2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu giun trƣởng thành và ấu trùng Gnathostoma sp thu thập từ vật chủ
cuối (chó) và vật chủ trung gian (cá, lƣơn, ếch).
Các loài giáp xác thuộc họ Cyclopidae, cá lóc, lƣơn, ếch và các loại cá nƣớc ngọt khác.
2.3.2. Trang thiết bị
Kính hiển vi có gắn Micrometer thị kính, kính hiển vi soi nổi, tủ lạnh, cân điện tử, máy ly tâm lạnh, Vortex, bể điều nhiệt cách thủy (water bath).
Máy đo nồng độ DNA, máy PCR GeneAmp PCR system 9700 AB (Applied Biosystem, Mỹ), máy soi và chụp gel Dolphin Doc (Wealtec, Mỹ), bộ điện di kiểm tra sản phẩm PCR của hãng Bio-Rad.
2.3.3. Các loại hóa chất
Bộ kít tách DNA tổng số QIAamp DNA extraction kít của hãng QIAGEN Inc (Mỹ) và hóa chất cần thiết do hãng cung cấp.
Cặp mồi Forward : (5’ – TGTGTCGATGAAGAACGCAG – 3’) và Reverse: (5’ – TTCTATGCTTAAATTCAGGGG – 3’) đƣợc sử dụng để nhân đoạn gen thuộc ITS2.
Dung dịch muối bão hòa ( NaCl, ZnSO4, MgSO4), Cồn, dung dịch HCl.
Và một số hóa chất cần thiết để nghiên cứu ký sinh trùng học và phƣơng pháp PCR.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và xác định hình thái học
Thu thập ngẫu nhiên lƣơn, ếch, cá lóc bán ở tỉnh Khánh Hòa, các mẫu thu thập ghi đầy đủ số liệu về nguồn gốc mẫu, hình thức nuôi và các thông số cần thiết khác.
Xác định hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp theo Miyazaki (1952)
và Koga và ctv (1985).
Xác định hình thái giun Gnathostoma sp theo Miyazaki (1960) và
Daengsvang (1980).
2.4.2. Phƣơng pháp giám định loài bằng PCR 2.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số 2.4.2.1. Tách chiết DNA tổng số
Pha 2 dung dịch buffer:
AW1: hút 2,375 ml AW1 và pha với 3,125 ml cồn. AW2: hút 1,663 ml AW2 và pha với 3,837 ml cồn
Cắt nhỏ 25 mg mẫu giun Gnathostoma cho vào ống Eppendorf, cho
thêm 180 µl Buffer ATL vào huyễn dịch mẫu, thêm 20 µl proteinase K, Vortex
nhẹ, sau đó ủ ở 560C (1 – 3 giờ) trong bể điều nhiệt cách thủy cho đến khi mô
đƣợc phân hủy hoàn toàn.
Vortex nhẹ trong 15 giây. Thêm 200 µl Buffer AL vào mỗi mẫu, Vortex. Sau đó thêm 200 µl Ethanol (96 – 100%), Vortex.
Chuyển toàn bộ hỗn dịch sang ống có màng lọc DNeasy (mini colum).
Sau đó ly tâm lạnh ở 200C, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ dịch ly tâm bên dƣới,
giữ lại phần cột có màng lọc.
Thêm 500 µl Buffer AW1. Ly tâm ở 200C, 8000 vòng trong 1 phút. Bỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
dịch ly tâm.
Thêm 500 µl Buffer AW2. Ly tâm ở 200C, 13000 vòng trong 3 phút. Bỏ
Lấy cột đặt vào ống Eppendorf 1,5 ml (mới) có ghi kí hiệu của mẫu. Thêm 100 µl Buffer AE. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Sau đó ly tâm ở
200C, 8000 vòng trong 1 phút. Thu dịch ly tâm trong ống Eppendorf.
Dịch ly tâm chính là DNA tổng số, bảo quản – 200C.
