Phân lập và định danh một số chủng nấm gây bệnh trên lúa oryza sativa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ CHỦNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN LÚA (Oryza sativa) Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀNG DŨNG ThS LÊ QUỲNH LOAN Sinh viên thực MSSV: 1311100334 :NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG Lớp: 13DSH02 TP Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp CAM ĐOAN Người thực đề tài xin cam đoan: Đồ án cơng trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoàng Dũng, ThS Lê Quỳnh Loan Các số liệu thu thập kết phân tích đề tài trung thực, đề tài không trùng với đề tài nghiên cứu khoa học Những thơng tin tham khảo trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng Thành phố Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hương i Đồ án tốt nghiệp LỜI CÁM ƠN Trong thời gian thực đồ án tốt nghiệp Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ Đức, hướng dẫn tận tình Thầy cơ, anh chị bạn, em hoàn thành tốt đồ án Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: TS Hồng Quốc Khánh, trưởng phịng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam, Thầy tạo điều kiện cho em làm đề tài TS Nguyễn Hoàng Dũng ThS Lê Quỳnh Loan phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Cơng Nghệ Việt Nam tận tình bảo, hướng dẫn, giảng dạy giúp đỡ động viên em suốt thời gian thực đồ án Thầy Ngơ Đức Duy, phịng Vi sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học Công Nghệ Việt Nam giúp đỡ em suốt trình thực đồ án Em xin chân thành cảm ơn toàn thể thầy, cô khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Mơi trường trường đại học HUTECH tận tình truyền đạt kiến thức kinh nghiệm suốt năm qua Các bạn lớp 13DSH02 đồng hành, chia sẻ giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực đề tài Cuối cùng, xin cám ơn Ba Mẹ, ni nấng, chăm sóc tạo điều kiện cho ăn học thành người có ích cho xã hội, người ln bên cạnh động viên, định hướng cho gặp khó khăn cơng việc Xin trân trọng cảm ơn! Sinh viên thực Nguyễn Thị Thanh Hương ii Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG .vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii MỞ ĐẦU .1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu .2 Nhiệm vụ nghiên cứu .2 Phương pháp nghiên cứu Kết đạt Kết cấu đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược lúa 1.2 Một số bệnh thường gặp lúa 1.3 1.4 1.2.1 Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lúa) 1.2.2 Bệnh đốm nâu lúa 11 1.2.3 Bệnh tiêm lửa hại lúa 13 1.2.4 Bệnh khô vằn 15 Định danh sinh học phân tử 20 1.3.1 Phương pháp ly trích DNA .20 1.3.2 PCR định danh vi sinh vật .22 Tái nhiễm nhân tạo theo quy tắc Koch 25 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Vật liệu, thiết bị hóa chất 27 iii Đồ án tốt nghiệp 2.2 2.1.1 Dụng cụ thiết bị 27 2.1.2 Nguồn mẫu 28 2.1.3 Hóa chất 28 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Thu mẫu 29 2.2.2 Phân lập làm nấm .29 2.2.3 Phương pháp phòng ẩm 29 2.2.4 Phương pháp bảo quản chủng nấm 30 2.2.5 Định danh sinh học phân tử (kỹ thuật PCR) 31 2.2.6 Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .35 3.1 Kết phân lập làm nấm bệnh 35 3.1.1 Kết thu nhận mẫu bị bệnh 35 3.1.2 Kết phân lập, làm quan sát hình thái 36 3.2 Định danh chủng nấm vùng gen ITS 44 3.3 Kết