Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong chẩn đoán (Khóa luận hoàn chỉnh)

Bệnh do sán lá lớn ở gan là bệnh phổ biến ở trâu bò và các động vật khác như dê, cừu. Bệnh có khả năng lây truyền qua người do ăn rau sống mọc dưới nước có chứa nang trùng. Có hai loại sán lá lớn ở gan là Fasciola gigantica và Fasciola hepatica.

Fasciola gigantica phổ biến ở những vùng nhiệt đới như Đông Nam Á,

Châu Phi, Hawaii, Pakistan và Thái Lan; còn Fasciola hepatica phổ biến ở Châu Âu,

vùng Đông Nam Châu Phi, Mỹ, Châu Úc và Nhật Bản

Các công trình nghiên cứu của những tác giả trong nước cho thấy động vật

ăn cỏ ở Việt Nam nhất là trâu bò bị nhiễm sán lá gan cao và đa số là do F gigantica

Bệnh sán lá gan làm giảm trọng lượng con vật rõ rệt, giảm phẩm chất của thịt (thịt bị thấm ướt), giảm sức chống đỡ với các bệnh khác, làm giảm lượng sữa ở trâu bò nuôi lấy sữa

Ở Việt Nam, trước đây bệnh do Fasciola sp ở người chưa được phát hiện

Tuy nhiên, tỉ lệ người mắc bệnh này đang có chiều hướng gia tăng được xác định với

kỹ thuật chẩn đoán bệnh này ngày càng chính xác hơn

Theo các công trình nghiên cứu khoa học trên thế giới, khi ký sinh trong cơ thể vật chủ, sán lá gan lớn sẽ tiết ra các chất có đặc tính sinh học và là kháng nguyên (nên còn gọi là kháng nguyên tiết) đối với thể chủ Loại kháng nguyên này được đánh giá là có mức độ đặc hiệu cao hơn kháng nguyên thân và kháng nguyên bề mặt, do đó việc chẩn đoán bệnh sán lá gan sẽ chính xác hơn nếu sử dụng loại kháng nguyên này Ngoài ra, trong dịch tiết này còn có thành phần cysteine-protease được biết như là một enzyme thiết yếu cho cầu ký sinh giữa ký sinh vật và thể chủ Enzyme tinh chế đã được dùng làm vaccine tiêm chủng trên cừu cho thấy, mặc dù không loại trừ được hoàn toàn sự phát triển của sán lá gan nhưng kết quả thí nghiệm đã chứng minh có sự giảm hoặc làm mất hẳn sự xuất hiện của trứng sán trong phân Điều này cũng góp phần hạn chế sự lây lan của dịch bệnh, giảm thiệt hại kinh tế

Những nhận định trên đã được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – trường Đại Học Nông Lâm TPHCM và Viện Pasteur TPHCM Dưới sự hướng dẫn của TS.Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Nguyễn Lê Trang, chúng tôi tiến hành thực hiện

đề tài: “Thu thập dịch tiết từ Fasciola gigantica và sử dụng làm kháng nguyên trong

chẩn đoán” để xây dựng quy trình tạo kháng thể cho mục đích chẩn đoán y học và nghiên cứu cơ chế ký sinh của sán lá gan

Kiểm tra phản ứng giữa kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm

Fasciola sp và kháng nguyên tiết trong dịch tiết của sán lá gan lớn bằng

phương pháp miễn dịch khuếch tán kép Ouchterlony

Tạo cột sắc ký ái lực Sepharose 4B - kháng nguyên tiết để tinh chế kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tiết của sán lá gan lớn

Tinh chế kháng thể kháng Fasciola sp từ huyết thanh bệnh nhân nhiễm

sán lá gan lớn, dùng sắc ký ái lực miễn dịch

Chế tạo hệ thống miễn dịch men để phát hiện kháng nguyên Fasciola sp

Tìm hoạt tính protease trong dịch tiết của sán lá gan lớn với phương pháp điện di SDS-PAGE, 12% và gelatine 0,1% trong thạch

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu sán lá gan và bệnh do sán lá gan lớn gây nên [4]

