Định danh loài gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trùng gnathostoma sp trong ký chủ trung gian

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ========== LÊ THỊ NGỌC DUNG ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NhaTrang, tháng 6 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ========== ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN ĐỨC TÂN TS. TẠ THỊ MINH NGỌC Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC DUNG MSSV: 50130219 Lớp: 50CNSH Khóa: 50 NhaTrang, tháng 6 năm 2012 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến cô giáo TS. Tạ Thị Minh Ngọc đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt, tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Đức Tân (Phân viện trưởng Phân viện Thú Y Miền Trung – Trưởng bộ môn nghiên cứu Ký Sinh Trùng), Th.S Lê Đức Quyết ( Phó trưởng bộ môn nghiên cứu Ký Sinh Trùng), Th.S Nguyễn Văn Thoại, Cô Sâm và các anh ở bộ môn nghiên cứu Ký Sinh Trùng;cùng các cô, chú, anh, chị tại đơn vị thực tập đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Phân viện thú y miền Trung. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên Lê Thị Ngọc Dung i MỤC LỤC Trang MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ vi LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề 1 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp 4 1.1.1. Hình thái cấu tạo 4 1.1.2. Vòng đời phát triển 5 1.1.3. Sức đề kháng 6 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng 6 1.1.5. Điều trị 6 1.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam và trên Thế giới 7 1.2.1. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma ở Việt Nam 7 1.2.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma trên Thế giới…. 8 1.3. Đặc điểm sinh học của các ký chủ nghiên cứu 11 1.3.1. Đặc điểm sinh học của Mesocyclops leuckarti 11 ii 1.3.2. Đặc điểm sinh học của lƣơn 12 1.3.3. Đặc điểm sinh học của cá lóc 13 1.3.4. Đặc điểm sinh học của ếch 13 1.4. Phản ứng PCR 14 1.4.1. Nguyên lý của phản ứng PCR 14 1.4.2. Phân loại phản ứng PCR 17 1.4.3. Các chỉ tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 22 1.4.3.1.Các loại mẫu DNA làm khuôn 23 1.4.3.2.Enzym DNA – polymerase 23 1.4.3.3.Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi 24 1.4.3.4.I–on Magiê (Mg 2+ ) 25 1.4.3.5.Thành phần dNTP 25 1.4.3.6.Nƣớc 25 1.4.3.7.Thời gian và số lƣợng chu kỳ của phản ứng PCR 25 1.4.3.8.Yếu tố nhiệt độ của chu trình nhiệt 26 1.4.4. Phát hiện sản phẩm PCR 26 1.4.5. Độ tin cậy của phƣơng pháp PCR 28 CHƢƠNG 2: ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Địa điểm nghiên cứu 28 2.2. Nội dung nghiên cứu 29 2.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu 29 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 29 2.3.2. Trang thiết bị 29 iii 2.3.3. Các loại hóa chất 29 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 30 2.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và xác định hình thái học 30 2.4.2. Phƣơng pháp giám định loài bằng PCR 30 2.4.3. Phƣơng pháp xét nghiệm cá lóc, lƣơn và ếch 32 2.4.4. Phƣơng pháp gây nhiễm G. spinigerum 33 2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 33 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch 34 3.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma dựa vào hình thái học 35 3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lƣơn và ếch 35 3.2.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma phân lập đƣợc ở chó 36 3.3. Kết quả xác định loài bằng kỹ thuật PCR 39 3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum 40 3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 40 3.4.2. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops leuckarti 42 3.4.3. Kết quả gây nhiễm ấu trùng G. spinigerum cho cá lóc, lƣơn và ếch 45 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 47 4.1. Kết quả 47 4.2. Đề xuất ý kiến 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tên viết tắt G. spinigerum G = Gnathostoma N Tổng số mẫu L1, L2, L3 Ấu trùng kỳ 1, 2, 3 PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp – phản ứng khuếch đại gen) DNA Deoxyribonucle Acid RNA Ribonucle Acid v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3 Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn và ếch tại tỉnh Khánh Hòa 34 Bảng 3.2. Kích thƣớc ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35 Bảng 3.3. Số móc trên hành đầu của ấu trùng L3 Gnathostoma sp 35 Bảng 3.4. So sánh số móc trên hành đầu của 4 loài Gnathostoma 36 Bảng 3.5. Kích thƣớc giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó 36 Bảng 3.6. Số móc trên hành đầu giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó . 