II. CÁC DẠNG BẢO QUẢN
3. HÓA CHẤT VÀ DUNG MÔI
a. Hoá chất
NaCl (Trung Quốc).
Glycerol (Trung Quốc).
Agarose.
Thuốc nhuộm .
Nước rửa nhuộm.
Axit sunfuric (H2SO4) đậm đặc (Merck – Đức).
Ôxy già H2O2.
Nước cất hai lần đạt tiêu chuẩn pha tiêm. Dung dịch BSA của hãng Sigma.
Chuẩn bị thuốc thử Nessler:
Trong bình định mức 100ml người ta cho nước cất vừa đến vạch, sau đó chỉ dùng nước trong bình này. Nghiền 10g Iodua thủy ngân (HgI2) trong một cối sứ với một ít nước và sau đó rót sang một chai thủy tinh màu. Tráng chày cối bằng nước trong bình và lại đổ vào chai, thêm 5g KI. Số nước còn lại đem hòa tan 20g NaOH và chờ đến khi nguội đổ vào chai trên. Trong vòng một vài ngày, lượng muối thủy ngân thừa sẽ lắng xuống. Rót cẩn thận dung dịch trong phía trên vào một chai màu khác và bảo quản trong chỗ tối
Dung dịch chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn BSA (Brovine Serum Albumin) (1mg/ml) của hãng Sigma.
Lấy 100µl dung dịch chuẩn BSA 1mg/ml cho vào 900µl dung dịch NaCl 0,15M có chứa 0,05% sodium azide để được dung dịch có 0,1mgN/ml. Sau đó đem bảo quản ở 2oC – 8oC. Trước khi sử dụng cần pha loãng 2 lần.
b. Dung môi
Dung dịch nọc rắn mẹ:Cân 250mg nọc Hổ Đất pha trong 5ml NaCl 0,9% sau đó đem đi
khuấy từ.
Pha dung dịch 250µg/ml: Cho 20µl dung dịch nọc rắn mẹ vào 180µl NaCl 0,9%
và lắc đều ta được dung dịch nọc rắn 5000µg/ml. Sau đó hút 150µl dung dịch này cho vào 150µl NaCl 0,9%.
Các dạng bảo quản
Dạng nước
Tiến hành:
Hút 754µl dung dịch nọc rắn mẹ cho vào 9.246µl dung dịch NaCl 0,9%, lắc đều và cho vào các lọ. Sau đó dán nhãn và đem đi bảo quản ở 4oC và ở -20oC.
Dạng nước với glycerol
Tiến hành:
Cho vào lọ dung tích 20ml, 754 µl dung dịch nọc rắn mẹ, 4.000 µl dung dịch glycerol 50% và 5.246 µl dung dịch NaCl 0,9%. Sau đó lắc đều bằng máy lắc, rồi cho vào các lọ. Dán nhãn rồi đem đi bảo quản ở các nhiệt độ 4oC và -20oC
Đông khô
Hút 754µl dung dịch nọc rắn mẹ cho vào 9.246µl dung dịch NH4CH3COOH 0,05M. Sau khi pha dung dịch nọc rắn xong ta đóng vào mỗi lọ 1ml dung dịch nọc rắn và
đem đi đông khô. Đông khô bằng máy Martin Christ với thời gian đông khô 1 ngày. Sau
2.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Đề tài được thực hiện theo sơ đồ sau:
Nọc rắn mẹ Kiểm tra LD50 Dạng bảo quản Dạng nước Dạng glycerol Dạng đông khô
Nhiệt độ bảo quản
4oC -20oC
Kiểm tra
LD50 Protein Tính đặc hiệu
Đánh giá kết quả
2.2.1. KIỂM TRA LD50 a. Mục đích :
Xác định độc lực của dung dịch nọc rắn trước và sau khi bảo quản ở các dạng bảo quản.
LD50 là liều tối thiểu (của độc tố) gây chết 50% số động vật thí nghiệm. Do đó nọc độc hoặc độc tố càng độc thì giá trị LD50 càng thấp.
Động vật thí nghiệm là thỏ hoặc chuột nhắt trắng. Thường thì chuột nhắt trắng có khả năng cảm nhiễm cao hơn vì thế được sử dụng phổ biến hơn.
Độc tố được đưa vào cơ thể động vật bằng các đường tiêm như tiêm dưới da, tiêm bắp, tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch và tiêm màng não. Cùng một loại độc tố thì đường tiêm khác nhau thì cho giá trị LD50 khác nhau. Tuy nhiên cách tiêm tĩnh mạch đuôi cho kết quả đồng nhất cao và được dùng trong các quy trình chuẩn.
Để thu được kết quả có độ chính xác cao thì các điều kiện tiến hành thí nghiệm phải được tuân thủ chặt chẽ. Trọng lượng và tuổi của chuột ít giao động, sức khỏe chuột phải tốt, không mang mầm bệnh, cùng một dòng, không mang thai. Ngoài ra đường tiêm và cách tiêm vào mỗi chuột phải như nhau, nhiệt độ môi trường phải ổn định và phải đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng và nước uống trong quá trình thử nghiệm
b. Tiến hành
Xác định LD50 của dung dịch nọc rắn mẹ:
Dung dịch nọc rắn mẹ có nồng độ là 50mg/ml. Dự đoán 1 LD50 tương ứng với 5µg nọc cân . Vì vậy sẽ pha thử nghiệm các nồng độ theo bảng sau:
Bảng 2.1: Bảng thăm dò giá trị LD50 của dung dịch nọc rắn mẹ
Dung dịch pha cho 10 chuột Nọc rắn µg/chuột/0.5ml Dung dịch 250µg/ml NaCl 0.09%(ml) 4,34 0,4 11,12 5,21 0,4 9,20 6,27 0,5 9,47 6,87 0,5 8,60 7,54 0,6 9,35 8,26 0,6 8,48 9,06 0,7 8,96 9,93 0,7 8,11
Xác định LD50 của các dung dịch nọc rắn sau khi bảo quản:
Các dung dịch nọc rắn được pha tiêm ở các nồng độnhư bảng sau:
Bảng 2.2: Bảng nồng độ pha tiêm của dung dịch nọc rắn
LD50/chuột/0.5ml Lượng mẫu/chuột(µl) Lượng mẫu/10 chuột (µl) NaCl 0.09% (µl) Tổng thể tích(µl) 0,832 83,2 832 4.168 5.000 0,912 91,2 912 4.088 5.000 1,00 100 1.000 4.000 5.000 1,096 109,6 1.096 3.904 5.000 1,202 120,2 1.202 3.798 5.000 1,318 131,8 1.318 3.682 5.000
Các thông số tiến hành:
Động vật: Chuột nhắt trắng 18-20g hàn toàn khỏe mạnh Đường tiêm: Tĩnh mạch đuôi
Liều tiêm: 0,5ml /1 chuột
Đơn vị tính: Liều gây chết 50% động vật thí nghiệm được diễn tả bằng µg protein/chuột.
Số chuột cho mỗi lô: 4 con
Tiến hành:
Nọc rắn được pha theo các nồng độ như bảng trên.
Gây nhiễm vào chuột theo tĩnh mạch đuôi.
Đọc kết quả sau 24 – 48 giờ.
Tính kết quả:
Kết quả được tính theo công thức Spearman-Karber Log LD50 =Xo+d/2 – dΣRi/n
Trong đó:
Xo: là log của nồng độ gây chết 100% động vật thí nghiệm. d: là log của tác nhân độ pha loãng.
Ri: số chuột chết trong mỗi lô n: số chuột trong mỗi lô