Loài sán lá gan Fasciola gigantica đã được Cobbold phát hiện từ năm

1855

Bệnh do sán lá gan F gigantica gây ra gọi là bệnh sán lá gan, bệnh phổ

biến ở vùng Á Châu và Phi Châu

Theo E Brumpt, dê, cừu, trâu, bò và cả người cũng nhiễm F gigantica

Năm 1879, Brie là người đầu tiên đã công bố và mô tả về bệnh sán lá gan ở cừu

Năm 1881, Thomas và Leuckart là hai người đầu tiên đã phát hiện được trong vòng đời (chu trình phát triển) của sán lá gan phải có ốc (ký chủ trung gian) tham gia và hai năm sau vào năm 1883, Thomas đã thực nghiệm và bổ sung thêm về chu trình: phát hiện trứng sán lá gan phát triển phải có nước, nước là yêu cầu cấp bách nhất của ngoại cảnh Việc nghiên cứu chu trình phát triển của sán lá gan sau này vẫn do Thomas

chủ trì, cuối cùng đã nghiên cứu thành công vòng đời của F hepatica

2.2 Vòng đời của sán lá gan lớn

Trong điều kiện nhiệt độ thích hợp (từ 28-300C), có ốc ký chủ trung gian

Lymnaea swinhoei hoặc Lymnaea viridis và có vật chủ cuối cùng (dê, cừu, trâu, bò

nhiễm kén gây bệnh Adolescaria) thì vòng đời phát triển của sán lá gan nước ta được xác định với các khoảng thời gian như sau:

Ở môi trường nước (ao, hồ, rãnh…): Trứng sán lá gan nở thành miracidium sau 14-16 ngày

Ở trong ốc ký chủ trung gian:

Miracidium phát triển thành sporocyst trong 7 ngày

Sporocyst thành redia trong 8-21 ngày

Redia thành cercaria non trong 7-14 ngày

Cercaria non thành cercaria trưởng thành trong 13-14 ngày

Ở trong nước (ao, hồ, rãnh…): Cercaria rụng đuôi thành adolescaria gây bệnh sau 2 giờ

Ở trong vật chủ cuối cùng: Thời gian sán phát triển thành sán trưởng thành là 79-88 ngày

Hình 2.1 – Chu kỳ phát triển của sán lá gan lớn (Fasciola sp)[13]

Như vậy điều kiện nóng ẩm của nước ta rất thuận lợi cho sự gây nhiễm bệnh cũng như nhiễm bệnh trong tự nhiên Gia súc nhai lại rất dễ cảm nhiễm kén gây bệnh

Ở những vùng có mầm bệnh (trứng sán), có nhiệt độ thích hợp để trứng nở thành miracidium, có ốc ký chủ trung gian, có dê, cừu, trâu, bò nuốt phải kén gây bệnh thì cứ bình quân ba tháng lại tạo ra một đời sán mới Con vật trong khi vẫn mang sán lại nhiễm tiếp mầm bệnh mới, gây ra sự bội nhiễm làm cho mức độ bệnh trở nên nặng hơn

2.3 Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp)

Cũng như nhiều loài sán lá khác, sán lá gan có hệ sinh dục lưỡng tính (có cả bộ phận sinh dục đực và cái trên một cá thể) Sán có hai giác bám, giác miệng ở phía đầu sán, giác bụng tròn và ở gần giác miệng Sán lá gan không có hệ tuần hoàn và hô hấp

Hệ bài tiết gồm nhiều ống nhỏ, phân nhánh và thông với hai ống chính Hai ống này hợp lại ở cuối thân rồi thông ra ngoài qua lỗ bài tiết Thực quản tương đối ngắn, ống tiêu hóa khá dài ra tận phần cuối thân sau, phân thành nhiều nhánh Dịch hoàn nằm sau buồng trứng và cũng phân nhánh

PGS TS Phan Địch Lân (1994), đã phân biệt khái quát hai loài sán lá gan như sau:

Một loài có chiều dài thân gấp ba lần chiều rộng, vai sán không có hoặc nhìn không rõ rệt, nhánh ruột chia tỏa ra nhiều nhánh ngang, loài này là

F gigantica

Loài kia có thân hình như cái lá, thân rộng, phía đầu lồi hẳn ra phía trước

làm cho sán có “vai đặc biệt”, nhánh ruột chia ít và nhỏ, loài này là F

hepatica

Hình 2.2 – Hình thái sinh học của sán lá gan lớn (Fasciola sp)[15]

2.4 Tác hại của bệnh do sán lá lớn ở gan

2.4.1 Ở gia súc [4]

Đây là bệnh khá phổ biến đối với trâu bò ở đồng bằng sông Cửu Long và các địa phương khác trong cả nước Sán dinh dưỡng bằng cách ăn các hồng cầu, các tế bào thượng bì của niêm mạc ống dẫn mật