so sánh vùng gen ITS 45 3.4 Kết tái nhiễm theo quy tắc Koch 48 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Kiến nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng đoạn gene NCBI PHỤ LỤC C: Kết trình tự vùng gen bảo tồn ITS………………………….6 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base Pair CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide DNA Deoxyribonucleotide Acid EDTA Ethylene – Diamine – Tetraacetic – Acid ITS Internal transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reation PDA Potato Dextrose Agar PDB Potato Dextrose Broth TAE Tri – Acetic acid – Ethylenediamine – Tetraacetate TE Tris – Ethylenediamine – Tetraacetate v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại nấm M oryzae Bảng 1.2 Phân loại nấm C lunata 11 Bảng 1.3 Phân loại nấm B oryzae 14 Bảng 1.4 Phân loại nấm R solani 17 Bảng 1.5 Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS 24 Bảng 3.1 Mẫu lúa bị nhiễm bệnh thu đồng ruộng 35 vi Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Bản đồ mồi vùng gen ITS .24 Hình 3.1 Mẫu lúa bị nhiễm bệnh thu đồng ruộng 36 Hình 3.2 Chủng nấm CG1 .37 Hình 3.3 Chủng nấm CG2 .38 Hình 3.4 Chủng nấm CG3 .39 Hình 3.5 Chủng nấm BL1 .40 Hình 3.6 Chủng nấm BL2 .40 Hình 3.7 Chủng nấm BL3 .41 Hình 3.8 Chủng nấm VL1 .42 Hình 3.9 Chủng nấm VL2 .42 Hình 3.10 Chủng nấm HM1 43 Hình 3.11 Chủng nấm HM2 44 Hình 3.12 Kết điện di sản phẩm ly trích PCR 45 Hình 3.13 Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) .49 Hình 3.14 Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử nồng độ 106 tế bào/ml) 49 Hình 3.15 Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm 50 vii Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Lúa (Oryza sativa) loại lương thực quan trọng trồng nhiều giới đặc biệt nước châu Á, có Việt Nam Nó có vai trị quan trọng sản xuất nơng nghiệp, nguồn cung cấp lương thực Tuy nhiên ảnh hưởng trình thâm canh sản xuất nơng nhiệp, tình hình dịch bệnh có nhiều biến đổi dẫn đến suất chất lượng lúa bị suy giảm tác động nấm bệnh, đặc biệt bệnh đạo ôn, bệnh đốm nâu,… gây hại tất giai đoạn sinh trưởng lúa Triệu chứng ban đầu bệnh giống nhau, việc xác định tác nhân gây bệnh thường thời gian khó khăn Do đó, việc phát kịp thời xác tác nhân gây bệnh lúa giúp ích cho việc đưa biện pháp phòng ngừa điều trị sớm, kịp thời hiệu Ngày với phát triển khoa học kỹ thuật, đặc biệt công nghệ sinh học, nhiều kỹ thuật đời có kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) xem phương pháp phổ biến thông dụng việc xác định tác nhân gây bệnh trồng đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian tính xác cao, tìm tác nhân gây bệnh giai đoạn đầu nhiễm bệnh Trên sở đó, tơi thực đề tài “Phân lập định danh số chủng nấm gây bệnh lúa (Oryza sativa)” kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ITS1 – F ITS4, nhằm phát bệnh cách xác nhanh chóng, đưa cách phòng trừ hữu hiệu, giảm thiệt hại đến mức thấp Tình hình nghiên cứu ❖ Các nghiên cứu nước – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp “Nghiên cứu bệnh đạo ơn số dịng, giống lúa viện lương thực thực phẩm, vụ xuân 2010” Phạm Tự Bắc (2010) Mục đích đề tài nhằm nắm tác hại đặc điểm phát sinh, phát triển bệnh đạo ôn số giống lúa Viện Đồ án tốt nghiệp Cây lương thực – Cây thực phẩm vụ xuân 2010, xác định chủng sinh lý nấm đạo