Nghiên cứu sự tồn tại của dấu vết máu dưới một số điều kiện môi trường nhất định phục vụ công tác giám định sinh học hình sự

Về mặt lý luận, trên thế giới, đã có số lượng nhất định những công trình nghiên cứu về chất lượng của một số dấu vết sinh vật nhưng chưa có nghiên cứu nào cụ thể chuyên sâu về chất lượng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAMVIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

BÙI ANH TUẤN

NGHIÊN CỨU SỰ TỒN TẠI CỦA DẤU VẾT MÁU DƯỚI MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NHẤT ĐỊNH PHỤC VỤ

CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH SINH HỌC HÌNH SỰ

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

HÀ NỘI - NĂM 2013

MỤC LỤC

Nội dung Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 3

4 Nội dung nghiên cứu 4

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 6

Chương I 7

MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ DẤU VẾT MÁU VÀ 7

GIÁM ĐỊNH DẤU VẾT MÁU 7

1 Đại cương về dấu vết máu 7

1.1.Khái niệm dấu vết máu 7

1.2.Phương pháp phát hiện, ghi nhận, thu lượm, bảo quản dấu vết máu tại hiện trường 9

1.3 Các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu 10

1.4 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép - Ouchterlony: 11

2 Tác động của một số yếu tố môi trường đến sự toàn vẹn của phân tử ADN 12

2.1 ADN trong tế bào máu 12

2.2 Cấu trúc của ADN 13

2.2 Sự tác động đến tính toàn vẹn của phân tử ADN 14

3 Giám định ADN từ dấu vết máu 17

3.1 Khái niệm và sự ra đời của giám định gen (ADN) 17

3.2 Cơ sở khoa học của giám định gen 22

4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực liên quan đến đề tài 25

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 25

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 29

Chương II 31

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

1 Vật liệu: 31

1.1 Vật liệu dùng trong tách chiết và định lượng ADN 31

1.2 Chọn lựa, thu thập mẫu: 32

2 Phương pháp nghiên cứu: 32

2.1 Bố trí thí nghiệm 32

2.2 Giám định định hướng dấu vết máu 35

2.3 Xác định protein loài theo Ochterlony từ dấu vết máu [2,3] 36

2.4 Tách chiết ADN từ những mẫu máu thu nhận ở hiện trường: 37

2.5 Định lượng sản phẩm ADN sau tách chiết: 39

2.6 Phương pháp định lượng ADN bằng kít Quantifiler™ Human ADN Quantification 39

2.7 Nhân bội sản phẩm ADN sau tách chiết bằng phản ứng PCR 40

2.8 Điện di và phân tích kết quả: 43

2.8.1 Nguyên lý điện di trên máy giải trình tự gen ABI Prism 3130 Genetic Analyzer 43

2.8.2 Các bước tiến hành điện di 44

Chương III 45

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 45

1 Kết quả nghiên cứu 45

1.1 Kết quả xác định định hướng dấu vết máu thu từ các vụ án với dung dịch phenolphthalein: 45

1.2 Kết quả xác định protein loài sử dụng kỹ thuật khuếch tán miễn dịch kép theo Ouchterlony: 45

1.3 Kết quả định lượng ADN tổng số từ những dấu vết máu bằng kỹ thuật Realtime – PCR : 46

1.3.1.Kết quả định lượng với các mẫu thu từ các vụ án: 47

1.3.2 Kết quả định lượng ADN đối với các mẫu khảo nghiệm 50

1.4 Kết quả phân tích điện di sản phẩm PCR sử dụng phần mềm GeneMapper ID v.3.2 50 2.2 Đối với các mẫu khảo nghiệm 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67

1 Kết luận 67

2 Kiến nghị 68

MỞ ĐẦU

1 Sự cần thiết của việc nghiên cứu đề tài

Trong các vụ án hình sự, đặc biệt là các vụ án xâm phạm tính mạng, sức khỏe và nhân phẩm con người, máu là loại dấu vết thường gặp nhất do máu là hệ quả điển hình của sự tác động qua lại giữa đối tượng và nạn nhân trong cơ chế hình thành dấu vết của các hoạt động phạm tội hình sự Dấu vết máu cũng là dạng dấu vết vật chất có vai trò là những nguồn cung cấp thông tin rất có giá trị trong công tác điều tra, xét xử các vụ án [5] Thực tế công tác giám định gen (ADN) trong các vụ án hình sự, các dấu vết máu được đưa đến phòng thí nghiệm với sự không đồng đều cả về chất lượng và số lượng Các phòng giám định gen thường xuyên phải giải quyết những mẫu khó, chất lượng thấp được thu thập từ những dấu vết ở hiện trường sau khi tổn tại ở môi trường tự nhiên trong thời gian dài Dấu vết máu được thu lượm ở hiện trường thường ở dạng dấu vết khô, đã bị phân hủy ít hay nhiều, bị tạp nhiễm bởi nhiều chất có thể gây ức chế phản ứng PCR Chất lượng của dấu vết máu ảnh hưởng rất lớn đến chất và lượng ADN tách chiết trực tiếp được từ tế bào máu Đối với những mẫu máu chất lượng kém, bị thối rữa, phân hủy hay lẫn các chất ức chế thường gây cho giám định viên không ít những khó khăn trong các công đoạn của quy trình giám định ADN

Ở Việt Nam, việc khai thác, nghiên cứu, sử dụng dấu vêt máu trong giám định ADN hình sự còn nhiều hạn chế, thiếu sót chưa đáp ứng được yêu cầu thực tiễn Do nhiều nguyên nhân, trong đó công tác phát hiện, nhận định, thu lượm, bảo quản dấu vết máu khi khám nghiệm hiện trường còn có nhiều sai sót, chưa được tiến hành nhanh chóng, kịp thời, chính xác Việc thu dấu vết máu không đúng cách, không đảm bảo về số lượng, chất lượng, bảo quản dấu vết máu còn rất sơ sài, qua loa, không đảm bảo các yêu cầu về mặt kỹ thuật Điều đó làm cho chất lượng dấu vết không tốt hoặc bị hư hỏng dẫn đến

không thể đánh giá, giám định để khai thác triệt để các thông tin về vụ án Về mặt lý luận, trên thế giới, đã có số lượng nhất định những công trình nghiên cứu về chất lượng của một số dấu vết sinh vật nhưng chưa có nghiên cứu nào

cụ thể chuyên sâu về chất lượng dấu vết máu phục vụ giám định sinh học hình

sự trong điều kiện Việt Nam

Việc nghiên cứu đánh giá chất lượng ADN thu được từ dấu vết máu dưới tác động của môi trường tự nhiên và thời gian tồn tại góp phần đưa ra các phương thức tốt nhất để cải tiến các kỹ thuật, công đoạn trong công tác khám nghiệm hiện trường, đánh giá, thu thập và bảo quản dấu vết máu, cũng như thủ thuật phân tích ADN tại phòng thí nghiệm Giúp cho công tác điều tra, khám nghiệm hiện trường và giám định ADN từ dấu vết máu đạt hiệu quả cao, qua đó góp phần giải quyết nhanh chóng các vụ án hình sự Xuất phát từ vấn đề nêu trên, việc thực hiện Đề tài: “Nghiên cứu chất lượng dấu vết máu dưới tác động của một số điều kiện môi trường nhất định phục vụ công tác giám định sinh học hình sự” là cấp thiết cả về phương diện lý luận và thực tiễn

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích phân tích, đánh giá sự tác động của một số yếu tố môi trường trong khoảng thời gian nhất định lên chất lượng của dấu vết máu trong giám định định hướng, xác định tính đặc hiệu loài, chất lượng và số lượng ADN tách chiết được từ các dấu vết máu thu

ở hiện trường vụ án và từ các mẫu khảo nghiệm

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu, đưa ra những nhận định giúp cho cán bộ khám nghiệm hiện trường có các giải pháp trong phát hiện, thu lượm, bảo quản, đánh giá dấu vết máu; các giám định viên có những thủ thuật thực hiện giám định và đánh giá kết quả

3 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Dấu vết sinh vật ở hiện trường các vụ án thường chịu tác động bởi đa dạng các yếu tố khách quan và chủ quan như thời tiết, khí hậu (nhiệt độ, độ ẩm) cũng như ý thức và trình độ cán bộ khám nghiệm hiện trường Do điều kiện hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung nghiên cứu sự tác động của các yếu tố về khí hậu và thời tiết ở điều kiện trong nhà và ngoài trời, qua bốn mùa trong năm đối với các mẫu thu được từ những vụ án thực tế Đề tài chưa thể đi sâu nghiên cứu các tác động mang tính chủ quan khác như tác động của con người, động vật (giặt, tẩy, sử dụng hóa chất, chùi, xóa, …); các điều kiện thiên nhiên đặc biệt (mưa, bão, lũ lụt,…); các yếu tố cơ học hay sự tác động của yếu tố vật mang lên sự tồn tại của dấu vết

Đề tài luận văn chỉ tập trung nghiên cứu dấu vết máu ở dạng khô bám dính trên bề mặt một vật mang thường gặp là vải cotton

