II. CÁC DẠNG BẢO QUẢN
2. KIỂM TRA TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA KHÁNG NGUYÊN
Để kiểm tra các thành phần trong dung dịch nọc rắn ta sử dụng phương pháp Ouchterlony.
a. Nguyên tắc
Các kháng nguyên (KN) và kháng thể (KT) tương ứng kết hợp với nhau ở một trong nhiều vạch được nhận biết riêng biệt trên thạch. Sự khuếch tán qua thạch được thực hiện dưới hiệu quả của các lực khuếch tán tự phát.
Kỹ thuật này dựa trên sự hình thành cấu trúc mạng lưới của agarose. Các phân tử có trọng lượng nhỏ hơn 200kDa khuếch tán dễ dàng trong agarose, các phân
tử lớn di chuyển chậm và khó khăn hơn. Kháng nguyên và kháng thể sau khi được phủ đầy các giếng sẽ khuếch tán tỏa tròn ra xung quanh các giếng và hình thành gradien nồng độ. Khi nồng độ kháng nguyên kháng thể tương ứng nhau, thì sẽ xuất hiện một vòng cung kết tủa.
Để một cặp KN-KT xuất hiện, vị trí của vạch kết tủa trên thạch phụ thuộc duy nhất các hệ số khuếch tán điện kháng và không phụ thuộc vào nồng độ. Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự kết tủa:
Chất lượng của thạch. pH và nhiệt độ.
Bản chất của kháng nguyên và kháng thể
Sự xuất hiện kết tủa liên quan đến nồng độ kháng nguyên và kháng thể.
Khi nhận định kết quả, căn cứ vào vòng kết tủa thì có thể có 3 trường hợp xảy ra:
Trường hợp 1: các giếng chứa kháng nguyên đồng nhất và tương ứng với kháng thể thì các đường kết tủa gặp nhau và nối liền nhau. Đây là hiện tượng các kháng nguyên đồng nhất như hình vẽ:
Hình 2.2: Kháng nguyên đồng nhất tương ứng với kháng thể
KN KN
Trường hợp 2: các giếng chứa kháng nguyên chỉ có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể thì sẽ xuất hiện các đường kết tủa cắt nhau. Tức là các kháng nguyên không có liên quan với nhau. Đây là hiện tượng kháng nguyên không đồng nhất như hình vẽ:
Hình 2.3: các kháng nguyên có một phần tương ứng với một phần khác nhau của kháng thể
Trường hợp 3: các giếng chứa kháng nguyên (KN) có liên quan một phần với kháng thể (KT) sẽ tạo ra hai đường gặp nhau nhưng một đường dài và một đường ngắn hơn như hình vẽ sau:
Hình 2.4: kháng nguyên cùng có một phần tương ứng với kháng thể b. Tiến hành:
Pha dung dịch agarose 1%: Cân 100mg agarose cho vào 10ml dung dịch NaCl 0,9%. Sau đó đun cho tan hết agarose.
KN KN
KT
KN KN
Dung dịch agarose 1% trong NaCl 0,9% sau khi được đun tan hết được đổ lên một lam kính sạch, để đông cứng, rồi tiến hành đục giếng, đục 7 giếng 1 giếng ở giữa và 6 giếng xung quanh. Cho 5µl huyết thanh (HT), kháng nguyên nọc rắn, dung dịch NaCl 0,9% theo sơ đồ sau:
Hình 2.5: Sơ đồ tra mẫu
Đặt gel vào một cái hộp chứa bông thấm nước (để tránh sự bay hơi làm khô gel), để ở nhiệt độ khoảng 4OC. Sau khoảng 24-48h tiến hành rửa gel bằng dung dịch NaCl 0,9%, rồi ép gel để khô tự nhiên. Sau khi thấy gel khô, trong suốt thì bắt đầu nhuộm gel. Nhuộm khoảng 20-30 phút đem gel rửa bằng nước rửa nhuộm.Để khô rồi đọc kết quả.