2.4.2.2. Khuyếch đại gen ITS2 bằng kỹ thuật PCR
DNA đích đƣợc nhân lên bằng phản ứng PCR, với bộ hóa chất PCR Master Mix Kit của hãng Promega.
Thành phần phản ứng PCR bao gồm: Thứ tự Thành phần Số lƣợng (µl) 1 PCR Master Mix 25 2 Primer F 2 3 Primer R 2 4 Nƣớc tinh khiết 11
5 DNA khuôn (Template) 10
Tổng 50 Chu trình PCR nhƣ sau: o 950C 5 phút o 950C 1 phút o 550C 1 phút 30cycles o 720C 2 phút o 720C 5 phút o 100C hold
2.4.2.3. Điện di kiểm tra kết quả PCR trên agarose 2%
Chuẩn bị khuôn đổ thạch, gắn lƣợc vào khuôn.
Pha 130 ml gel agarose 2% : lấy 2,6 g agarose nguyên chất (dạng bột khô), cho vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 25ml dung dịch TBE 1X, cho vào lò vi sóng (microwave) đun nóng chảy trong 2 phút sao cho agarose tan
chảy hết, để nguội khoảng 50 – 600C bổ sung thêm 0,9 µl dung dịch nhộm
Ethidium Bromide vào thạch. Sau đó đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lƣợc có 10 răng, đổ thạch ngập khoảng 2/3 răng lƣợc và để nguội ở nhiệt độ phòng (khoảng 20-30 phút). Khi nguội các răng tạo thành lỗ (giếng) để tra mẫu vào kiểm tra.
Dìm ngập khay thạch trong hộp điện di chứa dung dịch đệm TBE 1X (đệm TBE cung cấp ion cho điện trƣờng hoạt động).
Tra mẫu: lấy 5µl sản phẩm PCR mỗi loại, trộn với 1 µl chỉ thị màu Loading Dye rồi tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch.
Tiến hành chạy điện di ở hiệu điện thế 110V khoảng 30 – 35 phút Sau đó đƣa gel vào máy đọc gel GenDoc → đọc kết quả.
2.4.3. Phƣơng pháp xét nghiệm cá lóc, lƣơn và ếch
Trình tự phƣơng pháp tiêu cơ theo Rojekittikhun (2002):
Xác định loài cá, lƣơn, ếch (Cân đo kích thƣớc từng cá thể và ghi lại). Nghiền hoặc cắt nhỏ từng mẫu cơ và cơ quan nội tạng (có thể nghiền 10- 20g mẫu từ các phần khác nhau).
Chuyển mẫu nghiền vào cốc 100 ml có chứa 50 ml dung dịch tiêu cơ (8 ml HCL + 10 g Pepsin trong 1000 ml nƣớc cất). Tùy theo khối lƣợng mẫu có thể dùng cốc đong lớn và chứa nhiều dung dịch tiêu cơ hơn; Dung dịch tiêu cơ nên ngập quá 1/3 thể tích mẫu.
Trộn đều hỗn hợp đặt vào tủ ấm 370C trong 2 – 3 giờ (hoặc lâu hơn cho
những phần cứng).
Lọc sản phẩn tiêu cơ qua lƣới lọc và rửa với nƣớc muối 0,85%, để lắng cặn.
Loại bỏ phần nổi, giữ lại phần lắng cặn (lặp lại 4 – 5 lần) cho đến khi phần chất cặn trở nên trong.
Chuyển chất lắng vào đĩa Petri có chứa 0,85% nƣớc muối, xoay nhẹ đĩa bằng tay làm sao cho chất cặn tập trung vào giữa và dùng pipet hút bỏ phần nhẹ nổi lên trên.
Quan sát trên kính hiển vi soi nổi và định loại trên kính có độ phóng đại phù hợp (10X 40).
Tính số lƣợng ấu trùng có trong đĩa, thu thập và bảo quản trong cồn 70% để giám định lại bằng sinh học phân tử.