Ngoài các yếu tố điều kiện môi trường, kết quả giám định dấu vết máu còn phụ thuộc vào khối lượng dấu vết, do đó các dấu vết được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu sẽ được nhận định trước về lượng bằng cảm quan

Với các mẫu khảo nghiệm, Đề tài tập trung nghiên cứu vào hai điều kiện vật lý thường tác động đến chất lượng của dấu vết máu nhất trong hiện trường thực tế các vụ án đó là: nhiệt độ và độ ẩm theo không gian và thời gian

Về mặt thời gian, không gian khảo sát: dấu vết máu trong các vụ án xảy ra tại địa bàn Miền Bắc Việt Nam, bốn mùa trong năm 2012 và tồn tại qua 3 mốc thời gian là 3 ngày, 10 ngày và 5 tuần

Việc sử dụng kỹ thuật realtime PCR định lượng ADN chỉ là một khâu trong quy trình giám định sinh học giúp ta đánh giá được về hàm lượng ADN tách chiết được từ các dấu vết máu, từ đó định hướng điều chỉnh hàm lượng

ADN khuôn đưa vào mỗi phản ứng PCR Việc đánh giá về chất lượng của dấu vết máu là đối tượng nghiên cứu của đề tài phải được kết hợp ở cả 4 công đoạn của quy trình giám định, đó là giám định định hướng, xác định tính đặc hiệu loài, định lượng ADN tổng số sau tách chiết và phân tích kết quả điện di sản phẩm PCR

Quá trình nghiên cứu được tiến hành trong phòng thí nghiệm của Trung tâm Giám định sinh học pháp lý, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công an

4 Nội dung nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu thu được từ 2 nguồn:

- Các dấu vết máu thu thập được từ những vụ án giết người, cướp của

Các dấu vết này ở trong những điều kiện khác nhau về khí hậu, và thời gian tồn tại Cụ thể là mẫu máu từ các vụ án được chọn lựa theo các tiêu chí tồn tại qua các mốc thời gian và xảy ra ở nơi có khí hậu 4 mùa rõ rệt là miền Bắc Việt Nam Tất cả các đối tượng nghiên cứu được chia vào 2 nhóm tách biệt là dấu vết máu được tồn tại ở điều kiện trong nhà và ngoài trời và qua 3 mốc thời gian là 3 ngày, 10 ngày và 5 tuần:

6 mẫu trong các vụ án hình sự (có ký hiệu từ MA1 – MA6) là các dấu vết máu có điều kiện tồn tại ở trong nhà

6 mẫu trong các vụ án hình sự (có ký hiệu từ MA7 – MA12) là các dấu vết máu có điều kiện tồn tại ở ngoài trời vào mùa xuân

6 mẫu trong các vụ án hình sự (có ký hiệu MA13 – MA18) là các dấu vết máu có điều kiện tồn tại ở ngoài trời vào mùa hè

6 mẫu trong các vụ án hình sự (có ký hiệu từ MA19 – MA24) là các dấu vết máu có điều kiện tồn tại ở ngoài trời vào mùa thu

6 mẫu trong các vụ án hình sự (có ký hiệu từ MA25 – MA30) là các dấu vết máu có điều kiện tồn tại ở ngoài trời vào mùa đông

Tổng số mẫu từ các vụ án được chọn làm đối tượng nghiên cứu là

6 mẫu x 5 nhóm = 30 mẫu

- Các mẫu khảo nghiệm được tạo ra:

Quy trình: lấy các mẫu máu tươi của người nhỏ với lượng khoảng 50 ul lên vật mang là những mảnh vải cotton khô, sạch sau đó được đưa vào các điều kiện giả định về môi trường, khí hậu

6 mẫu khảo nghiệm (có ký hiệu từ KN1 – KN6) là các dấu vết máu tạo được tạo ra trong phòng thí nghiệm để đưa vào các điều kiện về nhiệt độ khác nhau

6 mẫu khảo nghiệm (có ký hiệu từ KN7 – KN12) là các dấu vết máu tạo được tạo ra trong phòng thí nghiệm để đưa vào các điều kiện về ẩm độ khác nhau

Địa điểm tiến hành thí nghiệm là Phòng thí nghiệm của Trung tâm giám định Sinh học pháp lý - Viện Khoa học hình sự

Mẫu khảo nghiệm được lưu trữ tương ứng với 3 mốc thời gian là 3, 10 ngày và 5 tuần ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ khác nhau

Số lượng mẫu ứng với từng điều kiện cụ thể như sau:

Tổng số mấu khảo nghiệm là: 6 x 2 = 12 mẫu

Các mẫu được đánh giá chất lượng gián tiếp qua các bước của quy trình giám định như sau:

Sử dụng dung dịch phenolphthalein để xác định định hướng dấu vết máu Sử dụng phương pháp khuếch tán miễn dịch kép trên thạch theo Ouchterlony để xác định tính đặc hiệu loài của protein trong dấu vết

ADN được tách chiết theo quy trình chuẩn bằng phương pháp vô cơ sử dụng hạt Chelex (quy trình đã được phòng thí nghiệm ADN hình sự của Cảnh sát bang Victoria - Liên bang Úc phê chuẩn)

Sử dụng bộ kit Quantifiler Human ADN, máy Realtime PCR 7500 cña

hãng ABI (Mỹ) để định lượng ADN tổng số từ mẫu được tách chiết Đơn vị định lượng là: ng/µl

Sử dụng bộ kit IdentifilerTM của hãng ABI (Mỹ), với phức hệ mồi STR gồm 16 locus gen trên máy chu trình nhiệt ABI - 9700

Sau khi thu được sản phẩm PCR, tiến hành xác định kiểu gen của các mẫu nghiên cứu bằng phương pháp điện di huỳnh quang (điện di mao quản) trên máy giải trình tự gen AB 3130 của hãng Applied Biosystems

Các kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID v.3.2

để xác định hình ảnh đặc trưng của các peak, hình thái các alen của mỗi locus, qua đó đánh giá chất lượng kiểu gen thu được từ sản phẩm PCR, gián tiếp xác định được chất lượng ADN khuôn thu được từ các đối tượng nghiên cứu

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Nghiên cứu này sẽ đưa ra các mức đánh giá tác động đến chất lượng và

số lượng của ADN tách chiết được từ những dấu vết máu dưới những điều kiện nhiệt độ và độ ẩm trong khoảng thời gian cụ thể

Việc nghiên cứu đánh giá chất lượng ADN của dấu vết máu góp phần đưa ra các phương thức tốt nhất để cải tiến các kỹ thuật, công đoạn trong công tác khám nghiệm hiện trường, đánh giá, thu thập và bảo quản dấu vết máu, cũng như giám định, phân tích ADN tại phòng thí nghiệm Từ đó giúp cho việc khai thác hiệu quả tối đa thông tin từ dấu vết máu góp phần giải quyết các vụ án Hoàn thiện cơ sở lý luận về giám định sinh học pháp lý nói chung

và giám định gen (ADN) nói riêng phục vụ cho công tác thực tiễn đấu tranh phòng chống tội phạm, cũng như nghiên cứu và đào tạo

Chương I

MỘT SỐ VẤN ĐỀ VỀ DẤU VẾT MÁU VÀ

GIÁM ĐỊNH DẤU VẾT MÁU

1 Đại cương về dấu vết máu

Khái niệm dấu vết máu

Dấu vết máu là lượng máu được tìm thấy ở hiện trường, trên công cụ, phương tiện gây án, trên quần, áo, đồ dùng, thân thể của nạn nhân hay của thủ phạm Sự xuất hiện của dấu vết máu là hậu quả của các hành vi đã xảy ra trong vụ việc có tính hình sự, được thu và giám định theo qui định của pháp luật.[2]

Qua thống kê, dấu vết máu chiếm tới 60% trong tổng số các loại dấu vết sinh vật hình thành và tồn tại liên quan đến vụ việc hình sự cần điều tra khám phá Máu thuộc loại mô lỏng lưu thông trong hệ thống tuần hoàn của người và động vật Ở giới động vật, trong thành phân cấu cạo của hemglobin trong máu có ion sắt hóa trị 2 (Fe++) nên máu bao giờ cũng có màu đỏ Trong

cơ thể người, máu chiếm 8% trọng lượng cơ thể, thành phần bao gồm hồng cầu, các loại bạch cầu, tiểu cầu, sợi huyết và huyết thanh Người bình thường trong 1ml máu có từ 4,5-5,0 triệu hồng cầu và 7000-9000 bạch cầu Đối tượng chính dùng để giám định gen là bạch cầu (chủ yếu là bạch cầu limpho) Số lượng và tỷ lệ bạch cầu ở người lớn và trẻ em có biểu hiện khác nhau Người lớn bạch cầu limpho chiếm 20-23% Do đó chỉ cần một lượng máu nhỏ cũng