37 Bảng 3.7. Kết quả xác định loài bằng dựa vào hình thái cấu tạo và bằng PCR39 Bảng 3.8. Quá trình phát triển trứng G. spinigerum thành ấu trùng kỳ 2 40 Bảng 3.9. Kích thƣớc ấu trùng kỳ 2 G.spinigerum 40 Bảng 3.10. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops leuckarti 42 Bảng 3.11. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng G. spinigerum ở cá lóc, lƣơn, ếch qua gây nhiễm thực nghiệm 45 vi DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ Trang Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp 4 Hình 1.2. Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp 5 Hình 1.3. Giun Gnathostoma sp tạo thành khối U trong dạ dày chó 6 Hình 1.4. Hình thái Mesocyclops leuckarti 11 Hình 1.5. Sơ đồ PCR 17 Hình 3.1. Hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35 Hình 3.2. Giun Gnathostoma sp phân lập ở chó 37 Hình 3.3. Trứng Gnathostoma sp 37 Hình 3.4. Kết quả PCR 39 Hình 3.5. Các giai đoạn phát triển trứng G.spinigerum 42 Biểu đồ 3.1. Liên quan giữa kích thƣớc ấu trùng và cƣờng độ nhiễm ở Mesocyclopsleuckarti 44 Hình 3.6. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclopsleuckarti 44 Biểu đồ 3.2. Dao động kích thƣớc ấu trùng L3 theo thời gian 45 Hình 3.7: Hình ảnh gây nhiễm cá lóc, lƣơn, ếch 46 1 LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Gnathostomiasis là bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang ngƣời do loài giun tròn Gnathostoma sp gây ra. Có 12 loài gây bệnh trên động vật đã đƣợc ghi nhận, G. spinigerum, G. hispidum, G. turgidum, G.doloresi, G. nipponicum, G. americanum, G. procyonis, G. miyazakii, G. malaysiae, G. vietnamicum, G. didelphis và G.brasiliense (Daengsvang, 1980; Miyazaki, 1991). Trong đó có 4 loài gây bệnh trên ngƣời là G.spinigerum, G.hispidum, G.doloresi và G.nipponicum. Tỷ lệ nhiễm G. spinigerum cao đƣợc thông báo ở các nƣớc Châu Á nhƣ: Thái Lan, Nhật Bản, Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc, Philippines, Indoneaia và Việt Nam. Ngƣời đầu tiên nhiễm Gnathostoma sp ở Việt Nam đƣợc phát hiện năm 1963, trong những năm gần đây có nhiều trƣờng hợp nhiễm mới đƣợc phát hiện (Lê Thị Xuân, 2003; Trần Phú Mạnh Siêu, 2010). Vòng đời của Gnathostoma sp đã đƣợc thông báo trƣớc đây (Daengsvang, 1972). Giun trƣởng thành sống trong khối U của dạ dày của vật chủ cuối cùng (lợn, chó, mèo), trứng theo phân ra ngoài môi trƣờng với điều kiện nhiệt độ, ẩm độ thích hợp, ấu trùng sẽ thoát khỏi vỏ trứng, xâm nhập vào vật chủ trung gian thứ nhất (các loài giáp xác thuộc họ Cyclopidae). Khi vật chủ trung gian thứ 2 (các loài cá nƣớc ngọt, ếch, lƣơn) ăn phải vật chủ trung gian thứ nhất (Cyclops), ấu trùng tiếp tục phát triển đến giai đoạn ấu trùng kỳ 3. Ngƣời hoặc lợn, chó, mèo nhiễm bệnh do ăn phải ấu trùng kỳ 3 này. Việc chẩn đoán, giám định và phân loại nhiều loại sinh vật, trong đó có ký sinh trùng ở động vật cho đến gần đây chủ yếu vẫn dựa vào xác định đặc tính hình thái học và nuôi cấy. Mặc dầu hình thái học (kiểu hình) trong phân loại là rất thông dụng và đã có những thành tựu hết sức to lớn, nhƣng trong nhiều trƣờng hợp khó khăn gặp phải là khó phân biệt loài và dƣới loài một cách chính xác (McCarthya, Moore, 2000). Do tiêu tốn thời gian và khó tìm kiếm đúng môi trƣờng thích hợp nuôi cấy cho một số loại vi khuẩn/virus, hay vật chủ cho ký sinh trùng, bệnh phẩm đòi hỏi phải hoàn chỉnh hoặc phải ở trạng thái sống, nên các phƣơng pháp chẩn đoán dựa trên nuôi cấy và hình thái học có rất [...]... giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Định danh loài Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trùng Gnathostoma sp trong ký chủ trung gian Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch tại Khánh Hòa Xác định thành phần loài Gnathostomasp phân... ngày Kích thƣớc ấu trùng 0,49 – 0,52 mm Khi vật chủ trung gian thứ 2 (cá, ếch, rắn, lƣơn, ) ăn phải cyclop đã nhiễm ấu trùng Gnathostoma, ấu trùng di hành qua thành dạ dày đến gan hoặc cơ phát triển thành ấu trùng kỳ 3 hoàn thiện Nếu vật chủ cuối cùng ăn phải vật chủ trung gian thứ 2, ấu trùng phát triển đến giun trƣởng thành khoảng 6 – 8 tháng Hình 1.2 Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp (Nguồn dpd.cdc.gov/dpdx/html/Gnathostomiasis.htm)... giờ ấu trùng di hành đến xoang bụng (kích thƣớc 293 x 13 µm), 24 giờ (kích thƣớc 260 x 17 µm), đến ngày thứ 6 ấu trùng phát triển thành ấu trùng giai đoạn 3 o (L3) (kích thƣớc 460 x 45 µm) Ở nhiệt độ 29 – 31 C trong 7 ngày hầu hết ấu o trùng phát triển thành ấu trùng L3, nếu nhiệt độ 25 – 29 C thì thời gian phát o triển chậm hơn Ở nhiệt độ 29 – 31 C trong 8 – 9 ngày toàn bộ ấu trùng phát triển thành ấu. .. giai đoạn PCR khuếch đại trình tự DNA đích muốn tìm Phƣơng pháp này sẽ có nguy cơ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại do phải mở nắp tube PCR để cho sản phẩm cDNA của giai đoạn RT vào Tuy nhiên ngày nay nguy cơ này hoàn toàn có thể bị loại bỏ nhờ việc cho dUTP và UNG vào PCR mix của giai đoạn PCR Trong phƣơng pháp RT -PCR một bƣớc, ngƣời làm thí nghiệm thực hiện cả hai giai đoạn RT và giai đoạn PCR trong. .. lập đƣợc 2 Nghiên cứu các giai đoạn phát triển ấu trùng Gnathostoma sp ở Cyclopidae và ở cá lóc, lƣơn, ếch Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! 3 CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung Gnathostoma sp Gnathostoma. .. Gnathostoma ở ngƣời và ở nhiều loại động vật khác; tỷ lệ nhiễm đƣợc thông báo chủ yếu ở Châu Á và Nam Mỹ (Daengsvang, 1981) Vật chủ trung gian thứ nhất của Gnathostoma gồm 4 loài Cyclops (Mesocyclops leuckarti, Eucyclops agilis, Cyclops varicans và Thermocyclops sp) Cyclops sau khi nhiễm ấu trùng Gnathostoma, giai đoạn đầu ấu trùng xuất hiện trong dạ dày và thoát vỏ trở thành ấu trùng giai đoạn thứ 2, sau... xác định là loài G spinigerum, một số ít là loài G hispidum (Beaver và cs 1984) Theo Niti – Uthai S, (1974) cho biết, nếu cá ăn phải cyclops có chứa mầm bệnh Gnathostoma sp, sau 1 – 2 ngày tìm thấy ấu trùng kỳ 3 trong dạ dày và ruột, sau đó tìm thấy ở cơ, gan và ấu trùng tạo kén trong thời gian 6 – 61 ngày sau khi nhiễm Cá nƣớc ngọt, nƣớc lợ Mugil sp, Chanos đều tìm thấy ấu trùng G spinigerum trong. .. thái cấu tạo Gnathostoma sp : www.med.cmu.ac.th ) Ghi chú: (1): trứng giun Gnathostoma; (2): giun đực trƣởng thành; (3): giun cái trƣởng thành; (4): ấu trùng giun Gnathostoma; (5): phần đầu ấu 4 trùng giun Gnathostoma; (6): phần đầu giun Gnathostoma trƣởng thành; (7): đuôi của con cái trƣởng thành 1.1.2 Vòng đời phát triển Vòng đời Gnathostoma sp qua 3 vật chủ, bao gồm 2 vật chủ trung gian và 1 vật chủ. .. thành sống trong khối U ở thành dạ dày của vật chủ cuối cùng (chó, mèo, lợn, hổ, sƣ tử, báo, chồn), ở đây giun đẻ trứng, trứng theo phân ra ngoài môi trƣờng nƣớc và phát triển phôi Sau 10 – 15 ngày, trứng nở ra giai đoạn ấu trùng kỳ 1 (L1) Ấu trùng L1 bị ăn bởi vật chủ trung gian thứ nhất (giáp xác thuộc họ Cyclopidae), ấu trùng di hành qua thành dạ dày, tới khoang cơ thể phát triển thành ấu trùng kỳ... Almeyda–Artigas và cộng sự, (2000) đã giải trình tự gen ITS–2 rDNA cho thấy loài Gnathostoma spinigerum ở Thái Lan khác với loài Gnathostoma binucleatum ở Mexico và Ecuador Loài Gnathostoma turgidum, Gnathostoma sp. I chính là loài Gnathostoma procyonis (Almeyda–Artigas, 1994) Ở Mexico Gnathostoma gây bệnh cho ngƣời đƣợc xác định là loài G spinigerum và G binucleatum Rojekittikhun và cộng sự (2002) nghiên cứu ở . SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ========== ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN ĐỒ. thuật PCR 39 3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum 40 3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 40 3.4.2. Các giai đoạn phát triển của ấu. nghiên cứu Ký sinh trùng Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Định danh loài Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát triển của ấu trùng Gnathostoma