ôn nghiên cứu số đặc tính chúng – Báo cáo khoa học “Xác định nấm gây bệnh lem lép hạt lúa Đồng sông Cửu Long” Trần Thị Thu Thủy (2011) Tạp chí khoa học 2011 17a 155 – 163, Trường Đại học Cần Thơ Đề tài thực nhằm xác định nấm gây bệnh lem lép hạt tỉnh Đồng sông Cửu Long, xác định 11 chủng nấm – Báo cáo khoa học “Ứng dụng phương pháp PCR việc xác định nấm gây bệnh đạo ôn lúa, Magnaporthe oryzae” Đồn Thị Hịa et al (2016) Tạp chí khoa học Đại học mở TP.HCM, số (49) 104 – 110 Xác định nấm đạo ôn kỹ thuật PCR với cặp mồi chuyên biệt nhằm giúp giảm chi phí, thời gian cơng sức ❖ Các nghiên cứu ngồi nước – Hajano et al (2011) “Rice blast – mycoflora, symptomatology and pathogencity” Nghiên cứu đặc tính, triệu chứng số loại nấm gây bệnh lúa phân lập từ hạt lúa – Kamaluddeen et al (Dec 2013) “A new blight disease of rice caused by Curvularia lunata from Uttar Pradesh” Nghiên cứu mô tả bệnh đốm nâu Curvularia lunata gây Mục đích nghiên cứu Phân lập định danh số chủng nấm gây bệnh lúa thu thập tỉnh đồng sông Cửu Long (Long An, Vĩnh Long) huyện Hóc Mơn, từ kết nghiên cứu này, dựa vào đặc điểm nghiên cứu nấm bệnh đưa biện pháp khắc phục kịp thời, nhanh chóng, tránh tổn thất Nhiệm vụ nghiên cứu – Phân lập làm nấm bệnh – Quan sát đặc điểm hình thái (khuẩn ty bào tử) – Định danh sinh học phân tử – Tái nhiễm nấm bệnh lúa Đồ án tốt nghiệp phân lập từ nơi ẩm ướt nhà, có khả sinh độc tố Bệnh nốt sần A versicolor gây chủ yếu người 60 tuổi có liên quan đến móng chân Là tác nhân gây bệnh người, xem mầm bệnh gây mụn nhọt móng chân Các biện pháp xử lý thơng thường khơng có hiệu Chưa có báo cáo nấm A versicolor gây bệnh thực vật [15], [19], [30] Dựa vào đặc điểm mơ tả hình thái phân tích di truyền dựa vào vùng gen ITS ta kết luận định danh chủng nấm phân lập từ mẫu lúa bị bệnh cháy sau: – Chủng nấm CG1 xác định loài Curvularia lunata với độ tương đồng 100% – Chủng nấm BL1 xác định thuộc chi Curvularia sp với độ tương đồng 100% Cả hai chủng nấm gây bệnh đốm nâu lúa, làm giảm suất lúa – Chủng nấm VL1 xác định loài Aspergillus versicolor với độ tương đồng 100% A versicolor có khả gây bệnh người, chưa có báo cáo việc gây bệnh thực vật 3.4 Kết tái nhiễm theo quy tắc Koch Trong chủng nấm định danh có hai chủng có khả gây bệnh lúa chủng CG1 BL1, chủng CG1 C lunata chọn tiến hành thí nghiệm tái nhiễm lúa Chủng VL1 A versicolor khơng chọn chưa có báo cáo khẳng định khả gây bệnh thực vật Bào tử pha loãng đến 102 xác định phương pháp đếm buồng đếm hồng cầu ❖ Kết thí nghiệm lúa Mẫu đối chứng mẫu thí nghiệm bọc túi ny lông 72 (không có ánh sáng chiếu trực tiếp vào cây) 48 Đồ án tốt nghiệp Hình 3.13 Mẫu lúa đối chứng (phun nước cất) b a Hình 3.14 Mẫu lúa thí nghiệm (phun dịch bào tử nồng độ 106 tế bào/ml) a b, vết bệnh bề mặt lúa sau 72 Mẫu đối chứng phun nước cất, khơng có tượng (hình 3.13) Đối với mẫu thí nghiệm phun dịch bào tử nồng độ 106 tế bào/ml, sau 72 giờ, điều kiện nhiệt độ ánh sáng thích hợp, quan sát thấy lúa xuất đốm nhỏ màu nâu (hình 3.14a b), vết bệnh tương tự vết bệnh quan sát đồng ruộng Tiếp theo tiến hành phân lập lại từ lúa có vết bệnh từ mẫu thí nghiệm 49 Đồ án tốt nghiệp b a Hình 3.15 Chủng nấm phân lập từ thí nghiệm tái nhiễm a, mặt trước đĩa petri; b, bào tử (vật kính 100X) Mẫu nấm ni cấy mơi trường PDA bổ sung chloramphenicol vòng ngày, nhiệt độ 25 – 