Dấu vết máu có màu khá đặc trưng nên dễ phát hiện khi khám nghiệm hiện trường cũng như khi giám định các đồ vật nghi dính máu, nhưng đây cũng là loại dấu vết rất dễ bị biến đổi khi tồn tại ở môi trường ngoài cơ thể Trước hết là sự thay đổi về màu sắc của dấu vết như quá trình khô, dấu vết chuyển từ màu đỏ tươi thành màu đỏ sẫm sau đó là màu đỏ nâu hoặc màu nâu; nếu máu bị thối do độ ẩm cao thì sẽ có màu đen Tuy nhiên, ở hiện trường cũng có thể có một số chất có màu sắc, hình dạng tương tự vết máu như sơn chống rỉ, vết rỉ sắt, nhựa cây Vì vậy, trong đa số trường hợp cần sử dụng kít thử định hướng dấu vết máu để loại trừ ngay những dấu vết không phải là máu.[5][1]

Việc đánh giá dấu vết tại hiện trường cũng như trong quá trình giám định có ý nghĩa quan trọng, có thể thu được những thông tin có giá trị trong việc điều tra vụ án Số lượng, sự phân bố, trạng thái (màu sắc, hình dạng, chất lượng ) của dấu vết tại hiện trường, trên phương tiện gây án, trên đồ dùng, thân thể nạn nhân (hoặc của thủ phạm) phản ánh diễn biến cơ bản của vụ việc hình sự như hành động của thủ phạm, phản ứng của nạn nhân, thời điểm hình thành dấu vết, trình tự hình thành dấu vết, công cụ gây ra dấu vết xác định mức độ tổn thương của nạn nhân (và cả thủ phạm)

Tùy thuộc vào cơ chế tác động, vị trí bị tổn thương và động năng của máu chảy ra, máu xuất hiện và tồn tại ở hiện trường dưới nhiều dạng khác nhau như: dấu vết máu phun, dấu vết máu nhỏ giọt, dấu vết máu quệt, dấu vết máu thấm hay máu đọng thành vũng

Việc giám định định hướng dấu vết máu là bước bắt buộc trong quy trình giám định dấu vết máu đã được phê duyệt [1][2]

Phương pháp phát hiện, ghi nhận, thu lượm, bảo quản dấu vết máu tại hiện trường

Muốn phát hiện dấu vết máu nhanh chóng và có hiệu quả, cán bộ khám nghiệm phải tùy từng hiện trường cụ thể để ứng dụng thích hợp phương pháp

và chiến thuật khám nghiệm Cần tập trung vào những vị trí ngóc ngách, kín đáo ở hiện trường như gầm bàn, gầm ghế, kẽ ngón tay, ngón chân của tử thi…và trường hợp cần thiết phải dùng hóa chất đặc hiệu để phun trực tiếp vào các vị trí nghi có dấu vết Các loại hóa chất thích hợp thường sử dụng để phát hiện dấu vết máu là: dung dịch Benzidine, Luminol, H2O2

Để thu lượm và bảo quản dấu vết máu có hiệu quả cần dựa vào tình trạng, số lượng của dấu vết như: khô, ướt, nhiều, ít; dựa vào đặc điểm, kích thước của vật mang vết

Đối với dấu vết máu khô: Nếu dấu vết nằm trên những vật mang nhỏ, nhẹ, phương pháp tốt nhất là thu dấu vết cùng vật mang vết, gói vào giấy sạch

có khổ rộng phù hợp, ghi chú thông tin cần thiết bên ngoài Nếu vết nằm trên các vật mang lớn, dùng dao mỏng để cạy, cạo lấy dấu vết, gói vào giấy sạch, phong bì hoặc cho vào các lọ thủy tinh sau đó ghi chú bên ngoài Hoặc dùng bông, vải sạch thấm nước cất sau đó lau nhẹ nhiều lần để thu dấu vết, để khô

tự nhiên và tiến hành bảo quản tương tự như trên

Đối với dấu vết máu còn lỏng và ướt: Nếu dấu vết ở dạng lỏng, khối lượng nhiều dùng xi lanh bơm hút từ 5-10 cc cho vào lọ thủy tinh sạch, ghi chú bên ngoài và bảo quản trong tủ lạnh Trường hợp dấu vết ướt nhưng tồn tại với lượng ít, dùng bông hoặc vải sạch thấm vết sau đó để khô ở điều kiện

tự nhiên, bảo quản trong chai, lọ thủy tinh sạch hoặc gói vào giấy sạch ghi chú bên ngoài Các dấu vết ở vị trí khác nhau cần phải thu lượm, bảo quản riêng rẽ, ghi chú cẩn thận, đầy đủ.[4]

1.3 Các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu

Nguyên lý chung của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu

Sơ đồ 1 Nguyên lý của các phương pháp định hướng dấu vết máu[5]

- Kết quả âm tính (không màu hoặc không thay đổi màu sắc) có nghĩa

là dấu vết cần giám định không phải là máu

- Kết quả dương tính (hiện màu hoặc thay đổi màu sắc) có nghĩa là dấu vết cần giám định có khả năng là máu

Các kít định hướng tạo phản ứng màu hoặc phát ra ánh sáng

Các kít dựa vào đặc tính catalase của máu (sự có mặt của haemoglobin Thành phần phản ứng:

- Chất tạo màu (các hoá chất thay đổi màu như benzidine,

tetramethylbenzidine, luminol, )

- Hydrogen peroxide (H2O2) là chất oxi hoá

- Chất xúc tác (haemoglobin hoặc peroxidase)

H2O2 oxi hoá hoá chất không màu thành hoá chất có màu

Sơ đồ phản ứng chung:

Chất nhận + H2O2 <=> Chất nhận bị oxi hoá + H2O

Trong kít xác định dấu vết máu, TMB (hoặc các chất khác) là chất nhận: TMB không màu + H2O2 <=> TMB (màu xanh) + H2O

Đặc điểm của các phương pháp giám định định hướng dấu vết máu:

- Ứng dụng chất tạo màu (hoá chất thay đổi màu)

- Ứng dụng tác nhân oxi hoá (hydrogen peroxidase)

Âm tính giả: Phản ứng cho kết quả âm tính mặc dù chất đó là máu hoặc có mặt thành phần máu là do:

- Dấu vết có thể quá lâu hoặc máu quá loãng nên không tạo phản ứng

- Những chất làm ảnh hưởng đến quá trình phản ứng vào phản ứng (hợp chất khử, axit).[5]

1.4 Phương pháp miễn dịch khuếch tán kép - Ouchterlony:

Sử dụng kỹ thuật này để xác định protein đặc hiệu loài trong dấu vết máu:

Nguyên tắc của phản ứng là trong huyết thanh, trong các dịch cơ thể đều có chứa các kháng nguyên đặc hiệu loài Khi các kháng nguyên này kết hợp với các kháng thể đặc hiệu sẽ tạo thành dạng kết tủa, nhìn thấy được

Trong kỹ thuật này, sự khuếch tán của kháng nguyên và kháng thể gặp nhau từ những giếng trên thạch Nhìn chung, giếng trung tâm chứa phần kháng nguyên, các huyết thanh thử nghiệm được đặt ở các giếng xung quanh Để một cặp kháng nguyên – kháng thể xuất hiện, vị trí của vạch kết tủa trên thạch phụ thuộc duy nhất các hệ số khuếch tán điện kháng và không phụ thuộc vào nồng độ Tuy nhiên, có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự kết tủa:

- Chất lượng của thạch

- pH và nhiệt độ

- Bản chất kháng nguyên

- Sự xuất hiện kết tủa liên quan đến nồng độ kháng nguyên – kháng thể Phương pháp này được ứng dụng trong tự miễn để phân tích chất lượng của 1 hỗn hợp kháng thể đôi khi phức tạp Sự xuất hiện nhiều vạch kết tủa chỉ

ra sự hiện diện một số cặp kháng nguyên – kháng thể giống nhau (1 vài cặp

có thể xếp chồng lên nhau) Hơn nữa, nó cho phép nhận dạng các kháng thể bằng cách so sánh các phản ứng của chúng đối diện với các huyết thanh mẫu chứng đặc hiệu đơn nghĩa là “huyết thanh mẫu chuẩn” Như vậy, bằng sự so sánh các vạch tạo bởi 2 hệ thống kháng nguyên – kháng thể, có thể suy luận quan hệ của chúng.[8]

2 Tác động của một số yếu tố môi trường đến sự toàn vẹn của phân tử ADN

2.1 ADN trong tế bào máu

Trong máu người, các tế bào hồng cầu lưu thông trong hệ tuần hoàn không chứa nhân mà chỉ có các tế bào bạch cầu mới có nhân Lượng bạch cầu có trong 1mm3

máu của người khỏe mạnh thường từ 4000 – 5000, nhưng cũng có khi lên đến 9000 Bạch cầu là tế bào lưỡng bội như các tế bào thể khác và mỗi tế bào chứa khoảng 5 -6 Pg ADN (5-6x 10 -12

g), khác với tế bào tinh trùng và trứng là tế bào đơn bội, chỉ chứa khoảng 2,5 – 3 Pg ADN.[7]

Vì máu tươi (dưới dạng lỏng) thường dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm bình thường nên cần được tẩm lên vải bông sạch rồi để khô tự nhiên và bảo quản trong điều kiện lạnh (từ 0-200C) Dấu vết máu khô trên các vật mang cứng, không thấm cũng được dùng bông sạch làm

