Đánh giá các dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn

i LỜI CẢM ƠN Với tất cả chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn đến KS. Đặng Thị Hồng Vân, người đã trực tiếp định hướng nghiên cứu, tận tình chỉ bảo và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi cũng xin cảm ơn tới anh Bùi Tấn Đợi, đã giúp đỡ tôi trong quá trình tiến hành thực hiện đề tài, cùng các anh chị phòng nghiên cứu, những người đã tạo cho mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ của mình. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS. Nguyễn Thị Anh Thư, người đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang, cùng toàn thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã tận tình chỉ dạy và cho tôi nhiều kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua. Tôi cũng chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Vắc-Xin và Sinh phẩm y tế đã đồng ý cho tôi thực tập tại Viện và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề tài. Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình cùng toàn thể bạn bè thân thiết, những người đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Nha Trang, tháng 7 – 2012 Sinh viên Nguyễn Thị Huyền Trang ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i PHẦN MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 5 I.TỔNG QUAN VỀ RẮN 5 1. Đặc điểm cơ bản về rắn 6 2. Bản chất sinh hóa và các tác động của nọc rắn lên cơ thể người[1].9 2.1. Thành phần hóa học của nọc độc rắn 9 2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến tính độc của nọc rắn 10 2.3. Các tác động của nọc rắn lên cơ thể người 12 3. Rắn Hổ Đất 15 3.1. Phân loại khoa học 15 3.2. Hình dáng: 15 3.3. Sinh thái và tập tính 16 3.4.Phân bố 17 3.5. Nọc độc và thành phần chính 17 II. CÁC DẠNG BẢO QUẢN 18 1. Đông Khô 20 2. Dạng dung dịch 22 2.1. Nước muối sinh lý 22 2.2. Glycerol 22 CHƯƠNG II :VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 I.VẬT LIỆU 25 1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25 2.MÁY MÓC VÀ DỤNG CỤ 25 iii 2.1. Máy móc 25 2.2. Dụng cụ 25 3. HÓA CHẤT VÀ DUNG MÔI 26 3.1. Hoá chất 26 3.2. Dung môi 27 II.PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 28 1. KIỂM TRA LD50 29 1.1.Mục đích : 29 1.2.Tiến hành 29 2. KIỂM TRA TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA KHÁNG NGUYÊN 31 2.1. Nguyên tắc 31 2.2. Tiến hành: 33 3. KIỂM TRA HÀM LƯỢNG PROTEIN 34 3.1. Nguyên tắc 34 3.2. Tiến hành 35 CHƯƠNG III :KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ36 I. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined. II. KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined. III. KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC HÌNH iv iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Sơ đồ hướng tiến hành đề tài 1 Hình 2.2. Bảng thăm dò giá trị LD 50 của dung dịch nọc rắn mẹ 30 Hình 2.3. Bảng nồng độ pha tiêm của dung dịch nọc rắn 30 Hình 2.2: kháng nguyên đồng nhất tương ứng với kháng thể 32 Hình 2.3: các kháng nguyên có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể 33 Hình 2.4: kháng nguyên cùng có một phần tương ứng với kháng thể 33 Hình 2.5. Sơ đồ tra mẫu 34 Hình 3.1. bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn ở dạng nước theo thời gian 36 Hình 3.2. Biểu đồ biểu diễn sự biến đổi giá trị LD 50 của nọc rắn dạng nước 37 Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi theo thời gian về hàm lượng protein của nọc rắn dạng nước 38 Hình 3.4. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng nước ở 4 0 C theo thời gian Error! Bookmark not defined. Hình 3.5. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng nước ở -20 0 C theo thời gian 40 Hình 3.6. Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn dạng glycerol theo thời gian 41 Hình 3.7. Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi giá trị LD50 của nọc rắn ở dạng glycerol 42 Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện hàm lượng protein sau khi bảo quản của nọc rắn dạng glycerol 43 Hình 3.9. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng glycerol 4 O C theo thời gian bảo quản 44 Hình 3.10. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng glycerol -20 0 C theo thời gian bảo quản 46 Hình 3.11. Bảng tổng hợp hàm lượng protein và giá trị 1LD50 của nọc rắn ở dạng đông khô 46 Hình.3.12. Biểu đồ biểu diễn giá trị LD50 của nọc rắn ở dạng đông khô 47 Hình 3.13. biểu đồ biểu diễn hàm lượng protein của nọc rắn ở dạng đông khô 48 Hình 3.14. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng đông khô 4 O C theo thời gian 49 v Hình 3.15. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng đông khô -20 O C theo thời gian bảo quản 50 Hình 3.16. Bảng tổng hợp thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản 51 2.Dạng bảo quản tối ưu 51 Hình 3.17. Sơ đồ biểu diễn thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản theo thứ tự tăng dần 52 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Bảng thăm dò giá trị LD 50 của dung dịch nọc rắn mẹ 30 Bảng 2.2: Bảng nồng độ pha tiêm của dung dịch nọc rắn 30 Bảng 3.1: Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn ở dạng nước theo thời gian 36 Bảng 3.2: Bảng tổng hợp các thông số của nọc rắn dạng glycerol theo thời gian 41 Bảng 3.3: Bảng tổng hợp hàm lượng protein và giá trị 1LD50 của nọc rắn ở dạng đông khô 46 Bảng 3.4: Bảng tổng hợp thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản 51 vii 1 PHẦN MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Rắn độc cắn là một tai nạn nguy hiểm (đặc biệt ở nông thôn và miền núi) nhiều khi dẫn đến tử vong hoặc tàn phế. Có nhiều loại rắn, đặc điểm gây bệnh không những khác nhau giữa các loài rắn, mà ngay trong cùng một loài, đặc điểm này cũng khác nhau tuỳ từng địa phương, nên cách xử lý cũng có những đòi hỏi khác nhau. Việt Nam là nước ở vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu quanh năm nóng và ẩm nên rất phù hợp cho các loài rắn độc phát triển. Vì thế tỉ lệ tử vong do rắn độc cắn chiếm tỉ lệ khá cao. Tuy chưa có thống kê cụ thể nhưng con số nạn nhân do rắn độc cắn lên đến con số 30.000 trường hợp mỗi năm (Cassian Bon và cộng sự công bố tại bệnh viện Chợ Rẫy vào tháng 12/1998). Tại khoa Hồi sức cấp cứu bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội, tỷ lệ tử vong do rắn hổ cắn trong những năm 1987 – 1991 là 20%, thời gian 1991 – 1993 là 11,9% (trong tổng số 71 bệnh nhân), thời gian tháng 1 đến tháng 10/1998 là 7% (86 bệnh nhân), không có tử vong do rắn lục