2.4.4. Phƣơng pháp gây nhiễm G. spinigerum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trứng thu thập trong khối U ở dạ dày chó nhiễm bệnh, rửa 3 lần với nƣớc cất. Cho trứng vào đĩa petri có chứa nƣớc cất hoặc nƣớc ao, để ở phòng
thí nghiệm, nhiệt độ khoảng 27 ± 20C và theo dõi sự phát triển phôi bào bên
trong trứng. Khi trứng nở, thu thập ấu trùng gây nhiễm cho Mesocyclops
leuckarti.
Cyclops đƣợc thu thập từ những ao, hồ trong tự nhiên bằng lƣới vớt sinh
vật phù du (độ dày mắt lƣới 250 µm) và xác định loài Mesocyclops leuckarti
theo Đặng Ngọc Thanh và cộng sự (1980).
Mesocyclops leuckarti đƣợc phân ra 5 nhóm (500 M. leuckarti/ nhóm) và gây nhiễm ấu trùng L2 lần lƣợt là 600, 800, 1000, 1200 và 1500. Trong
Mesocyclops leuckarti, ấu trùng kỳ 2 phát triển đến giai đoạn đầu của kỳ 3 thì gây nhiễm cho vật chủ trung gian thứ 2 (cá, lƣơn và ếch). Các giai đoạn phát triển của ấu trùng đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi có gắn Micrometer thị kính.
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Kết quả đƣợc phân tích thống kê bằng phần mềm Excel 2007, sử dụng ANOVA.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3 Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn và ếch tại tỉnh Khánh Hòa Loài xét nghiệm Số con xét nghiệm Số con dƣơng tính (%) Tổng số ấu trùng phân lập
Nơi phân lập ấu trùng
Cá lóc 52 1 (1,92) 2 Gan
Lƣơn 32 2 (6,25) 3 Gan
Ếch 37 1 (2,70) 2 Gan
Chúng tôi thu thập đƣợc tổng số 52 cá lóc, 32 lƣơn, 37 ếch ở một số chợ thuộc tỉnh Khánh Hòa và xét nghiệm để xác định tỷ lệ nhiễm ấu trùng
Gnathostoma sp. Kết quả xét nghiệm ở bảng 3.1 cho thấy, trong tổng số 52 mẫu cá lóc xét nghiệm có 1 mẫu nhiễm ấu trùng, cƣờng độ nhiễm 2 ấu trùng/cá lóc; trong tổng số 32 mẫu lƣơn xét nghiệm, có 2 mẫu nhiễm ấu trùng, cƣờng độ nhiễm 3 ấu trùng/lƣơn và trong tổng số 37 mẫu ếch xét nghiệm, có 1 mẫu nhiễm ấu trùng, cƣờng độ nhiễm 2 ấu trùng/ếch. Tất cả ấu trùng phân lập đƣợc ở gan của cá, ếch và lƣơn.