ẩm bằng nước cất lau vị trí có dấu vết máu để khô tự nhiên rồi mới đem tách chiết

2.2 Cấu trúc của ADN

ADN là phân tử polymer lớn mạch dài gồm nhiều monomer nối với nhau, mỗi monomer trong ADN gọi là nucleotid Mỗi nuleotide gồm ba thành phần: bazơ nitơ (là dẫn xuất của purin hoặc pyrimidin), đường pentose và nhóm phosphat ADN của nhân có cấu trúc từ hai sợi xoắn kép có phân tử lượng rất lớn, mỗi sợi ADN của nhân có cấu trúc từ hai sợi xoắn kép có phân

tử lượng rất lớn, mỗi sợi ADN là một chuỗi nucleotid gồm 4 loại bazơ ni tơ: Adenin (A), Guanin (G), Cytozin (C) và Timin (T) sắp xếp kế tiếp nhau, liên kết với nhau bằng liên kết phosphodiester của đường deoxiribose (C5H10O4) Hai mạch đơn nối với nhau nhờ các cầu nối hydro (A=T); bazơ Guanin nối với bazơ Timin bằng ba liên kết hydro (C≡G) Mỗi mạch đơn là một trình tự

cố định hướng với đầu 5’ là gốc phosphat tự do và đầu 3’ là gốc hydorxyl tự

do

Theo Watson và Crick, phân tử ADN có cấu trúc xoắn kép, các nucleotide (A,

G, T, C) sắp xếp đối diện nhau và cách nhau 3,40

(anstron) Mỗi vòng xoắn chứa 10,4 cặp bazơ nitơ và có độ dài 35,40, các phân tử đường deoxiribose và các nhóm phosphat quay ra ngoài hình thanh các liên kết kỵ nước đảm bảo tính ổn định cho đại phân tử ADN [4]

Hình1 Sơ đồ cấu trúc đại phân tử ADN

2.2 Sự tác động đến tính toàn vẹn của phân tử ADN

Các điều kiện của môi trường làm tác động đến sự toàn vẹn của phân tử ADN bằng việc bẻ gãy chúng một cách ngẫu nhiên thành những phân mảnh nhỏ hơn Các phân tử ADN thường rất nhạy cảm với tác nhân là hóa chất, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm Đây là lý do tại sao rất khó để thu được ADN có chất lượng tối ưu từ những mẫu ở ngoài hiện trường tồn tại trong thời gian dài Kẻ thù đối với sư toàn vẹn của các phân tử ADN thường là nước và các enzym nuclease, mà cả hai nhân tố này thường có mặt ở khắp nơi trong môi trường

tự nhiên Ở điều kiện nhiệt đô, độ ẩm cao (ví dụ: 30 – 450

C; 70-80% độ ẩm) các vi sinh vật sẽ phát triển thuận lợi Khi các vi sinh vật phát triển mạnh, chúng sẽ có sản sinh ra các enzym có khả năng phân cắt ADN Tia tử ngoại (UV) cũng là nhân tố có tác động rất lớn đến sự biểu hiện các gen và làm hư hại, đứt gãy ADN

Cấu trúc đại phân tử ADN là chuỗi xoắn kép để bảo vệ các base, tuy nhiên dưới tác động của các yếu tố gây biến tính, sự gia nhiệt quá độ hoặc sự thủy phân có thể làm mở và phá vỡ cấu trúc xoắn kép của phân tử ADN giúp thúc đẩy nhanh quá trình đứt gãy cấu trúc của đại phân tử

Một liên kết hóa học có vai trò quan trọng đối với sự bền vững của đại phân tử ADN đó là liên kết phosphate diester Các phản ứng thủy phân làm đứt gãy liên kết này dẫn đến làm mất các base mã hóa gây nên sự xáo trộn cấu trúc phân tử ADN

Ngoài ra phân tử ADN trong môi trường còn phải chịu sự tác động của quá trình ô xi hóa có thể gây nên những sự biến đổi hóa học qua đó làm thay đổi đặc tính của phân tử ADN, chúng làm đứt gãy hay phân hủy các liên kết phosphodiester và các carbon-ni tơ (sugar-base) Việc giảm độ dài của phân

tử ADN xảy ra do các quá trình tự phân trong cơ thể, ngay sau khi cơ thể chết quá trình này sẽ diễn ra từng phần làm đứt gãy sợi nhiễm sắc Nghiên cứu của Thomas WK cho thấy mặc dù đã tiến hành sấy khô mẫu và giảm sự thủy phân nội sinh thì sự oxi hóa vẫn tấn công mẫu liên tục.[4]

Hình 2 Sơ đồ các vị trí đứt gãy trên cấu trúc đại phân tử ADN[12]

Một mẫu máu được tạo ra ở hiện trường, ADN trong các mẫu đó theo thời gian và các điều kiện môi trường xung quanh thường phải trải qua các quá trình phân hủy như sau:

Sự biến tính: xảy ra sự phân cắt ở mạch đôi của phân tử ADN tạo ra các

mạch đơn, để từ đó dễ dàng tiếp cận hơn với các phân cắt hóa học khác

Sự liên kết chéo: phân tử mạch đôi ADN hình thành liên kết với các

phân tử khác như protein làm cho ADN mất dần các đặc tính vốn có Khởi đầu là quá trình hydroxymethyl hóa thuận nghịch của các nhóm imino và amino của nhóm acid nucleic Sau đó, một phản ứng chậm hơn hình thành nên cầu nối giữa các base Kết quả là hình thành nên liên kết chéo giữa ADN với các thành phần khác của tế bào chẳng hạn như protein Phức hợp ADN

Nhóm phosphate

Nhóm phosphate

Nhóm đường Base purin

Base pirimidine

Vị trí phân cắt thủy phân

Vị trí tác động oxi hóa

histone sẽ hình thành sự cố định formaldehyde Nhìn chung, có một số tương tác đặc hiệu giữa ADN mạch kép và formaldehyde:

- Sự phá vỡ liên kết hydrogen giữa purin và pyrimidine dẫn đến quá trình biến tính nhanh ADN mạch kép và không hồi tính lại được

- Sự hình thành các nucleic acid khép kín (dẫn xuất của methylol)

- Các liên kết chéo cầu nối Methylene

- Thủy phân dần các liên kết N-glycosidic để giải phóng purine

- Cắt các liên kết phosphodiester tạo ra các chuỗi poly-deoxyribose ngắn

Phá vỡ chuỗi: sự phá vỡ liên kết đường - phosphate của ADN gây nên

sự đứt gãy đối với phân tử ADN

Sự biến đổi hóa học: sự thay đổi hóa học trong các nucleotide xảy ra

thông qua việc thêm, bớt hoặc thay thế các nhóm hóa học, tạo nên sự thay đổi

về trình tự chuỗi nucleotide.[

3 Giám định ADN từ dấu vết máu

3.1 Khái niệm và sự ra đời của giám định gen (ADN)

Giám định gen là phương pháp phân tích các đặc điểm cấu trúc phân tử ADN, để từ đó phân biệt những đặc điểm giống nhau và khác nhau giữa các

cá thể cũng như các cấu trúc di truyền khác trong khi đó phương pháp huyết

thanh học chỉ xác định các đặc điểm kiểu hình (phenotype) được biểu hiện ra

bên ngoài (tính trạng) do gen quy định Chính vì vậy giám định gen có khả năng truy nguyên cá thể và xác định quan hệ huyết thống của các cá thể Để giải quyết vấn đề này giám định gen phải tiến hành phân tích ADN từ các dấu vết và mẫu phẩm sinh học phát hiện thu lượm được trong các vụ việc liên quan như án mạng, hiếp dâm, loạn luân, người chết không rõ tung tích…[4]

Đầu thế kỷ XX nhờ các phát minh của các nhà khoa học người ta đã biết sử dụng dấu vết máu trong công tác điều tra hình sự Việc sử dụng dấu

vết máu dựa trên việc phát hiện ra protein lạ trong máu của nhà khoa học Nga Tristovich năm 1899, tiếp theo là phương pháp phân biệt máu người và máu vật của nhà khoa học Đức Paul Ulengut và việc phát hiện ra hệ thống nhóm máu ABO của nhà khoa học người Áo Karl Landsteiner năm 1902 Nhờ các phát hiện này mà các phương pháp phân tích trong huyết thanh học ra đời làm

cơ sở cho công tác giám định dấu vết máu trong khoa học hình sự Cho đến trước khi giám định gen ra đời thì khoa học hình sự thế giới từ trước đến nay vẫn áp dụng phương pháp huyết thanh học để phân tích các dấu vết, mẫu vật

có nguồn gốc từ cơ thể người Các phương pháp phân tích huyết thanh học nhằm xác định nhóm máu theo hệ ABO, MN, các nhóm enzym…, các nhóm kháng nguyên bạch cầu… Các phương pháp này có những hạn chế là không xác định được đến cá thể người, hoặc xác định huyết thống một cách chính xác mà chỉ có tác dụng loại trừ bớt các dấu vết mẫu vật không có liên quan hoặc thu hẹp diện đối tượng nghi vấn Tùy theo từng vụ việc cụ thể mà các phương pháp này cũng có tác dụng nhất định trong định hướng điều tra hoặc xét xử tội phạm Do đó đến nay một số nước trên thế giới vẫn đang duy trì cả hai lĩnh vực giám định các dấu vết sinh học có nguồn gốc từ con người bằng

cả hai phương pháp huyết thanh học và giám định gen.[4]