cắn. Hàng năm trên thế giới có khoảng 30.000 đến 40.000 người bị rắn độc cắn, trong đó số người bị tử vong khoảng 2.000 người [8]. Một nghiên cứu mới được công bố trên tạp chí Public Library of Science Medicine tại Mỹ cho rằng mỗi năm trên thế giới có khoảng 421.000 người bị rắn cắn và số người chết lên tới 20.000 người, phần lớn tại Nam Á, Đông Nam Á và vùng Hạ Sahara của châu Phi. Nghiên cứu này đã rà soát thông tin trên 3.256 bài báo tại 68 nước. Tuy nhiên, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc Đại học Kelaniya tại Sri Lanka cho rằng số người bị rắn cắn mỗi năm trên thế giới có thể dao động từ 1,2 triệu người đến 5,5 triệu người, ước đoán số trung bình là khoảng 1.841.000 người và con số tử vong có thể lên đến 94.000 người. Các nhà khoa học đồng ý rằng có một số nạn nhân khá lớn không đến bệnh viện, thích được 2 chữa trị theo cách truyền thống và nhiều người chết tại nhà. Do đó, rất khó thống kê con số chính xác [9]. Trong nhiều trường hợp, nạn nhân may mắn sống sót vẫn thường mang nhiều biến chứng, thương tật suốt đời như lở loét, suy thận, xuất huyết nội sọ hoặc phải cắt cụt chi, mất hết khả năng lao động do ảnh hưởng của hiệu ứng gây rối loạn chức năng thần kinh của nọc độc [5]. Ở các nước tiên tiến trên thế giới đã sử dụng kháng huyết thanh nọc rắn để điều trị, cấp cứu cho những ca bị rắn độc cắn. Phương pháp này được cho là điều trị hiệu quả nhất .Tại hội nghị về rắn độc và điều trị nạn nhân do rắn độc cắn của Tổ Chức Y Tế Thế Giới tổ chức tại Geneve từ ngày 6 đến ngày 11 tháng 3 năm 1967 bàn về sản xuất kiểm định huyết thanh trị rắn cắn đã khuyến cáo các nước trên thế giới hãy tự mình sản xuất huyết thanh để điều trị cho các nạn nhân bị rắn cắn ở nước mình [1]. Tính đến năm 2003, đã có 50 quốc gia trên thế giới nghiên cứu và đưa vào sản xuất 185 loại huyết thanh kháng nọc rắn như Philippines, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ có riêng hẳn một viện nghiên cứu và sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn. Năm 2002, hội nghị các chuyên gia hàng đầu thế giới về huyết thanh kháng nọc rắn tại Anh đã khẳng định: “Mỗi nước cần sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn theo chuẩn định của chính quốc gia mình”. Ở Việt Nam từ hơn 100 năm trước, bác sĩ Calmette đã là người đầu tiên phát minh ra huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất ngay tại Viện Pasteur Sài Gòn. Đến năm 1990, đơn vị nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn trực thuộc Bệnh viện Chợ Rẫy được thành lập và năm 1998, Bộ Y tế cho phép sử dụng 2 loại huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và choàm quạp trong điều trị lâm sàng, cấp cứu bệnh nhân bị rắn cắn tại Bệnh viện Chợ Rẫy. Thế nhưng, với 9 loại rắn độc như đã nói ở trên, đặc biệt là với mức độ độc hại của rắn hổ chúa, những công trình khoa học nói trên là 3 chưa đủ. Các bệnh nhân đang rất cần loại huyết thanh kháng nọc rắn này. Nhằm hỗ trợ các nhà khoa học nghiên cứu chế tạo các loại huyết thanh kháng nọc rắn khác phục vụ điều tri, Sở Khoa học và Công nghệ TPHCM đã cấp kinh phí triển khai đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình kỹ thuật chế tạo huyết thanh kháng nọc rắn hổ chúa (King Cobra Antivenom)” từ tháng 6 – 2001 đến tháng 