Các thông báo trƣớc đây cho biết tỷ lệ nhiễm ấu trùng G. spinigerum ở
lƣơn tại TPHCM là 0,11% (Lê Thị Xuân, 2000), ở Củ Chi và Long An tỷ lệ nhiễm là 7,8% – 19,6% ở mùa mƣa và từ 0,8% – 2,5% ở mùa khô (Trần Phú
Mạnh Siêu và cộng sự, 2009), ở tỉnh Nakhon Nayok, Thái Lan tỷ lệ nhiễm
30,1%, trung bình 10 ấu trùng/lƣơn, trong đó 44,1% ở tháng 8 và 10,7% ở tháng 3 (Rojekittikhun W, 2002), ở tỉnh Guayas, Ecuador tỷ lệ nhiễm 69%, trung bình là 1,7 ấu trùng (Jimenez, 2009). Tỷ lệ cá lóc ở miền Trung của Myanmar nhiễm 13,3% (Bong – Kwang Jung (2008) và 7 – 72% ở Thái Lan (Daengsvang, 1980). Tỷ lệ cá lóc ở Thái Lan nhiễm 0,3 – 92% (Daengsvang, 1980). Nhƣ vậy, qua so sánh với các nghiên cứu trƣớc thì tỷ lệ nhiễm ấu trùng
3.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma dựa vào hình thái học 3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lƣơn và ếch 3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lƣơn và ếch
Hình 3.1. Hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc
(H: hành đầu; I: ruột; E: thực quản; L: môi)
Bảng 3.2. Kích thƣớc ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc Kích thƣớc
Cơ thể Dao động Trung bình
Chiều dài (mm) 1,5 – 2,4 1,95 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiều rộng (mm) 0,16 – 0,23 0,195
Ghi chú: n = 7
Bảng 3.3. Số móc trên hành đầu của ấu trùng L3 Gnathostoma sp
Hàng móc Số móc Dao động Trung bình I 39 – 44 42 II 42 – 47 44 III 43 – 49 46 IV 47 – 54 51 Ghi chú: n = 7 Ấu trùng L3 H E I L
Bảng 3.4. So sánh số móc trên hành đầu của 4 loài Gnathostoma
Loài Gnathostoma Hàng móc
I II III IV
G.nipponicum (Miyazaki, 1952) 29 – 36 (32) 30 – 37 (35) 31 – 41 (37) Không có
G.dolorest (Miyazaki, 1952) 34 – 42 (38) 35 – 43 (40) 34 – 39 (36) 33 – 41 (37)
G.hispidum (Koga và ctv, 1985) 32 – 38 (36) 37 – 41 (40) 39 – 44 (42) 42 – 48 (45)
G. spinigerum(Miyazaki, 1952) 40 – 47 (43) 37 – 49 (45) 42 – 52 (47) 48 – 58 (52)
Kết quả hiện tại 39 – 44 (42) 42 – 47 (44) 43 – 49 (46) 47 – 54 (51)
Kết quả mô tả hình thái ấu trùng Gnathostoma phân lập đƣợc trên cá
lóc, lƣơn và ếch đƣợc thể hiện ở bảng 3.2, bảng 3.3 và hình 3.1. Cấu tạo ấu trùng gồm có hành đầu, 2 môi, thực quản và ruột, 2/3 cơ thể về phía trƣớc đƣợc bao phủ gai và trên hành đầu có 4 hàng móc (số móc từ hàng 1 đến 4 lần lƣợt là 42, 42, 46 và 51). Kích thƣớc chiều dài dao động từ 1,5 – 2,4 mm; chiều rộng dao động từ 0,16 – 0,23 mm.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy loài G. nipponicum có 3 hàng móc, trong
khi đó loài G. dolorest, G. hispidum và G. spinigerum có 4 hàng móc, nhƣng số
móc của mỗi hàng là khác nhau. Nhƣ vậy, từ kết quả mô tả hình thái học và so sánh với kết quả của tác giả Koga và ctv (1985); Miyazaki (1952) cho thấy,
loài Gnathostoma chúng tôi phân lập đƣợc trên lƣơn, cá lóc, ếch ở Khánh Hòa
là G. spinigerum.