Giám định gen ra đời đã khắc phục được các hạn chế của các phương pháp giám định huyết thanh học vì có sự khác biệt về bản chất giữa hai phương pháp Phương pháp huyết thanh học chỉ xác định các đặc điểm kiểu hình được biểu hiện bên ngoài do gen quy định Ngược lại phương pháp phân tích gen là xác định các đặc điểm cấu trúc ở ngay trong phân tử ADN, để từ

đó phân biệt những đặc điểm giống nhau và khác nhau giữa các cá thể cũng như các cấu trúc di truyền khác Như vậy xét về tính khoa học và quy mô công nghệ thì phương pháp giám định gen đảm bảo độ tin cậy và chính xác rất cao

Sự ra đời của giám định gen dựa trên những thành tựu của những nghiên cứu về gen và nhiễm sắc thể Những tiến bộ mới trong công nghệ gen vào đầu những năm 1970 đã tạo tiền đề và cơ sở vững chắc cho việc nghiên cứu tính đa hình của ADN Trước hết phải kể đến kỹ thuật dùng enzim giới hạn để xác định tính đa hình của ADN nhờ kỹ thuật Southern Blot của Edwin Southern năm 1975

Năm 1985 được coi là bước ngoặt lớn trong lịch sử phát triển Khoa học hình sự thế giới và sinh học hình sự, đó là năm mà Alec Jeffreys và các cộng

sự ở nước Anh khi nghiên cứu các đoạn ADN mã hóa protein Myoglobin của người đã phát hiện ra trình tự các base được lặp lại một số lần, các đoạn lặp

lại này được goi là các tiểu vệ tinh (Minisattelite) Điều đáng chú ý là các tiểu

vệ tinh này ở các cá thể khác nhau thì khác nhau Các tiểu vệ tinh còn được phát hiện thấy ở những vị trí khác nhau trong hệ gen người Đây là đặc điểm quan trọng để phát hiện sự khác nhau giữa các cá thể Các tiểu vệ tinh này có tên Variable number of tandem repeat – VNTR (sự biến đổi số lượng các đoạn lặp) Những kỹ thuật cổ điển như đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP), kỹ thuật này đòi hỏi các phân tử ADN có trọng lượng cao ở trong mẫu cần phân tích với mục đích phát hiện ra những VNTR lớn khoảng trên dưới 20 000 bp Kỹ thuật chạy điện di trên gel agarose được nhuộm bằng ethidium-bromide thường được dùng để đánh giá chất lượng của một mẫu ADN nào đó Thường các ADN có trọng lượng phân tử cao, chất lượng tốt sẽ cho kết quả băng vạch sắc nét, kích thước vào khoảng xấp xỉ 20000 bp tương ứng với một trọng lượng phân tử của một marker tương ứng Mặt khác, các

ADN bị đứt gãy thường được xuất hiện dưới dạng băng vạch mờ (smear) và

kích thước nhỏ hơn 20000 bp

Cũng vào năm 1985, một thành tựu khoa học vĩ đại khác đặc biệt có giá trị trong các nghiên cứu sinh học phân tử nói chung và giám định gen nói

riêng là việc nghiên cứu thành công phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) của nhà sinh hóa người Mỹ Kary Mulllis nhờ có phát minh này mà các kỹ thuật trong phân tích ADN đã trở nên dễ dàng hơn Nhân bội ADN nghĩa là làm tăng l-ượng ADN lên rất nhiều từ một lượng rất ít ban đầu [4] Kỹ thuật PCR do Karry Mullis và các cộng sự phát minh vào năm 1985 đã tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử Kỹ thuật này là một phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen Các phòng thí nghiệm phân tích ADN và ngành khoa học hình sự đã có những thành tựu vượt bậc nhờ vào kỹ thuật này [5,6] ADN thu được từ hiện trường thường ít và chất lượng không tốt do vậy nhiều mẫu sẽ không thể phân tích được Kỹ thuật PCR sẽ giúp khắc phục hạn chế này vì nó có thể tạo ra hàng triệu phiên bản của một trình tự ADN khuôn ban đầu trong vòng vài giờ nhờ hai đoạn mồi oligonucleotit tương hợp với hai đầu 3'

ở cả hai sợi của đoạn ADN đích

(target sequence) với sự tham gia của ADN- polymerase, deoxynucleotide

triphosphate (dNTPs), đệm PCR [2]… Từ một lượng ADN khuôn rất nhỏ ban đầu, bằng kỹ thuật PCR người ta có thể làm tăng lên đến hàng triệu bản sao Nếu dùng kỹ thuật enzym giới hạn thì lượng ADN dùng cho một phép thử là

50 ng, còn dùng kỹ thuật PCR thì lượng ADN ban đầu chỉ là 0,1 – 0,2 ng cũng đủ cho việc phân tích Đến thời điểm này giám định gen hình sự chính

thức ra đời Khi đó gọi là vân tay di truyền (DNA finger printing), sau này Ủy ban nghiên cứu quốc gia Mỹ đổi tên thành lập hồ sơ ADN (DNA profiling)

Những ứng dụng đầu tiên của giám định gen hình sự được thực hiện ở Anh năm 1986, Cục điều tra liên bang Mỹ (FBI) năm 1988 và dần phát triển ở hầu hết các nước châu Âu Riêng ở châu Á, Trung Quốc ứng dụng kỹ thuật gen trong điều tra tội phạm năm 1987, Singapore năm 1991, Thái Lan năm 1998

và Việt Nam năm 1999 Đến nay giám định gen đã trở thành phổ biến và mang tính quốc tế.[2]

Các phương pháp phân tích dựa trên kỹ thuật PCR cho phép tiến hành giám định gen từ những mẫu mà chưa từng được phân tích trước đây như: mẫu đầu lọc thuốc lá, mẫu tóc của cá thể, nước tiểu, mảnh móng tay, và các vết cắn, và cải thiện sự thành công khi phân tích các mẫu xương và mô cơ bị phân hủy, bị cháy và mẫu tồn tại lâu năm Bên cạnh đó, trong giám định gen

cũng ra đời thuật ngữ “vệt ADN” hay là “chạm ADN” (trace DNA, touch

DNA) trước đây đã được nhắc đến là lượng bản sao nhỏ hay lượng khuôn nhỏ

(low copy, low template) có thể thích hợp dùng thuật ngữ này khi nhắc đến

việc thu thập những mẫu sinh học với lượng rất nhỏ ở hiện trường vụ án hoặc quá trình thu thập và tách chiết lượng cực nhỏ những vật liệu từ những mẫu trong phòng thí nghiệm hình sự [10]

Các phương pháp phân tích dựa vào PCR ngày nay như phân tích phức

hợp STR (multiplex STR typing) trở nên rất ưu việt bởi lẽ chỉ từ những lượng

cực nhỏ ADN cũng có thể đo đếm được bằng việc khuếch đại chúng đến một mức nào đó mà chúng có thể được phát hiện ra Với lượng chỉ nhỏ hơn 1 ng ADN giờ đây có thể được phân tích với sự khếch đại PCR phức hợp các alen STR so với việc yêu cầu với lượng phải 100 ng hay nhiều hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP trong những năm trước đây Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật với

độ nhạy cao đòi hỏi lượng ADN thấp cũng đem lại nhiều rủi ro, thách thức trong việc tránh sự tạp nhiễm từ các cảnh sát điểu tra, hay các cán bộ khám nghiệm hiện trường khác, những người có nhiệm vụ thu thập các mẫu chứng

cứ sinh học Để chi việc khuếch đại PCR được diễn ra thành công, ADN khuôn phải được nguyên vẹn đặc biệt ở vị trí gắn cặp mồi cũng như vị trí giữa các mồi sao cho việc tổng hợp kéo dài có thể được diễn ra Khi không có được một mạch ADN nguyên vẹn xung quanh vùng lặp STR đóng vai trò như một mạch khuôn, thì phản ứng PCR sẽ không thành công bởi vì việc kéo dài mồi sẽ bị tạm dừng ở vị trí đứt gãy trên mạch khuôn Ở một mẫu ADN bị

phân hủy càng nhiều thì sẽ càng nhiều sự đứt gãy xảy ra trong ADN khuôn và

sẽ các ít phân tử ADN có được chiều dài đầy đủ cần thiết cho sự khuếch đại PCR

Với việc sử dụng các locus STR có thể được khuếch đại với lượng sản phẩm nhỏ, do đó sẽ tạo cơ hội lớn hơn cho các mồi STR tìm ra được một vài chuỗi ADN nguyên vẹn cho việc khuếch đại Hơn nữa, dải kích thước hẹp các của các alen STR sẽ giúp ích cho việc phân tích các mẫu ADN bị đứt gãy vởi

việc mất alen (allele dropout)

