BT06 C C 1.8750 NT1BT06 C C 1.7500 NT2BM06 C C 1.5000 NT2BTA7 D 0.7750 NT3BT06 E 0.0000 NT4 74 KHONG CO TRYP‟ The ANOVA Procedure Dependent Variable: DV Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 16 0.0940000 147.0292958 21.0041851 3575.18 F 147.0292958 21.0041851 3575.18 F Model 16 6995.527451 437.220466 Error 34 72.526667 2.133137 204.97 F 16 6995.527451 437.220466 204.97