2. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.3. Xác định protein loài theo Ochterlony từ dấu vết máu [2,3]
Sử dụng phản ứng khuếch tán miễn dịch kép theo phƣơng pháp của Ochterlony để xác định protein đặc hiệu loài đối với dấu vết máu:
Nguyên tắc của phản ứng
Trong huyết thanh, trong các dịch cơ thể đều có chứa các kháng nguyên đặc hiệu loài. Khi các kháng nguyên này kết hợp với các kháng thể đặc hiệu sẽ tạo thành dạng kết tủa, nhìn thấy đƣợc.
Cách tiến hành
Dùng kéo cắt một mảnh nhỏ dấu vết (cỡ 0,1 x 0,1 cm) cho vào lỗ thạch trung tâm, dùng pipet cho nƣớc cất vào đầy lỗ thạch, sao cho thấm hết mảnh dấu vết và không để có bọt khí, lƣợng nƣớc thêm vào nhằm để cho các phân tử protein trong dấu vết tan ra và khuyếch tán ra xung quanh (quá trình chiết dấu vết). Nếu dấu vết máu quá khô hoặc vết máu quá cũ thì nên chiết dấu vết bằng nƣớc cất trƣớc, sau đó lấy dịch chiết với đệm làm phản ứng. Thời gian chiết từ 2 – 24 giờ tuỳ theo tuổi dấu vết. Trong trƣờng hợp lƣợng dấu vết ít (vết máu đã bị ngâm nƣớc hoặc đã bị giặt qua, chỉ còn màu nâu nhạt...) phải
tăng lƣợng dấu vết lấy làm phản ứng hoặc phải chiết, cô đặc dấu vết để làm phản ứng.
- Nếu mẫu giám định ở dạng lỏng (máu lỏng, dịch chiết dấu vết) thì dùng pipet cho mẫu vào đầy lỗ, không để có bọt khí.
- Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng. Tuỳ theo chất lƣợng dấu vết, chất lƣợng kháng huyết thanh, thời gian xuất hiện kết quả phản ứng sẽ khác nhau. Thời gian phản ứng có thể từ 4 giờ đến tối đa là 24 giờ, thông thƣờng là 8 - 12 giờ. Khi xem kết quả nên dùng một màn tối màu đặt ở phía sau đĩa thạch hoặc dùng đèn chiếu xiên, chiếu từ phía sau đĩa thạch, theo phƣơng xiên góc, sẽ nhận thấy vạch tủa rõ hơn. Chú ý phân biệt vết mốc, vết xƣớc với vạch kết tủa.
Đánh giá kết quả
- Phản ứng dƣơng tính: Khi có một (hoặc 2- 3) vạch tủa màu trắng, thẳng (hoặc hơi cong), dài khoảng 0,5 cm nằm ở khoảng giữa và vuông góc với đƣờng thẳng nối tâm của lỗ thạch chứa dấu vết và lỗ thạch chứa kháng huyết thanh xuất hiện kết tủa với kháng huyết thanh kháng protein của loài nào thì dấu vết là máu của loài đó.
- Phản ứng âm tính: Không có vạch tủa.