3.2 Cơ sở khoa học của giám định gen

Trong bộ máy di truyền, nhiễm sắc thể đóng vai trò quan trọng nhất, nó

là vật liệu di truyền của cơ thể sinh vật được truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Nhiễm sắc thể bao gồm ADN, protein histon và các thành phần khác tồn tại trong nhân tế bào Trong phân tử ADN có chứa gen Gen được coi là đơn

vị cơ sở của vật liệu di truyền và đồng thời là đơn vị chức năng Về mặt cấu trúc, gen là một đoạn ADN xác định một tính trạng của cơ thể Chẳng hạn, các tính trạng được thể hiện ra ngoài mà ta có thể dễ dàng nhận biết được như

là màu tóc, hình dáng (cao, thấp), khuôn mặt… đều do gen quy định Thông tin di truyền của các gen được mã hóa trong ADN và quyết định tính biến dị của loài và cá thể Gen có khả năng bị đột biến.[4]

Trong quá trình nghiên cứu về gen đã hình thành nên hai khái niệm là locus và alen Hai khái niệm này liên quan trực tiếp đến giám định gen Locus

là vị trí của gen trên nhiễm sắc thể Còn alen là các dạng biểu hiện khác nhau của cùng một gen trong một locus Nguồn gốc sinh ra các alen mới là do đột biến gen gây ra Do gen nằm ở các vị trí tương ứng trên nhiễm sắc thể tương đồng nên ở sinh vật lưỡng bội tại từng locus nhất định, mỗi gen chỉ có tối đa hai alen (ví dụ: AA, Aa, aa) Hai gen A và a chỉ hai trạng thái khác nhau của cùng một tính trạng được gọi là cặp gen tương ướng hay cặp gen alen

Sự khác biệt giữa các cá thể trong quần thể hay giữa các quần thể khác nhau đã tạo nên sự phong phú và đa dạng của thế giới sinh vật Sự đa dạng này đƣợc xác định bởi tính đa hình trong cấu trúc gen của phân tử ADN Vậy tính đa hình là sự biểu hiện của ba alen hay nhiều hơn ở một gen nào đó trong một quần thể có nhiều alen khác nhau Tính đa hình đƣợc xác định có hai loại:

Một là: khác nhau về số lần lặp lại của các cặp base Sự khác nhau về

số lần lặp lại của các cặp base dẫn đến sự khác nhau về chiều dài của đoạn các base lặp lại Ví dụ:

Cá thể 1: GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT = 6 lần lặp lại, tổng chiều dài là 6 đơn vị

Cá thể 2: GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT GGAT = 8 lần lặp lại, tổng chiều dài là 8 đơn vị

Hai là: Khác nhau về trình tự của các cặp base, ví dụ:

Nếu phân tích tổ hợp nhiều gen thì độ chính xác gần như tuyệt đối Theo tính toán của các nhà khoa học thuộc tập đoàn Perkin Elmer (Mỹ) khi phân tích tổ hợp 9 gen hệ Nineplex thì khoảng 70 tỷ người trên thế giới mới có người thứ

2 trùng kiểu gen Trong thực thế giám định gen ở Viện Khoa học hình sự thì con số này còn lớn hơn nhiều, tới hàng trăm tỷ hoặc nghìn tỷ Như vậy cũng

có nghĩa là sự trùng lặp kiểu gen của hai người là rất khó xảy ra

Tuy vậy, mỗi cá thể tuy là độc lập nhưng lại có mối quan hệ huyết thống chặt chẽ với thế hệ bố mẹ Thế hệ con cái bao giừ cũng thừa hưởng các đặc tính di truyền từ thế hệ bố mẹ với xác suất ngang nhau nhờ quá trình sinh sản hữu tính Đây là nguyên lý cơ bản để xác định mối quan hệ huyết thống trong giám định gen.[4][1]

Các phương pháp giám định gen dựa vào kỹ thuật PCR ngày nay như

phân tích phức hợp các locus STR (multiplex Short Tandem Repeat typing)

trở nên rất ưu việt bởi lẽ chỉ cần những lượng cực nhỏ ADN cũng có thể khuếch đại chúng đến một mức nào đó mà chúng có thể được phát hiện ra Với lượng chỉ nhỏ hơn 1 ng ADN cũng có thể được phân tích nhờ sự khếch đại PCR với một phức hợp các alen STR so với việc yêu cầu lượng 100 ng hay nhiều hơn khi sử dụng kỹ thuật RFLP trong những năm trước đây Tuy nhiên, khi sử dụng kỹ thuật với độ nhạy cao đòi hỏi lượng ADN nguồn vào thấp cũng đem lại nhiều rủi ro, trong việc tránh sự tạp nhiễm từ gây ra bởi các cán bộ điều tra vụ án, hay các cán bộ khám nghiệm hiện trường, những người

có nhiệm vụ thu thập, bảo quản các mẫu chứng cứ sinh học mà cụ thể là các dấu vết máu ở hiện trường Để việc khuếch đại PCR được diễn ra thành công, ADN khuôn cũng cần phải được nguyên vẹn ở một mức độ nhất định, đặc biệt

ở vị trí gắn cặp mồi cũng như vị trí giữa các mồi sao cho việc tổng hợp kéo dài có thể được diễn ra Trong trường hợp không có được một mạch ADN nguyên vẹn xung quanh vùng lặp STR đóng vai trò như một mạch khuôn, thì

phản ứng PCR sẽ không thành công bởi vì việc kéo dài đoạn mồi sẽ bị tạm dừng ở vị trí đứt gãy trên mạch khuôn Với một mẫu ADN bị phân hủy càng nhiều thì sẽ có càng nhiều sự đứt gãy xảy ra trong ADN khuôn và càng ít phân tử ADN có được chiều dài đầy đủ, cần thiết cho sự nhân bội được chính xác trong mỗi phản ứng PCR

Chất lượng và số lượng của ADN được tách chiết từ các mẫu trên được xác định thông qua kết quả định lượng bằng phương pháp real-time PCR và

biểu đồ phân tích kiểu gen STR theo hệ Identifiler TM

sử dụng phương pháp điện di mao quản Thông tin thu nhận được sử dụng để đánh giá mức độ phù

hợp của ADN ở trong mẫu giám định phục vụ cho việc phân tích STR (short

tandem repeat) trong kỹ thuật điểm chỉ ADN (DNA typing)

Các kết quả thu được sẽ chỉ ra rằng liệu ADN có đủ chất lượng và trọng lượng phân tử sau khi được tách chiết từ các vết máu bám dính trên các mẫu vật chứng ở những điều kiện và thời gian khác nhau Bước tiếp theo là phân tích STR đối với một số mẫu đã được chọn lựa từ đó cho biết mức độ dao động của chất lượng và số lượng ADN để phù hợp cho loại phân tích này Phân tích ADN để thu nhận thông tin từ các mẫu, dấu vết sinh học phục vụ cho việc điều tra tội phạm, xác định quan hệ huyết thống, nhận dạng nạn nhân thảm họa hay nhận dạng người mất tích

4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lĩnh vực liên quan đến

đề tài

4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trong những năm gần đây đã có một số nghiên cứu có đề cập đến dấu vết ADN hình sự sử dụng các kỹ thuật về khuếch đại và phân tích ở những lượng ADN khuôn rất nhỏ

Đã có nhiều nghiên cứu về tính ứng dụng của kỹ thuật phân tích tính đa hình các đoạn lặp đơn giản (SSR) phục vụ giám định ADN trong công tác kỹ thuật hình sự Trong các tài liệu nghiên cứu đó, có một số công trình tiến hành dựa trên mức độ tin cậy của sự tồn tại kỹ thuật này, tuy nhiên hiếm có nghiên cứu nào thông báo về vấn đề mức độ tác động của các yếu tố môi trường và vật mang lên sự toàn vẹn của các phân tử ADN, và sự tác động của chất lượng ADN khuôn lên khả năng để tiến hành một chuỗi các công đoạn trong quy trình giám định ADN hình sự sử dụng kỹ thuật SSR, đặc biệt là giám định ADN từ dấu vết máu

Một số nghiên cứu trước đây về sự tác động của nhân tố môi trường lên

chất lượng của dấu vết máu khi sử dụng kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment

Length Polymorphism) hay kỹ thuật Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn

Công trình nghiên cứu: “sự tác động của yếu tố môi trường và vật mang lên phân tử ADN” có sử dụng vào các mẫu vật chứng từ các vụ án ở thành phố New York, được tiến hành vào năm 1989 bởi Lorah McNally, Robert C.Shaler, Michael Baird, Ivan Balazs , Lawrence Kobilinsky và Peter

De Forest.[9] Nghiên cứu đi vào phân tích các tác động của môi trường và vật mang lên chất lượng của ADN tách chiết được từ các vật chứng của các vụ