12 – 2012 do TS – BS Trịnh Xuân Kiếm làm chủ nhiệm đề tài và Đại học Y Dược TPHCM là đơn vị chủ trì. Đề tài đã đạt được nhiều kết quả thành công, để từ đó nhóm nghiên cứu tiếp tục thực hiện đề tài “Nghiên cứu phát triển sản xuất và ứng dụng lâm sàng đa trung tâm nhằm xác định tính an toàn và hiệu lực huyết thanh kháng nọc rắn hổ chúa” từ tháng 12 – 2004 đến tháng 7 – 2007 do TS – BS Trịnh Xuân Kiếm, TS – BS Trần Thúy Hạnh đồng chủ nhiệm đề tài và đơn vị chủ trì là Bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội. Nhóm nghiên cứu đã thử lâm sàng huyết thanh kháng nọc rắn hổ chúa tại 2 cơ sở y tế lớn nhất nước là Bệnh viện Bạch Mai và Bệnh viện Chợ Rẫy. Kết quả trên 40 bệnh nhân bị rắn hổ chúa cắn, nhiễm độc nặng, sau khi sử dụng huyết thanh kháng nọc rắn hổ chúa đã hồi phục hoàn toàn trong 24 giờ đầu. Phản ứng không mong muốn trong giới hạn cho phép 10% - 18%. Kết quả trên đã chứng minh tính an toàn và hiệu lực của huyết thanh kháng nọc rắn hổ chúa được chế tạo tại Trung tâm Chống độc quốc gia, Bệnh viện Bạch Mai. Với những kết quả này, rắn hổ chúa Việt Nam từ nay đã có những “khắc tinh” thực sự [10]. Đầu tháng 4/2004, Bộ Y tế đã có văn bản cho phép Viện VắcXin Nha Trang sản xuất hai loại huyết thanh kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre. Huyết thanh kháng nọc rắn đang được ứng dụng rộng rãi và có một ý nghĩa về mặt nhân đạo. Để đảm bảo chất lượng huyết thanh, nọc rắn dùng làm kháng nguyên gây miễn dịch yêu cầu phải bảo toàn được các thành phần đặc trưng theo thời gian. Vì thế, vấn đề đặt ra là phải có phương pháp bảo quản tốt để đảm bảo chất lượng kháng nguyên nọc rắn để phục vụ cho việc sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn và công tác nghiên cứu. [...]... tài: Đánh giá các dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn Mục đích đề tài: ► Chọn dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn tối ưu ► Xác định hạn bảo quản của kháng nguyên 5 CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RẮN Việt Nam là nước ở vùng nhiệt đới gió mùa, khí hậu quanh năm nóng và ẩm, có hơn 3.200km bờ biển và 2/3 diện tích đất đai là rừng núi nên rất đa dạng sinh học Do đó, động vật hoang dã nói chung và rắn. .. sau: Nọc rắn mẹ Kiểm tra LD50 Dạng bảo quản Dạng nước Dạng glycerol Dạng đông khô Nhiệt độ bảo quản 4oC -20oC Kiểm tra LD50 Protein Tính đặc hiệu Đánh giá kết quả Hình 2.1: Sơ đồ hướng tiến hành đề tài 29 2.2.1 KIỂM TRA LD50 a Mục đích : Xác định độc lực của dung dịch nọc rắn trước và sau khi bảo quản ở các dạng bảo quản LD50 là liều tối thiểu (của độc tố) gây chết 50% số động vật thí nghiệm Do đó nọc. .. nọc rắn mẹ vào 180µl NaCl 0,9% và lắc đều ta được dung dịch nọc rắn 5000µg/ml Sau đó hút 150µl dung dịch này cho vào 150µl NaCl 0,9% Các dạng bảo quản Dạng nước Tiến hành: Hút 754µl dung dịch nọc rắn mẹ cho vào 9.246µl dung dịch NaCl 0,9%, lắc đều và cho vào các lọ Sau đó dán nhãn và đem đi bảo quản ở 4oC và ở -20oC Dạng nước với glycerol Tiến hành: Cho vào lọ dung tích 20ml, 754 µl dung dịch nọc rắn. .. Chính vì vậy để dự trữ được nọc rắn phục vụ cho công tác nghiên cứu và sản xuất kháng huyết thanh kháng nọc rắn người ta thường bảo quản nọc rắn ở nhiệt độ lạnh Ở nhiệt độ thấp các phản ứng sinh hóa trong mẫu