Bệnh sán lá gan trâu bò rất phổ biến ở những vùng trũng nước ngọt, vì có nhiều điều kiện thuận lợi cho trứng phát triển và có sự hiện diện của ký chủ trung gian Do sán non di hành trong nhu mô gan làm thương tổn gan, vật bệnh sốt, kém ăn, mệt mỏi

Triệu chứng lâm sàng thường gặp là gầy rạc, suy nhược cơ thể, ỉa phân nhão không thành khuôn; về sau con vật lúc táo bón, lúc tiêu chảy, niêm mạc mắt nhợt nhạt; lông xù, mốc, dễ nhổ Phân có mùi khắm, đen, hốc mắt sau, có con có nhèm; có thủy thủng ở nách, ức, chướng hơi dạ cỏ, hơi thở hôi, vùng gan sưng lên Khi sờ vào vùng này con vật có cảm giác đau đớn và chết dễ dàng vì viêm gan nặng hoặc vì suy kiệt

2.4.2 Ở người [3]

Bệnh tiến triển theo hai giai đoạn:

Giai đoạn gan (xâm nhập): Các triệu chứng xuất hiện khoảng 6-12 tuần sau khi ăn phải các nang ấu trùng vào kéo dài 2 - 4 tháng Trong giai đoạn này, một số lượng lớn ấu trùng di chuyển qua thành ruột, qua khoang phúc mạc, bao gan Các triệu chứng hay gặp nhất là đau bụng, sốt cơn, sút cân, nổi mề đay, ho, khó thở, đau ngực, rối loạn đại tiện, chán ăn và buồn nôn Có khi đau khắp bụng nhưng thường khu trú ở vùng hạ sườn phải Bạch cầu ái toan tăng rất cao (70% - 80%)

Giai đoạn mật (trưởng thành): Có thể kéo dài nhiều năm do Fasciola sp

có xu hướng di chuyển đến lòng ống mật chủ và phát triển thành sán trưởng thành ở đó Trên đường đi sán ăn mô gan ký chủ gây ra các triệu chứng nặng Gan to, vàng da, thiếu máu (một con sán trưởng thành hút 0,2 ml máu /ngày) Đôi khi sán non có thể lọt vào tĩnh mạch về đại tuần hoàn và định vị ở những nơi xa như mô dưới da, phổi, mắt… (trường hợp ký sinh trùng lạc chỗ) Sau ba tháng, sán đã định vị trong ống mật Người bệnh sẽ có những triệu chứng viêm gan mật mãn, tiếp tục bị mệt mỏi, sụt cân, biếng ăn… Giai đoạn này, số bạch cầu ái toan lại giảm nhiều Trong phân cũng như dịch mật người bệnh bắt đầu có thể tìm thấy những trứng sán Nhưng thực tế số trứng rất ít và cũng ít khi xét nghiệm này được chỉ định Bệnh tiếp tục kéo dài trong nhiều năm, nếu để tồn lưu lâu ngày sẽ bị các bệnh mãn tính của đường mật và có thể dẫn đến biến chứng xơ gan, vỡ gan, suy gan, đau bụng dai dẳng, mất sức lao động và cuối cùng có thể dẫn đến tử vong

2.5 Chẩn đoán, phòng ngừa và điều trị bệnh sán lá lớn ở gan

2.5.1 Ở gia súc [4]

Chẩn đoán: Chú ý đến tính chất vùng có đủ điều kiện thích hợp cho sán phát triển Trâu bò ở thể mãn tính gầy ốm, suy nhược và tiêu chảy kéo dài (viêm ruột mãn) Để tìm trứng sán trong phân ta có thể sử dụng phương pháp gạn rửa sa lắng phân: lấy 4-8 viên phân, nếu phân nhão thì lấy một lượng phân bằng quả táo ta, hòa trong nước sạch rồi lọc qua lưới thép bỏ bớt cặn bã Nước lọc được để lắng cặn và gạn rửa nhiều lần rồi gạn nước trong ở trên bỏ đi, lấy cặn phân soi kính hiển vi tìm trứng sán

lá gan ở độ phóng đại 100 lần Trứng sán lá gan hình bầu dục, một đầu hơi nhỏ hơn, màu vàng nâu, trong có phôi bào xếp sát đến vỏ trứng

Theo Enigh, một con sán lá gan một năm có thể thải theo phân khoảng

6000 trứng và sán có thể sống trong cơ thể gia súc tới 11 năm Trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ thích hợp, chỉ một phần số trứng phát triển, một miracidium phát triển thành chừng 180 – 200 cercaria trưởng thành

