2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.4. Tách chiết ADN từ những mẫu máu thu nhận ở hiện trƣờng:
ADN đƣợc tách chiết theo quy trình chuẩn bằng phƣơng pháp vô cơ sử dụng hạt chelex (quy trình đã đƣợc phòng thí nghiệm ADN hình sự của cảnh sát bang Victoria - Liên bang Úc phê chuẩn).
Phƣơng pháp tách ADN bằng Chelex
Chelex® là một loại nhựa tạo phức có ái lực cao đối với các ion kim loại đa hoá trị. Chelex® 100 Resin có khả năng loại bỏ các chất ức chế kim loại mà không làm thay đổi nồng độ các ion không kim loại của dung dịch
tinh sạch. Resin đƣợc tạo thành bởi hai polymer styrene và divinylbenzene chứa các liên kết imino, vì vậy có khả năng bám các kim loại caoNó là hợp chất trùng ngƣng styrene divinylbenzene có chứa các cặp ion imminodiaxetat hoạt động là nhóm tạo phức. Sự có mặt của chelex ở nhiệt độ 1000C sẽ ngăn cản sự biến tính của ADN vì nó gắn đƣợc với các ion kim loại đa hoá trị nhƣ magnesium (Mg++). Nhờ việc loại bỏ Mg++
ra khỏi phản ứng thì các enzym phân huỷ ADN (nuclease) sẽ bị bất hoạt và do vậy mà các phân tử ADN đƣợc bảo vệ. [11]
Tách chiết ADN bằng chelex là phƣơng pháp vô cơ, có ƣu điểm thao tác đơn giản, ít bị nhiễm và tốn ít thời gian.
Phƣơng pháp tách ADN bằng Chelex 100 đơn giản, cho hiệu quả cao và có thể áp dụng với nhiều đối tƣợng mẫu khác nhau.
Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp tách chiết ADN bằng Chelex 100 để tách ADN từ các mẫu máu thu ở hiện trƣờng các vụ án và các mẫu khảo nghiệm.
Quy trình tách chiết ADN bằng chelex 100 theo các bước như sau từ dấu vết máu
1. Thêm dấu vết máu cỡ khoảng 3 mm x 3 mm để vào ống tách chiết 1,5 ml vô trùng. Thêm 1 ml đệm PBS vào ống tách chiết. Lắc trộn 2 giây. 2. Ủ ở nhiệt độ phòng 30 phút. Lắc trộn 5 giây.
3. Li tâm trong máy li tâm trong 1 phút ở tốc độ tối đa 13.000v/p.
, không làm vẩn cặn phía dƣới, có thể để lại 1 lớp dịch mỏng ở trên phần cặn. Thêm 200 ul Chelex 5%. Lắc trộn ống trong 10 giây.
5. Ủ ở 56o
6. Lắc trộn ống trong 10 giây. 7. Ủ 100o
C trong 8 phút. 8. Lắc trộn ống trong 10 giây.
9. Li tâm trong trong 3 phút ở tốc độ tối đa 13.000v/phút.
10. Chuyển dịch nổi sang ống tách chiết khác để sử dụng cho quá trình PCR.
11. Bảo quản mẫu ở 4oC hoặc -20 o
C. [11][12]