3.2.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma phân lập đƣợc ở chó
Bảng 3.5. Kích thƣớc giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó ( n=30)
Đặc điểm Cơ thể (mm) Hành đầu (mm)
Dài Rộng Dài Rộng
Giun cái
Dao động 18 – 29 2,1–3,0 0,4–0,55 0,8–1,2
Giun đực
Dao động 15 – 20 1,2–2,0 0,3–0,45 0,6–0,9
Trung bình 18±1,6 1,7±0,3 0,4±0,04 0,7±0,1
Bảng 3.6. Số móc trên hành đầu giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó ( n=30)
Số móc Hàng móc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I II III IV V VI VII
Dao động 31-37 42–45 55–61 65–68 71–76 73–79 78–85 Trung bình 34,5±2,0 43,4±1,1 58,0±1,9 66,5±1,7 74,8±1,8 76,4±2,0 81,4±2,5
Hình 3.2. Giun Gnathostoma sp phân lập ở chó
Hình 3.3. Trứng Gnathostoma sp
Từ kết quả ở bảng 3.5, bảng 3.6 và hình 3.2, hình 3.3 cho thấy hình thái
của giun Gnathostoma phân lập đƣợc nhƣ sau:
Giun đực 18x1,7 mm
Giun cái 25,8x2,5 mm
Giun trƣởng thành sống trong khối u ở dạ dày chó, khi giun còn sống, cơ thể có 3 màu rõ rệt: phần đầu màu trắng, giữa thân màu đỏ và cuối thân màu hồng.
Cấu tạo cơ thể gồm có hành đầu, thực quản, ruột, tử cung, miệng, 2 môi, 2/3 cơ thể về phía trƣớc đƣợc bao phủ những hàng gai (mỗi hàng có từ 70 – 90 móc).
Kích thƣớc giun cái: chiều dài dao động từ 18 – 29 mm (trung bình 25,8 ± 3,9), chiều rộng dao động từ 2,1 – 3,0 mm (trung bình 2,5 ± 0,3), hành đầu 0,5 ± 0,04 x 1,0 ± 01 mm (dài x rộng).
Kích thƣớc giun đực: chiều dài dao động từ 15 – 20 mm (trung bình 18±1,6), chiều rộng dao động từ 1,2 – 2,0 mm (trung bình 1,7 ± 0,3), hành đầu 0,4 ± 0,04 x 0,7 ± 0,1 mm (dài x rộng).
Trên hành đầu của giun có 7 hàng móc, số móc từ hàng 1 đến 7 lần lƣợt là 34,5 ± 2,0 (31 – 37); 43,4 ± 1,1 (42 – 45); 58 ± 1,9 (55 – 61); 66,5 ± 1,7 (65 – 68); 74,8 ± 1,8 (71 – 76); 76,4 ± 2,0 (73 – 79) và 81,4 ± 2,5 (78 – 85).
Trứng giun hình bầu dục, 2 lớp vỏ, đầu nhỏ trứng có nắp, bên trong có 1 hoặc 2 tế bào phôi; kích thƣớc (dài x rộng): 0,068 – 0,081 x 0,038 – 0,043mm.
Các nghiên cứu trƣớc đây cho biết có 12 loài Gnathostoma gây bệnh
trên động vật (Daengsvang, 1980; Miyazaki, 1991), trong đó có 4 loài ở Việt
Nam là G.spinigerum, G. hispidum, G. vietnamicum, G. doloresi. Theo Le VH
(1965) thì đặc điểm cơ bản để phân biệt 4 loài Gnathostoma là, G. spinigerum
có 7 hàng móc trên hành đầu, 2/3 cơ thể đƣợc phủ gai; trong khi G.hispidum,
G. doloresi, G. hispidum và G. procyonis có 12 hàng móc và toàn bộ cơ thể
đƣợc bao phủ gai. Kích thƣớc trứng G. doloresi là 58,7 x 33,3 µm, G.procyonis
là 71 x 39 µm, G. hispidum là 66 x 38 µm, G. nipponicum là 73,7 x 42 µm và
G.binucleatum là 64 x38 µm. Nhƣ vậy, từ kết quả so sánh giữa các nghiên cứu
và dựa theo khóa phân loại của Miyazaki (1960) thì loài Gnathostoma phân lập
3.3. Kết quả xác định loài bằng kỹ thuật PCR