30oC Đường kính khuẩn lạc đạt khoảng 70 mm, tơ nấm có màu đen, bào tử màu đen (hình 3.15a) Giống với hình thái quan sát chủng CG1 Bào tử dài, hình bầu dục, có – vách ngăn, màu nâu, phân đốt, vách ngăn có nhân (hình 3.15b; vật kính 100X) Mẫu nấm CG1 phân lập từ lúa nhiễm bệnh Cần Giuộc định danh lồi Curvularia lunata có khả gây bệnh lúa Thí nghiệm tái nhiễm theo quy tắc Koch thành công 50 Đồ án tốt nghiệp CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ mẫu lúa bị nhiễm bệnh phân lập, làm 10 chủng nấm có khả gây bệnh lúa Định danh chủng nấm CG1, BL1 VL1 dựa vào vùng bảo tồn ITS chủng CG1 có mức độ tương đồng với lồi Curvularia lunata 100%; chủng BL1 có mức độ tương đồng với chi Curvularia sp 100%; chủng VL1 có mức độ tương đồng với loài Aspergillus versicolor 100% Kết tái nhiễm theo quy tắc Koch chủng nấm CG1 (Curvularia lunata) cho thấy chủng có khả xâm nhiễm gây bệnh lúa 4.2 Kiến nghị Định danh đến loài tiến hành khảo sát khả tái nhiễm chủng nấm phân lập lại Thu mẫu nhiều vùng khác để có đánh giá tổng quan tình hình nấm bệnh lúa Từ đề xuất biện pháp phòng trừ nấm bệnh phạm vi lớn 51 Đồ án tốt nghiệp TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L Phan Thúy Hiền (2009) Cẩm nang chẩn đoán bệnh Việt Nam Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp ACIAR: Canberra Đường Hồng Dật (1976) Sổ tay bệnh hại trồng tập 1, NXB Nông [2] thôn, Việt Nam [3] Hồ Huỳnh Thùy Dương (2003) Sinh học phân tử, NXB Giáo dục [4] Nguyễn Hữu Trí (2010) Bài giảng sinh học phân tử, Trường ĐH Nông Lâm TP HCM, TP HCM [5] Nguyễn Minh Nguyệt (2003) Khảo sát số đặc tính nấm Rhizoctonia solani phân lập từ (Gossypium sp.) bắp (Zae may L.), Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP HCM, TP HCM [6] Nguyễn Thị Tiến Sỹ (2005) Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát đa dạng di truyền nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều ký chủ khác nhau, Luận văn tốt nghiệp, Trường ĐH Nông Lâm TP HCM, TP HCM [7] Nguyễn Văn Hoan (2006) Cẩm nang lúa, NXB Lao động, Hà Nội [8] Trần Văn Đạt (2005) Sản xuất lúa gạo giới: Hiện trạng khuynh hướng phát triển kỷ 21, NXB Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh [9] Trần Văn Minh (2004) (Chủ biên), Giáo trình lương thực, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội [10] Vũ Triệu Mân (2007) Giáo trình bệnh chuyên khoa, NXB Hà Nội, Hà Nội [11] Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (1998) Giáo trình bệnh Nơng nghiệp, NXB Nơng nghiệp Hà Nội, Hà Nội Tài liệu nước 52 Đồ án tốt nghiệp [12] AHFS Drug Information 2006 (2006 ed.) American Society of Health System Pharmacists [13] Alexandra W (2009) DNA Extraction - CTAB Method, Worden Lab [14] Chang T T., Vaughan D A (1991) Manual of operations and procedures of the International genebank, IRRI [15] Engelhart S., Loock A., Skutlarek D., Sagunski H., Lommel A., Färber H and Exner M (Aug 2002) “Occurrence of toxigenic Aspergillus versicolor isolates and sterigmatocystin in carpet dust from damp indoor environments” Appl Environ Microbiol.; 68(8): 3886 – 3890 [16] Guarro J., Gené J., and Stchigel A M., (1999) Developments in fungal taxonomy Clin Microbiol Rev Vol 12, No 3, p 454 – 500 [17] Jason P L., Yu C C., Kuo H H., Tzen Y C and Barbara A S (2006), "Phylogeography of Asian wild rice, Oryza rufipogon, reveals