Sự khô ráo và tác động trực tiếp của ánh nắng mặt trời làm trứng chết Trong phân ướt trứng sống được 8 tháng Trứng sán ngừng phát triển ở 10-120C Ở nhiệt độ dưới 500C trứng sống được 2 ngày Trong cỏ phơi chưa khô, adolescaria gây bệnh duy trì được sức sống 3-5 tháng

Phòng bệnh:

+ Chống phát tán mầm bệnh: Ủ phân diệt trứng sán, làm tinh sạch “tinh khiết” ốc ký chủ trung gian Áp dụng biện pháp

Hình 2.5.1 – Trứng sán lá gan lớn (Fasciola sp)[17]

chia lô chăn thả, qui hoạch bãi chăn gia súc không bị nhiễm sán, kiểm tra gia súc để phân loại tẩy sán trước khi thả vào bãi + Diệt mầm bệnh: Tẩy sán lá gan trong cơ thể gia súc theo lịch dựa vào chu trình sinh học của sán Những cơ sở giống 3 tháng tẩy 1 lần; các cơ sở ô nhiễm nặng tẩy 2 lần/năm; cơ sở ô nhiễm nhẹ tẩy 1 lần/1 năm; cơ sở nhiễm dưới 20% tổng đàn thì phát hiện con nào có sán tẩy con đó và cần tăng cường sức khỏe của đàn gia súc bằng chế độ ăn uống và quản lý tốt sức cày kéo của trâu bò, định kỳ kiểm tra sức khỏe

ca ở người chỉ trong vòng có 3 năm Đa số bệnh nhân đến từ các tỉnh ven biển miền Trung như Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình Định, Phú Yên, Khánh Hòa Tất cả bệnh nhân đều có hình ảnh tổn thương gan trên siêu

âm, tổn thương dễ nhầm với abces gan do amibe; abces gan do vi khuẩn, ung thư gan Bên cạnh đó xét nghiệm máu cho thấy bạch cầu toan tính tăng cao từ 16 – 70% và tất cả có hiệu giá kháng thể là 1/1600 – 1/12800

với kháng nguyên là Fasciola gigantica

Hình 2.5.2.1 – Hình chụp CT bệnh nhân bị nhiễm sán lá gan lớn [Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh]

Hình 2.5.2.2 - Hình chụp siêu âm của bệnh nhân nhiễm sán lá lớn ở gan

[Bệnh viện Bệnh nhiệt đới Thành Phố Hồ Chí Minh]

Về điều trị dùng Dehydro – Emetine hoặc Chlorhydrate Emetine, mặc dầu thuốc này có nhiều tác dụng phụ (gây liệt cơ, suy tim…); bệnh nhân phải nằm viện tối thiểu 10 ngày nhưng vẫn phải sử dụng vì thị trường

trong nước chưa có thuốc nào thuận tiện hơn Hiện nay, có xu hướng sử dụng triclabendazole

Theo dõi bệnh nhân sau điều trị thì thấy tỷ lệ bạch cầu toan tính trong máu và hình ảnh siêu âm gan có xu hướng trở lại bình thường sớm hơn hiệu giá huyết thanh miễn dịch Đến tháng 9, tỷ lệ bạch cầu toan tính trong máu của 70% bệnh nhân trở lại mức bình thường sớm hơn hiệu giá huyết thanh miễn dịch Sau một năm điều trị, hiệu giá kháng thể vẫn còn cao (trên 91,96%) nên không thuận lợi để theo dõi hiệu quả của điều trị

Do tập quán ăn rau sống, bối cảnh sinh thái môi trường, chăn nuôi gia súc gần nơi trồng rau, số người mắc bệnh chắc chắn phải rất cao trên thực tế, vì vậy dùng Emetine chưa phải là một giải pháp tốt cho việc điều trị hàng loạt cần phải có sự phối hợp giữa nhiều ngành chức năng: thú y, canh nông, môi trường, sinh thái, y học để giải quyết tốt vấn đề này ở nước ta