Bảng 3.7. Kết quả xác định loài bằng dựa vào hình thái cấu tạo và bằng PCR
Loại mẫu
Dựa vào hình thái học Kỹ thuật PCR
Số mẫu Tên loài Số mẫu Tên loài
Ấu trùng kỳ 3 7 G. spinigerum 7 G. spinigerum (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giun trƣởng
thành 30 G. spinigerum 30 G. spinigerum
Hình 3.4. Kết quả PCR
Ghi chú: M: Gen Marker; N: mẫu đối chứng âm ( DNA tách chiết từ
giun thực quản Spirocerca); 1,2,3: các mẫu DNA Gnathostoma 1, 2, 3.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thiết lập thành công phản ứng PCR để
phát hiện giun Gnathostoma trên vật nuôi. Trong số 7 mẫu ấu trùng kỳ 3 ở cá
lóc, lƣơn, ếch và 30 mẫu giun trƣởng thành ở chó đƣợc xác nhận bằng phƣơng pháp dựa vào hình thái học ở trên, tất cả đƣợc tách ADN tổng số bằng bộ sinh
M N 1 2 3
phẩm QIAamp DNA extraction kit của hãng QIAGEN ( Đức) theo quy trình nhà sản xuất cung cấp. Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi ITS2, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 2%. Kết quả ở bảng 3.7 và hình 3.4 cho
thấy loài phân lập đƣợc ở cá lóc, lƣơn, ếch là G. spinigerum.
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi ITS2: Forward : (5’–
TGTGTCGATGAAGAACGCAG–3’) và Reverse: (5’–
TTCTATGCTTAAATTCAGGGG –3’) cho sản phẩm là đoạn gen 5,8S và 28S rRNA có kích thƣớc khoảng 647bp (hình 3.7), trong khi đó, mẫu chứng âm cho kết quả âm tính đúng nhƣ mong đợi. Điều này cho thấy phản ứng đã nhân đƣợc
đoạn gen đặc hiệu của G. spinigerum.
3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum
3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 Bảng 3.8. Quá trình phát triển trứng G. spinigerum thành ấu trùng kỳ 2 Bảng 3.8. Quá trình phát triển trứng G. spinigerum thành ấu trùng kỳ 2
Môi trƣờng Số trứng thí nghiệm Số trứng nở ra ấu trùng Tỷ lệ nở (%) Thời gian nở (ngày) Thời gian sống ấu trùng (giờ) Dao động Trung bình Dao động Trung bình Nƣớc cất 5000 4366 87,32 7 – 14 10 36–140 68 Nƣớc ao 5000 2819 56,38 8 – 15 12 18 –52 44 Bảng 3.9. Kích thƣớc ấu trùng kỳ 2 G.spinigerum Kích thƣớc (mm)
Cơ thể Dao động Trung bình
Chiều dài(n=100) 410 – 420 416 ± 3,5
Chiều rộng(n=100) 17 – 22 18,9 ± 1,6
Kết quả thí nghiệm trứng G. Spinigerum trong môi trƣờng nƣớc ở bảng
Trứng mới phân lập trong khối U ở dạ dày chó có 1 hoặc 2 tế bào phôi. Từ ngày ngày thứ 2 trở đi, phôi bào trong trứng phân ra 2 – 4 tế bào, sau đó phân thành nhiều tế bào và cuối cùng xuất hiện dạng phôi dâu, phôi nang (một khối tế bào đặc).
Đến ngày thứ 6, đã xuất hiện hình dạng ấu trùng (gọi là ấu trùng kỳ 1): Ấu trùng kỳ 1 có cấu tạo đơn giản, một đầu tròn, một đầu nhọn và đƣợc bọc bởi màng mỏng. Ở kỳ 1, ấu trùng hoạt động nhƣng rất chậm.
Sau ngày thứ 7, ấu trùng hoạt động mạnh hơn, phá vở màng bọc và ra ngoài từ nắp của vỏ trứng (gọi là ấu trùng kỳ 2):
Ấu trùng kỳ 2 là hình trụ tròn chạy từ phần đầu đến phần đuôi, phần đầu