cần bảo quản giảm xuống Trong phạm vi hoạt động bình thường cứ hạ 10oC thi các phản ứng sinh hoa giảm xuống 1/2 - 1/3 Dưới tác dụng của nhiệt độ thấp, nước trong mẫu cần bảo quản đóng băng dẫn đến... tránh hiện tượng hình thành tinh thể đá trong tế bào người ta thường sử dụng các chất bảo quản lạnh như glycerol, muối ăn, glucose, ethylene glycon, dimethy sunlfoxide 20 (DMSO) hoặc tiến hành tách nước ra khỏi tế bào trước khi bảo quản ở nhiệt độ thấp Thông thường để bảo quản kháng nguyên nọc rắn người ta sử dụng các dạng bảo quản sau: 1.3.1 Đông Khô Đông khô (lyophilization) là quá trình làm khô dung... của nọc rắn Chlorua bạch kim phá hủy tính độc của nọc rắn Formon, chất oxy hóa làm kết dính với các acid amin, làm giảm độc lực Năm 1924, G.Ramon đã thành công trong việc làm giảm độc tính của nọc rắn hổ nhưng không làm mất tính tạo kháng thể (tính kháng nguyên) [1] Năm 1930 Maaurice Arthus đã thêm formon với tỷ lệ 3% và giữ ở 37oC trong vài tuần lễ để biến độc tố nọc rắn thành giải độc tố nọc rắn. .. dẫn đến tử vong Cách chống độc đặc hiệu duy nhất hiện nay là sử dụng ngay kháng huyết thanh kháng nọc rắn càng sớm càng tốt sau khi bị cắn Trong trường hợp kháng huyết thanh kháng nọc không được chuẩn bị sẵn thì mạng sống sẽ được giữ bằng máy hô hấp nhân tạo cho tới khi cơ hoành hoạt động lại bình thường (nếu như độ nhiễm độc không quá trầm trọng) 1.3 CÁC DẠNG BẢO QUẢN Như ta đã biết nọc rắn bao gồm protein,... thể người Nọc rắn là một chất lỏng, nhờn, không màu hay màu vàng nhạt, rất dễ tan trong nước, tỷ trọng từ 1,03 đến 1,05 chứa từ 50% -70% nước Nọc lấy ra từ rắn nếu không bảo quản thì sau 24 giờ sẽ biến chất và có mùi hôi Nọc rắn làm khô ở điều kiện lạnh thì kết tinh ở dạng tinh thể, màu vàng nhạt, không mùi Calmette (1902) đã lưu giữ được nhiều mẫu nọc rắn độc dưới dạng tinh thể, đựng trong các lọ thủy... độ 4oC-8oC tránh không khí ẩm sau 15 năm mà hoạt tính của nọc rắn vẫn không hề thay đổi [1] 1.1.2.1 Thành phần hóa học của nọc độc rắn Nọc độc rắn vốn cực kỳ phức tạp, bao gồm hàng trăm peptide (chuỗi axit amin) Nọc rắn gồm hơn 20 thành phần khác nhau, chủ yếu là protein chứa các men và độc tố polypeptide Các nguyên tố hóa học chính của nọc rắn gồm có C, H, O, N, P, S và một số lượng nhỏ Zn Bản chất... Chưa có đánh giá chi tiết nào về việc sử dụng các loài rắn ở Việt Nam, tuy nhiên, rắn được thu thập để làm thực phẩm, lấy nọc độc, làm thuốc cổ truyền và dùng trong kỹ nghệ da Các loài rắn độc phổ biến dùng ngâm rượu là các loài rắn cạp nia (Bungarus spp.), rắn hổ mang (Naja spp.), và Hổ chúa Ophiophagus hannah Rắn biển đôi khi được dùng ngâm rượu nhưng chúng 6 thường được dùng để làm thực phẩm ở các khu . thanh kháng nọc rắn và công tác nghiên cứu. 4 Chính vì vậy, em thực hiện nghiên cứu đề tài: Đánh giá các dạng bảo quản kháng nguyên nọc rắn Mục đích đề tài: ► Chọn dạng bảo quản kháng. Kết quả Ouchterlony của nọc rắn dạng đông khô -20 O C theo thời gian bảo quản 50 Hình 3.16. Bảng tổng hợp thời hạn bảo quản của nọc rắn ở các dạng bảo quản 51 2 .Dạng bảo quản tối ưu 51 Hình. thanh kháng nọc rắn hổ đất và rắn lục tre. Huyết thanh kháng nọc rắn đang được ứng dụng rộng rãi và có một ý nghĩa về mặt nhân đạo. Để đảm bảo chất lượng huyết thanh, nọc rắn dùng làm kháng nguyên