án Chất lượng của ADN tách chiết được từ các vụ án thực tế, xác định bằng việc đo kích thước các băng vạch xuất hiện trên bản gel của điện di agarose Thông tin nhận được giúp dự đoán mức độ phù hợp của ADN trong các mẫu vật chứng để sử dụng cho phương pháp phân tích đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) Các mẫu vật chứng được lựa chọn theo chất liệu của vật mang (dấu vết máu cạo, túi nhựa, vải tổng hợp, vải bông chéo, vải trải thảm)

và chất lượng cảm quan của dấu vết (bị bẩn bởi đất cát, bụi, hoặc bị tạp nhiễm) và cả kích cỡ của dấu vết (to, nhỏ) Kết quả cho biết ADN tách chiết

từ các mẫu vật chứng ở những điều kiện môi trường chưa được biết trước sau

đó được làm khô trên các vật mang khác nhau có đủ chất lượng và trọng

lượng phân tử cho việc phân tích RFLP hay không? Đây là một nghiên cứu

khá đầy đủ về các yếu tố thường tác động đên chất lượng của dấu vết máu sử dụng kỹ thuật RFLP, là một kỹ thuật đã cũ và có nhiều nhược điểm so với phương pháp STR được dùng phổ biến hiện nay trong kỹ thuật dấu vân tay di truyền

Một nghiên cứu khác cũng được tiến hành cùng vào năm 1989 đó là nghiên cứu đánh giá ADN tách chiết được từ các dấu vết máu người sau khi

được xử lý với tia cực tím, nguồn nhiệt, độ ẩm và nhiễm bẩn đất cát (Journal

of Forensic Sciences) bởi nhóm các nhà khoa học: Lorah McNally, Robert

C Shaler, Michael Baird Ivan Balazs, 1 Ph.Peter De Forest, D Crim và Lawrence Kobilinsky Nghiên cứu này phân tích các tác động của các điều kiện môi trường thường gặp lên khả năng thu nhận ADN thông qua kỹ thuật RFLP từ những mẫu khảo nghiệm Các điều kiện môi trường được tạo ra bằng cách sử dụng các dấu vết máu đã được làm khô sau đó đưa vào môi trường có

ẩm độ tương ứng là: 0, 33, 67, và 98 %, sử dụng nguồn nhiệt ở 37o

C và tia cực tím với từng khoảng thời gian, tối đa là 5 ngày Kết quả nghiên cứu cho thấy dưới điều kiện nghiên cứu, chất lượng và số lượng của ADN không làm hỏng kiểu gen thu được theo phương pháp RFLP Các yếu tố tác động chỉ làm cho chỉ thị RFLP trở nên yếu hơn

Nghiên cứu sự tác động của nhiệt độ và độ pH lên dấu vết máu được thực hiện bởi Kannika Sutthapodjanarux, Nathinee Panvisavas và Nopadol Chaikum thuộc Đại học Mahidol, Bangkok, Thái Lan năm 2009 Trong nghiên cứu này, sự tác động của nhiệt độ và pH lên việc phân tích ADN và phát hiện ra dấu vết máu bằng nguồn sáng so le Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, việc sử dụng nguồn sáng so le để phát hiện dấu vết máu trên hai bề mặt khác nhau không bị tác động bởi nhiệt độ và độ pH của dấu vết Dung dịch có

tính kiềm và acid đậm đặc có tác động đến việc phân tích ADN Tuy nhiên, các kết quả phân tích ADN vẫn có thể được thu nhận được từ các dấu vết máu

đã được xử lý bằng NaOH 0.1M và nhiệt độ thấp hơn 2500

C

Nghiên cứu sự tác động đến sự đứt gãy ADN và sự ức chế lên phản ứng PCR của các mẫu giám định hình sự của Bruce McCord, Kerry Opel, Maribel Funes, Silvia Zoppis, và Lee Meadows Jantz thực hiện tháng 11/2011 tại đại học quốc tế Florida và đại học Tennessee Knoxville Mục đích của nghiên cứu này là phân tích cơ chế của sự ức chế PCR, sự đứt gãy và các tác động của môi trường lên sự đứt gãy của phân tử ADN Những tác động này đã được biết đến là làm nghèo sự khuếch đại và bị mất alen (alen dropout) Tuy nhiên có rất ít nghiên cứu trong lĩnh vực kỹ thuật hình sự về vấn đề các nhân

tố ức chế làm nghèo sản phẩm PCR và cơ chế của sự đứt gãy thường có mặt trong mẫu vật chứng của các vụ án hình sự Tác giả sử dụng kỹ thuật real time

PCR và Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)/ điện di để đánh giá cơ

chế của sự đứt gãy ADN, sự phân hủy oxi hóa và sự ức chế phản ứng PCR khi phân tích sử dụng các marker STR Nghiên cứu này tiến hành một loạt các thí nghiệm:

- Phân tích sự tác động của các tác nhân ức chế sự khuếch đại PCR sử dụng realtime PCR

- Phân tích tác động của của sự đứt gãy tự nhiên và và đứt gãy dước tác động của enzym lên sản phẩm PCR

- Phân tích sự tác động của quá trình oxi hóa hóa học lên kiểu gen thu được

- Phân tích sự tác động qua lại giữa sự ức chế phản ứng PCR và sự khuếch đại ADN

Nghiên cứu đã đưa ra kết luận rằng: các yếu tố môi trường gây hư hại tới ADN trong mẫu mô xảy ra nhanh đến mức ADN gần như không thể thu hồi được Quá trình các phân tử ADN khuôn trong các mẫu bị bẻ gãy thành các phân đoạn rất nhỏ diễn ra trong thời gian chưa đến 3 tuần Sự tác động của quá trình oxi hóa là rất nhỏ Sự kết hợp của realtime PCR và sử dụng đường cong biến tính ADN là một công cụ hữu hiệu để phát hiện sự ức chế PCR và cho phép phân loại các nhân tố ức chế Chiều dài của ADN mạch khuôn và nồng độ các chất ức chế cho thấy các nhân tố ức chế PCR có thể tác động đến các phản ứng có Taq polymerase qua đó làm giảm tổng lượng sản phẩm ADN Các nhân tố ức chế PCR tác động đầu tiên lên các alen có độ dài lớn nhất, rồi mới đến các alen có độ dài nhỏ hơn

4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Những năm qua, do tính đặc thù cao nên trong nước rất hiếm có những

đề tài nghiên cứu về chất lượng của dấu vết máu phục vụ giám định hình sự.Mới đây, công trình nghiên cứu lý luận về vai trò của dấu vết máu: luận án tiến sỹ của Lê Quốc Huy, Học viện Cảnh sát nhân dân có tên “Nghiên cứu dấu vết sinh vật trong hoạt động điều tra tội phạm” được tiến hành năm 2012

Đề tài đã bổ sung, hoàn thiện hệ thống lý luận cơ bản về dấu vết sinh vật nói chung và dấu vết máu trong hoạt động điều tra tội phạm Tuy nhiên đây là công trình nghiên cứu mang tính lý luận, đặc biệt trong hoạt động điều tra qua các công tác: phát hiện, ghi nhận, thu lượm, bảo quản, đánh giá, giám định dấu vết sinh học nói chung Đề tài chưa đi sâu về các vấn đề kỹ thuật sinh học

đề đánh giá về các dấu vết sinh vật và dấu vết máu phục vụ giám định sinh học hình sự

Năm 2006, Công trình nghiên cứu “Bảo tồn Ex-situ vật liệu sống và xây đựng cơ sở dữ liệu cho các tàng thư an ninh” được tiến hành bởi ThS Trần Minh Đôn và các cộng sự, Viện Kỹ thuật hóa sinh và tài liệu nghiệp vụ,

Tổng cục Kỹ thuật, Bộ Công an Đề tài có sử dụng đối tượng nghiên cứu là khoảng trên 200 mẫu máu thu ở hiện trường các vụ án hình sự hoặc các đối tượng phạm tội Các mẫu máu được bảo quản trên các vật mang khác nhau và lưu giữ tại nhiệt độ âm sâu Các mẫu bảo quản được theo dõi đánh giá định kỳ hàng năm bằng kỹ thuật phân tích gen: tách ADN, thực hiện phản ứng PCR

sử dụng mồi của 9 locus đa hình STR (hệ AmpF/ STR Profiler Plus) và điện

di phân tích sản phẩm PCR Qua kết quả điện di có thể đánh giá được sự tồn tại của ADN trên mẫu sinh phẩm lưu giữ Tiến hành lấy sác xuất 5 mẫu trong

số mẫu bảo quản của từng năm Kết quả phân tích trên (thực hiện năm 2006) đối chiếu với kiểu gen đã phân tích ban đầu (các năm 2002, 2003, 2004, 2005) cho thấy tất cả các mẫu máu lưu để bảo tồn vẫn đảm bảo phục vụ cho giám định gen (vẫn phân tích được kiểu gen) Đây chỉ là một phần nhánh của

đề tài, nên chưa đi sâu nghiên cứu được cụ thể một số điều kiện về vật lý, hóa sinh ảnh hưởng đến chất lượng ADN Chưa đánh giá cụ thể về chất lượng của kiểu gen thu được, mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá là có phân tích được kiểu gen hay là không, mà chưa đưa ra được con số định lượng ADN tổng số sau tách chiết, chất lượng của hồ sơ kiểu gen thu được khi phân tích thể hiện bằng

số alen còn, mất, tỷ lệ nhiễu…

Qua nghiên cứu các công trình ở trong và ngoài nước có liên quan tới đề tài, chúng tôi nhận thấy chưa có công trình nghiên cứu nào về sự tác động của yếu tối môi trường lên chất lượng của dấu vết máu phục vụ công tác giám định sinh học đặc biệt là giám định gen trong điều kiện Việt Nam

hiện nay

Chương II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Chelex® 100 Resin (Bio-rad/Mỹ)