multiple independent domestications of cultivated rice, Oryza sativa", Proc Natl Acad Sci., vol 103 No 25: 9578 – 9583 [18] Jianxin M and Bennetzen J L (2004), Rapid recent growth and divergence of rice nuclear genomes, Proc Natl Acad Sci USA 101: 12404 – 12410 [19] J.M Torres-Rodriguez, N Madrenys-Brunet, M Siddat, O Lopez- Jordra and T Jimenez (1998) Aspergillus versicolor as cause of onychomycosis: report of 12 cases and susceptibility testing to antifungal drugs J Eur Acad Dermatol Venerol 11: 25 – 31 [20] Nor A K., Madihah M Z A., Shahrizim Z., Mohd T Y and Nur A I M Z (2015) Morphological and molecular characterization of Curvularia and related species associated with leaf spot disease of rice in Peninsular Malaysia, Rendiconti Lincei Scienze Fisiche e Naturali [21] Tang J B., Xia H A., Cao M L., Zhang X Q and Zeng W Y (2004), A comparison of rice chloroplast genomes, Plant Physiol.135: 412 – 420 53 Đồ án tốt nghiệp [22] Vaughan D A (1994), The wild relative of rice – A genetic resources handbook, IRRI p – [23] Vitte C., Ishii T., Lamy F., Brar D and Panaud O (2004), Genomic paleontology provides evidence for two distinct origins of Asian rice (Oryza sativa L.), Mol Gen Genomics 272: 504 – 511 [24] Zhu Q., Zheng X., Luo J., Gaut BS and Ge S (2007), Multilocus analysis of nucleotide variation of Oryza sativa and its wild relatives: severe bottleneck during domestication of rice, Mol Biol Evol., 24: 857 – 888 Tài liệu Internet [25] https://cdtp4.wordpress.com/2011/09/21/bai-giảng-kỹ-thuật-thực- phẩm-3/ [26] https://en.wikipedia.org/wiki/Curvularia [27] https://en.wikipedia.org/wiki/Magnaporthe_grisea [28] https://en.wikipedia.org/wiki/Rhizoctonia_solani [29] https://fr.wikipedia.org/wiki/Bipolaris_oryzae [30] http://thunderhouse4-yuri.blogspot.ca/2013/07/aspergillus- versicolor.html [31] http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2011/05/curvularia-sp.html [32] https://vi.wikipedia.org/wiki/Nguy%C3%AAn_t%E1%BA%AFc_Ko ch [33] http://www2.clarku.edu/faculty/dhibbett/Protocols_Folder/Primers/Pri mers.pdf 54 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường  Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Dịch chiết khoai tây 200 g Dextrose 20 g Agar 20g Chloramphenicol 0,05 g Nước cất 1L  Môi trường PDB (Potato Dextrose Broth) Dịch chiết khoai tây 200 g Dextrose 20 g Nước cất 1L  CTAB buffer CTAB (10% in H2O) 5M NaCl 0.5M EDTA (pH 8.0) 1M Tris – HCl (pH 8.0) β - Mercaptoethanol H2 O Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC B: So sánh trình tự tương đồng đoạn gene NCBI Chủng CG1, BL1 VL1 Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC C: Kết trình tự vùng gen bảo tồn ITS Chủng CG1 Đồ án tốt nghiệp Chủng BL1 Đồ án tốt nghiệp Chủng VL1 ... xác định tác nhân gây bệnh trồng đáng tin cậy, tiết kiệm thời gian tính xác cao, tìm tác nhân gây bệnh giai đoạn đầu nhiễm bệnh Trên sở đó, tơi thực đề tài ? ?Phân lập định danh số chủng nấm gây bệnh. .. Sơ lược lúa 1.2 Một số bệnh thường gặp lúa 1.3 1.4 1.2.1 Bệnh đạo ôn (bệnh cháy lúa) 1.2.2 Bệnh đốm nâu lúa 11 1.2.3 Bệnh tiêm lửa hại lúa 13 1.2.4 Bệnh khô... nhằm xác định nấm gây bệnh lem lép hạt tỉnh Đồng sông Cửu Long, xác định 11 chủng nấm – Báo cáo khoa học “Ứng dụng phương pháp PCR việc xác định nấm gây bệnh đạo ơn lúa, Magnaporthe oryzae” Đồn