Một phản ứng PCR đòi hỏi có 6 thành phần tham gia: 1) DNA làm khuôn; 2) mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc); 3) Enzym DNA–polymerase
deoxynucleotit (ký hiệu dNTP) và 6) Nƣớc tinh khiết. Phản ứng PCR còn phụ thuộc các yếu tố nhiệt độ (chu trình nhiệt), thời gian và tổng số chu kỳ nhiệt áp dụng và rất nhiều điều kiện khác. Sau đây chúng tôi xin đƣợc giới thiệu một số chỉ tiêu ảnh hƣởng đến phản ứng PCR:
1.4.3.1. Các loại mẫu DNA làm khuôn
Phản ứng PCR tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhƣng nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào. Lƣợng DNA mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao (khoảng 100ng). Hơn nữa việc giảm lƣợng mẫu ban đầu còn hạn chế đƣợc các hiện tƣợng nhân bản giả tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn. Một ƣu điểm lớn khác của PCR là cho phép nhân bản cả những mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần nhƣ trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá thạch, tóc, móng tay của ngƣời đã chết... (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2003).
1.4.3.2. Enzym DNA – polymerase
Enzym đƣợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì đây là enzym không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzym mới vào mỗi phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzym cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lai thấp khiến phản ứng giả đƣợc hình thành rất cao,...). Phƣơng pháp PCR chuyển sang một bƣớc ngoặt mới cùng với sự phát hiện một loại DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một vi khuẩn sống
trong suối nƣớc nóng có tên gọi là Thermus aquaticus. Enzym này có tên gọi là
Taq polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Điều này cho phép có thể tự động hoá tất cả các bƣớc của chu trình nhân DNA, nhờ tạo ra một bộ máy tự động có khả năng điều khiển đƣợc các công đoạn cả về nhiệt độ và thời gian. Từ đó máy chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycler) ra đời và hiện nay có hàng chục loại do rất nhiều hãng khác nhau trên thế giới sản xuất, trƣớc hết là các hãng Perkin Elmer, MJ, Eppendorf...
Taq polymerase không đặc hiệu cho bất kỳ một phân tử DNA riêng biệt nào, chính vì vậy tất cả các phản ứng PCR sử dụng mồi và khuôn khác nhau đều sử dụng Taq polymerase. Mặt khác một đặc điểm quan trọng của Taq polymerase là có khả năng gắn thêm vào đầu 3’ một nucleotit là Adenine (A). Đây là một điểm quan trọng để trong quá trình dòng hoá ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để gắn sản phẩm của PCR vào một số loại plasmid có đầu lồi 5’ là Thymine (T). Một nhƣợc điểm của Taq polymerase là: loại enzym này chỉ có khả năng tổng hợp đƣợc các loại ADN có độ dài dƣới 3 kb (dƣới 3000 nucleotit), do vậy muốn nhân bản DNA có độ dài dài lớn hơn (3 – 20 kb) phải cần hoặc kết hợp với những loại enzym khác.
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đƣợc đƣa ra thị trƣờng với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn, ví dụ: Tth polymerase, một enzym tách chiết từ vi khuẩn Thermus thermophilus; Elongase (bao gồm nhiều enzym kết hợp trong đó có thành phần Taq polymerase) (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2003; Thomas, 1996).
1.4.3.3. Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồi
Mồi (primer) là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đƣợc một sự nhân bản đặc trƣng và hiệu quả cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR có chất lƣợng cao trên khuôn DNA biết trƣớc. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phƣơng pháp PCR và phải tuân thủ một số nguyên tắc sau:
Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngƣợc, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair – loop forming) do sự bắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotit của một mồi.
Nhiệt độ nóng chảy (Tm – melting temperature) của mồi xuôi và mồi
ngƣợc không cách biệt quá xa (thông thƣờng trong khoảng 4 – 5oC).
Các mồi chọn phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần nhân bản, không trùng với các trình tự lặp lại trên gen.
Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thƣờng là 18 – 30 nucleotit. Nếu quá ngắn (dƣới 10 nucleotit), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu
quá dài (trên 30 nucleotit), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tổng hợp hay kéo dài) sẽ ảnh hƣởng đến cơ chế bám của mồi. Nhiệt độ nóng chảy của
mồi không đƣợc vƣợt quá chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (72oC) (Hồ Huỳnh
Thuỳ Dƣơng, 2003).
1.4.3.4. I–on Magiê (Mg2+)
I–on Magiê (Mg2+) là thành phần không thể thiếu đƣợc của phản ứng
PCR. Nồng độ Mg2+ cuối cùng để một phản ứng PCR thực hiện đƣợc là 100 –
250 µm, tối ƣu là 150 – 200 µm. Trong nhiều trƣờng hợp, cần thực hiện một dãy phản ứng PCR với nồng độ thay đổi (100 – 125 – 150 – 175 – 200 – 225 –
250 µm) để tối ƣu hoá (optimization) nồng độ Mg2+ cuối cùng cho phản ứng
PCR thành công (Lê Thanh Hoà và cs, 2001; Thomas, 1996).
1.4.3.5. Thành phần dNTP
Bốn loại nucleotit trong phản ứng PCR thƣờng đƣợc sử dụng ở dạng deoxy – nucleotit (dNTP bao gồm dATP; dCTP; dGTP và dTTP) và ở nồng độ cuối cùng là 200 µm /mỗi nucleotit. Nồng độ cao hơn hay thấp hơn dễ dẫn đến sự tạo nên sản phẩm PCR giả. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotit lại làm tăng các lỗi sao chép của enzym DNA – polymerase (Lê Thanh Hoà và cs, 2001b).
1.4.3.6. Nƣớc
Nƣớc sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa bất kỳ ion nào, không chứa enzym phân hủy DNA (DNAase), phân hủy RNA (RNAase), enzym giới hạn cắt DNA (endonuclease) và bất kỳ các thành phần nào khác. Ion khác lạ sẽ ảnh hƣởng nồng độ dung dịch đệm trong phản ứng, các loại enzym sẽ phân hủy hay cắt bỏ DNA làm khuôn hoặc sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà và cs, 2001b).
1.4.3.7. Thời gian và số lƣợng chu kỳ của phản ứng PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian cho 1 chu kỳ khởi đầu mục đích bung liên kết chuỗi xoắn kép
gian cho giai đoạn 1 (bung liên kết) là 10 giây – 2 phút; thời gian cho giai đoạn 2 (mồi bám) không quá nhanh hoặc quá lâu, thông thƣờng dƣới 1 phút; thời gian cho giai đoạn 3 (tổng hợp) tuỳ thuộc vào độ dài vùng DNA cần nhân bản, nhƣng nói chung theo quy luật, một phút cho 1 kb. Ví dụ: cần có sản phẩm PCR là 3 kb, thời gian thích hợp là 3 phút. Thời gian dài hơn không ảnh hƣởng lớn đến nhân bản DNA có độ dài ngắn hơn.
Trong thực tế, phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong 25 – 40 chu kỳ, và không đƣợc vƣợt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR. Sở dĩ nhƣ vậy là vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn: trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân tỷ lệ với lƣợng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả phản ứng giảm hẳn vì những nguyên nhân:
+ Có sự phân hủy xảy ra và cạn kiệt các thành phần của phản ứng. + Có sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
+ Các bản sao vừa đƣợc tổng hợp không kết hợp với các cặp mồi mà bắt cặp với nhau.
Phản ứng PCR ít khi đƣợc thực hiện dƣới 25 chu kỳ, vì nhƣ thế, số lƣợng nhân bản sẽ ít và lƣợng DNA thu đƣợc trong sản phẩm PCR thấp (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2003).
1.4.3.8. Yếu tố nhiệt độ của chu trình nhiệt
Một yếu tố quan trọng bảo đảm sự thành công của phản ứng PCR là nhiệt độ của chu trình nhiệt ở giai đoạn thứ 2 khi mồi bám vào khuôn (giai đoạn mồi bám). Một kinh nghiệm có tính quy luật là nhiệt độ cho mồi bám phải
thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi là ít nhất 4oC (Lê Thanh Hoà và
cs,2001b; Thomas, 1996).