- Kít định lượng ADN Quantifiler™ Human ADN Quantification

- Kít AmpFlSTR Identifiler PCR Amplification Kit

- Block gia nhiệt

- Máy điện di mao quản Sequencer ABI-3130 – Mỹ

* Dụng cụ:

- Pipet các loại

- Ống Eppendorf các loại

- Nhiệt kế

- Ẩm kế

- Plate 96 giếng

- Đầu côn các loại

- Lọ thủy tinh, bình đun sôi, phễu, đũa thủy tinh

- Găng tay cao su

1.2 Chọn lựa, thu thập mẫu:

Các dấu vết máu được chọn lựa để khảo sát nghiên cứu từ hai nguồn chính:

- 30 mẫu máu từ hiện trường các vụ án giết người, cướp của thu được dấu vết máu có thời gian tồn tại ở hiện trường khác nhau được phân loại theo

3 mốc là 5 ngày , 10 ngày và 5 tuần được gửi đến trưng cầu giám định tại Trung tâm Giám định Sinh học Pháp lý - Viện Khoa học hình sự - Bộ Công

an Các dấu vết máu được chọn lựa thu thập trên một loại vật mang là vải cotton

- 12 mẫu máu tươi được thấm vào vật mang là các mảnh vải bằng chất liệu cotton sạch, vô khuẩn và được bố trí trong các điều kiện giả cách về nhiệt

độ, độ ẩm, trong 3 mốc thời gian ngày , 10 ngày và 5 tuần

2 Phương pháp nghiên cứu:

2.1 Bố trí thí nghiệm

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các dấu vết máu thu được từ hai nguồn, thứ nhất là từ các vụ án hình sự, thứ hai là các dấu vết khảo nghiệm được tạo ra trong phòng thí nghiệm

Đối với các dấu vết máu thu từ hiện trường các vụ án: do không phân

tích được biệt lập từng yếu tố môi trường tác động lên dấu vết nên các dấu vết máu sẽ được phân loại vào 2 nhóm chính là ở điều kiện trọng nhà và ngoài trời qua 3 mốc thời gian là 3 ngày, 10 ngày và 5 tuần Riêng các dấu vết máu

ở hiện trường là ngoài trời sẽ được chọn lựa và phân vào 4 nhóm tương ứng với bốn mùa trong năm của khí hậu Miền bắc Việt Nam là: mùa xuân (tương ứng với các tháng 1,2,3), hè (tháng 4,5,6), thu (tháng 7,8,9) và mùa đông (tháng 10, 11, 12) trong năm 2012 Các dấu vết máu được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu của đề tài không bị tác động trực tiếp từ những hoạt động của con người như bị giặt tẩy, chùi xóa, sử dụng hóa chất,…

Với các mẫu máu khảo nghiệm: các dấu vết máu được tạo ra bằng cách

sử dụng các mẫu máu tươi, chưa bị đông (không sử dụng chất chống đông) là máu người, được nhỏ với lượng khoảng 50 ul lên vật mang là những mảnh vải cotton khô, sạch sau đó được đưa vào các điều kiện giả định về môi trường, khí hậu

- Các mẫu khảo nghiệm được xử lý nhiệt bằng cách để trong tủ ấm

(incubator) với các mức nhiệt độ được điều chỉnh ở 370C, 450C và 1000C với các mốc thời gian là 10 ngày, 5 tuần Riêng ở nhiệt độ 1000C thì để ở thời gian 10 phút

- Các mẫu được để trong môi trường được duy trì ẩm độ: dùng các buồng ẩm được chuẩn bị bằng việc sử dụng các lọ thủy tinh dung tích 2000ml

có nắp đậy kín Duy trì độ ẩm bằng dung dịch bão hòa ở 200C Các dấu vết máu khảo nghiệm trên các mảnh vải sẽ được treo lơ lửng trong không gian của bình thủy tinh được duy trình ẩm độ ở các mức: 0, 55 và 98% trong các mốc thời gian là 3, 10 ngày, và 5 tuần

Mẫu máu được duy trì trong bình kín với ẩm độ 0% bằng cách sử các gói hút ẩm với bản chất là silica gel

Bình ẩm độ 55% duy trì độ ẩm bằng dung dịch calcium chloride bão hòa (CaCl2.6H20)

Bình ẩm độ 98% được làm ẩm bởi các dung dịch là đồng sulfate (CuSO4.5 H2O)

Ở mỗi mức nhiệt độ và độ ẩm khảo nghiệm, tiến hành phân tích một mẫu đôi (tức là 2 dấu vết máu ở cùng một điều kiện)

Ứng với mỗi điều kiện nghiên cứu sử dụng một mẫu đối chứng để so sánh hồ sơ kiểu gen

Các dấu vết nghi máu thu nhận từ các vụ án hình sự, sau khi được đánh giá cảm quan về chất lượng và số lượng cùng với việc khai thác thông tin về thời gian tồn tại của dấu vết ở ngoài môi trường, các tác nhân vật lý như: nhiệt

độ, độ ẩm, ánh sáng…; chất liệu của vật mang dấu vết sẽ được giám định định hướng dấu vết là máu, xác định protein loài để xác định là máu người, tiếp đó

sẽ được phân loại để tách chiết lượng ADN khuôn

Tách chiết ADN từ dấu vết theo quy trình chuẩn bằng phương pháp vô

cơ sử dụng hạt Chelex (quy trình đã được phòng thí nghiệm ADN hình sự của cảnh sát bang Victoria - Liên bang Úc phê chuẩn)

Một số thông số cần đạt được trước khi tiến hành phân tích STR được thành công

- Thứ nhất, phải có đủ lượng ADN có mặt

- Thứ hai, ADN tách chiết được phải đảm bảo đủ chất, lượng…

Cả hai điều kiện này rất dễ để theo dõi khi sử dụng kỹ thuật định lượng

Realtime-PCR và điện di mao quản

Để giám định gen có kết quả, trước hết lượng ADN khuôn có mặt phải

đủ về số lượng Hàm lượng của ADN khuôn dùng trong phân tích STR được đánh giá thông qua kết quả định lượng hàm lượng ADN (ng/µl) thu được từ mẫu tách chiết

Hàm lượng của ADN được tách chiết sẽ được xác định bằng phương pháp

Realtime PCR sử dụng bộ kit Quantifiler Human ADN máy Realtime PCR

7500 của hãng ABI (Mỹ) Kỹ thuật này sử dụng mẫu dò TaqMan ®

được đánh

dấu và bộ đôi mồi oligonucleotide đặc hiệu cho trình tự ADN đích (hay đơn

vị tái bản),

Chất lượng của ADN được đánh giá thông qua kỹ thuật điện di mao quản

bằng phương pháp gắn mồi huỳnh quang Hình ảnh đặc trưng của các peak ghi nhận được qua quá trình phân tích sau điện di mao quản sử dụng phần mềm Genmapper ID (của hãng Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả biểu đồ điện di (chiều cao peak, sô lượng alen bị mất (drop out), số lượng peak bị mất cân bằng, peak bị xẻ (split), bị nhiễu (stutter) - Chất lượng của ADN thu được được xếp loại theo hàm lượng, hàm lượng cộng với độ đứt gãy, bị đứt gãy và không phát hiện được (không có ADN)

2.2 Giám định định hướng dấu vết máu

- Phương pháp xác định đính hướng dấu vết máu sử dụng bộ kít

Phenophthalein do Viện Khoa học hình sự sản xuất gồm 3 loại dung dịch:

40 giây, nhỏ tiếp 1 giọt dung dịch đổi màu số 2, sau đó nhỏ 1 giọt H2O2 3% (dung dịch 3) vào:

Đánh giá kết quả:

Dương tính: Cho kết quả màu hồng

Âm tính: Không đổi màu

(Phản ứng chỉ đọc kết quả trong vòng 1 phút)

Ghi chú: Tiến hành thử thuốc thử với máu chứng trước khi thử với dấu vết nghi máu, đảm bảo thuốc thử hoạt động tốt

2.3 Xác định protein loài theo Ochterlony từ dấu vết máu [2,3]

Sử dụng phản ứng khuếch tán miễn dịch kép theo phương pháp của Ochterlony để xác định protein đặc hiệu loài đối với dấu vết máu:

tử protein trong dấu vết tan ra và khuyếch tán ra xung quanh (quá trình chiết dấu vết) Nếu dấu vết máu quá khô hoặc vết máu quá cũ thì nên chiết dấu vết bằng nước cất trước, sau đó lấy dịch chiết với đệm làm phản ứng Thời gian chiết từ 2 – 24 giờ tuỳ theo tuổi dấu vết Trong trường hợp lượng dấu vết ít (vết máu đã bị ngâm nước hoặc đã bị giặt qua, chỉ còn màu nâu nhạt ) phải