2.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Pha 2 dung dịch buffer:
AW1: hút 2,375 ml AW1 và pha với 3,125 ml cồn. AW2: hút 1,663 ml AW2 và pha với 3,837 ml cồn
Cắt nhỏ 25 mg mẫu giun Gnathostoma cho vào ống Eppendorf, cho
thêm 180 µl Buffer ATL vào huyễn dịch mẫu, thêm 20 µl proteinase K, Vortex
nhẹ, sau đó ủ ở 560C (1 – 3 giờ) trong bể điều nhiệt cách thủy cho đến khi mô
đƣợc phân hủy hoàn toàn.
Vortex nhẹ trong 15 giây. Thêm 200 µl Buffer AL vào mỗi mẫu, Vortex. Sau đó thêm 200 µl Ethanol (96 – 100%), Vortex.
Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc DNeasy (mini colum).
Sau đó ly tâm lạnh ở 200C, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dƣới,
giữ lại phần cột có màng lọc.
Thêm 500 µl Buffer AW1. Ly tâm ở 200C, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ
dịch ly tâm.
Thêm 500 µl Buffer AW2. Ly tâm ở 200C, 13000 vòng trong 3 phút. Bỏ
Lấy cột đặt vào ống Eppendorf 1,5 ml (mới) có ghi kí hiệu của mẫu. Thêm 100 µl Buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm ở
200C, 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống Eppendorf.
Dịch ly tâm chính là DNA tổng số, bảo quản – 200C.
2.4.2.2. Khuyếch đại gen ITS2 bằng kỹ thuật PCR
DNA đích đƣợc nhân lên bằng phản ứng PCR, với bộ hóa chất PCR Master Mix Kit của hãng Promega.
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: Thứ tự Thành phần Số lƣợng (µl) 1 PCR Master Mix 25 2 Primer F 2 3 Primer R 2 4 Nƣớc tinh khiết 11
5 DNA khuôn (Template) 10
Tổng 50 Chu trình PCR nhƣ sau: o 950C 5 phút o 950C 1 phút o 550C 1 phút 30cycles o 720C 2 phút o 720C 5 phút o 100C hold
2.4.2.3. Điện di kiểm tra kết quả PCR trên agarose 2%
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lƣợc vào khuôn.
Pha 130 ml gel agarose 2% : lấy 2,6 g agarose nguyên chất (dạng bột khô), cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 25ml dung dịch TBE 1X, cho vào lò vi sóng (microwave) đun nóng chảy trong 2 phút sao cho agarose tan
chảy hết, để nguội khoảng 50 – 600C bổ sung thêm 0,9 µl dung dịch nhộm
Ethidium Bromide vào thạch. Sau đó đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lƣợc có 10 răng, đổ thạch ngập khoảng 2/3 răng lƣợc và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20-30 phút). Khi nguội các răng tạo thành lỗ (giếng) để tra mẫu vào kiểm tra.
Dìm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TBE 1X (đệm TBE cung cấp ion cho điện trƣờng hoạt động).
Tra mẫu: lấy 5µl sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 1 µl chỉ thị màu Loading Dye rồi tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch.
Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 110V khoảng 30 – 35 phút Sau đó đƣa gel vào máy đọc gel GenDoc → đọc kết quả.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});