2.6 Dịch tiết từ sán lá gan lớn trong thời gian ký sinh có vai trò sinh học

2.6.1 Protein tiết và đáp ứng miễn dịch

Protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được tiết ra ở các giai đoạn phát triển khác nhau của sán lá gan trong cơ thể của ký chủ Loại protein này được xem như

một sự nhiễm bệnh đối với Fasciola sp Do đó, nó có thể được dùng để chẩn đoán sớm

bệnh sán lá gan lớn ở người khi kháng thể đặc hiệu chống lại sán chưa được xuất hiện (từ 1 – 3 tuần sau nhiễm) Bệnh thường có những triệu chứng lâm sàng không rõ ràng

và biến động nên đa số các bệnh nhân nhập viện đều cho kết quả kháng thể kháng

Fasciola sp cao Lúc này, lượng protein tiết đánh giá qua xét nghiệm sẽ giảm dần và

có xu hướng mất hẳn Do đó, việc phát hiện kháng nguyên tiết trong huyết thanh bệnh nhân cũng gặp nhiều khó khăn Sán ký sinh ở ống dẫn mật nên lượng protein tiết sẽ lưu thông xuống ruột và được bài tiết theo phân Vì thế, việc tìm protein tiết trong phân có nhiều thuận lợi hơn

Xét nghiệm huyết thanh học qua phương pháp miễn dịch men đã được Trần Vinh Hiển và Trần Thị Kim Dung dùng để phát hiện kháng thể của người bệnh mang

lại hiệu quả cao Nhưng do sử dụng kháng nguyên thân của F gigantica nên có thể có

những phản ứng chéo không mong muốn và không thể đánh giá được hiệu quả điều trị bệnh vì lượng kháng thể vẫn còn tồn tại rất lâu trong cơ thể bệnh nhân sau khi đã khỏi bệnh Thành phần protein trong dịch tiết của sán lá gan lớn được đánh giá là có tính

đặc hiệu hơn so với kháng nguyên thân của F gigantica (còn gọi là kháng nguyên tiết

– excretory/ secretory antigens) nên có thể sử dụng để cải tiến phương pháp huyết thanh miễn dịch men để phát hiện kháng thể nhạy hơn và để tránh các phản ứng chéo Ngoài ra, kháng nguyên tiết còn được dùng để đánh giá hiệu quả điều trị vì các nghiên cứu khoa học cho thấy sau khi được điều trị thì lượng kháng nguyên tiết sẽ được giảm một cách từ từ trong cơ thể ký chủ Do đó hiệu quả điều trị sẽ được đánh giá nhanh chóng hơn [6, 5, 11,12]

2.6.2 Hoạt động protease

Thành phần chủ yếu của dịch tiết là cysteine-protease trong thời gian ký sinh đóng vai trò chủ chốt trong việc xâm nhập bệnh vào cơ thể ký chủ Các enzyme này giúp phân giải thành phần protein của ký chủ để cung cấp dinh dưỡng cho sán phát triển và để tạo điều kiện thuận lợi cho sự di chuyển của ký sinh trùng qua ruột non và gan Chúng phân cắt những protein của màng ruột như fibronectin, laminin và collagen Mặt khác, chúng còn bất hoạt hàng rào bảo vệ miễn dịch của tế bào chủ bằng

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian thực hiện đề tài: từ tháng 3/2005 đến tháng 6/2005

Địa điểm: phòng Hóa Miễn Dịch, Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Sán trưởng thành từ gan trâu, bò bị nhiễm sán lá gan được lấy từ công ty Vissan

Sử dụng sán chết được giữ trong môi trường PBS Bảo quản ở -200C Nuôi sán còn sống trong môi trường được pha chế bên ngoài vật chủ để thu lấy dịch tiết Bảo quản ở -200C

3.2.2 Thiết bị và dụng cụ

3.2.2.1 Thiết bị

Cân phân tích E14130, OHAUS, Switzerland

Máy lọc nước Titertek (Microtitration)

Tủ hút khí (pha hóa chất) Kottermann

Máy đo pH METTLER TODEDO MP220

Máy sấy tiệt trùng

Tủ cấy vô trùng

Lọc vô trùng 0,22 μm

Máy ly tâm lạnh MEGAFUGE 1.0 R, Heraeus Instruments

Máy ly tâm nhỏ Micro centrifuge

Máy khuấy từ CATM6/1

Tủ lạnh Vestfrost REETECH, DOSAI, SANYO

Máy vortex Minishaker MS1

Máy lắc thường LAB-ROTATOR, LAB-LINE

Máy đo quang phổ hấp thụ Spectrophotometer U 3310 Hitachi (Japan)

Bộ điện di protein SNEW

Máy đọc ELISA Sanofi PR 2100, Diagnostics Pasteur

Máy nghiền tế bào bằng sóng siêu âm Sonicator (Merck)

3.2.3 Hóa chất và cách chuẩn bị các dung dịch

Dung dịch BSA (Bovine Serum Albumin)

Các dung dịch dùng trong điện di:

1 Dung dịch 40% T: Acrylamide (38,93g); N, acrylamide (1,07g) Hòa tan trong khoảng 80 ml + 1 ít MB1 và xoay với máy khuấy từ trong 30 phút Chỉnh đúng 100 ml Lọc qua Whatman số 1 cho vào chai nâu và bảo quản ở 40C

2 Dung dịch 9,5% T: Acrylamide (6,3g); N, acrylamide (3,2g) Làm theo như với dung dịch 1

N’-Methylene-bis-3 Đệm phân giải (1,5M Tris): Tris base (18,15g) Trộn với khoảng

70 ml H2O Dùng HCl hòa tan và chỉnh pH xuống 8,8 Chỉnh đúng 100 ml và bảo quản ở 40C

4 Đệm tập trung: Tris base (3g) Trộn với khoảng 35 ml H2O Dùng HCl, hòa tan và chỉnh pH xuống 6,8 Chỉnh đúng 50 ml và bảo quản ở 40C

5 Dung dịch SDS 10%: 10g/100 ml Giữ ở nhiệt độ phòng

6 Dung dịch đệm bình điện di: Tris base (12g); glycine (57,6g) Hòa tan và chỉnh đúng 1000 ml Bảo quản ở 40C Khi dùng pha loãng

¼ và cộng 1% dung dịch 5 (4 ml/400ml)

7 Dung dịch cố định: Sulfosalicylic acid (4g) + 100 ml Trichloroacetic acid 12,5%

8 Dung dịch nhuộm: Coomassie R250 (2,5g); Methanol (600 ml); Acid acetic (90ml) Trộn đều bột màu với hai dung môi hữu cơ này để hòa tan trước khi cho nước vào, 300 ml nước (Có một số bột màu có giá bột thủy tinh, không tan được phải lọc qua Whatman số 1)

9 Dung dịch tẩy: Methanol (50ml); Acid acetic (75ml); nước cho đến 1000 ml

10 Dung dịch glycerol (d=1,25g/ml) 1g=0,8 ml (nếu không dùng 1g glycerol dùng 0,8 ml H2O)

11 Dung dịch xanh-glycerol dùng để pha mẫu: glycerol (2 ml); SDS 10% (2,5 ml); đệm 4 (2 ml); màu bromphenol (80 μl); nước cất vừa đủ 10 ml Bảo quản ở 40C

Dung dịch TEMED (2μl/4ml) khi còn mới Khi lực xúc tác

bị yếu đi tăng lên cao hơn

Dung dịch APS/KPS (A/K persulfate) (100 mg/ml) pha trước khi dùng ở 40C Chỉ dùng dung dịch mới pha (15 μl/ 4 ml) khi còn mới

Khi lực xúc tác bị yếu đi, tăng lên cao hơn Để hãm tốc độ polymer hóa, các dung dịch monomer cần cho xuống 40C trước khi thực hiện gradient

Dung dịch nhuộm đỏ Ponceau S 0,2%

Các dung dịch dùng trong sắc ký ái lực:

Gel CN-Br activated Sepharose 4B (Pharmacia, Thụy Điển) Dung dịch NaN3 0,05% (dd1)

Dung dịch HCl 1mM, pH = 3

Dung dịch đệm carbonate: NaHCO3 0,1M; NaCl 0,5M; thimerosal 0,01%; pH = 8,7 (dd3)

Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaCl 0,5M; pH = 8 (dd4)

Dung dịch NaCl 0,5M; CH3COONa 0,1M; pH = 4 (dd5) Dung dịch Tris-HCl 0,1M; NaN3 0,05%; NaCl 0,5M; pH = 7,4 (dd6) Dung dịch glycine 0,1M, pH = 2,5

Các dung dịch dùng trong kỹ thuật ELISA:

Đệm carbonate Na2CO3; pH = 9,6: NaHCO3 0,075M (pH = 8; 1,26g/ 200 ml); Na2CO3 0,075 M (pH = 10,9; 159 g/200 ml); NaN3 0,003% (0,04 g/200 ml)

Dung dịch rửa: PBS thimerosal 0,01%; Tween 0,05%

Dung dịch bão hòa pH = 8 (HCl): Tris 0,1M; NaCl 0,15 M; EDTA 1mM, NaN3 0,05%; Tween 20 0,05%; Gelatin 0,5% NHS-LC-Biotin (21336, Pierce)

OPD – cơ chất cho peroxydase (Sigma, USA)

Streptavidin - peroxydase (Sigma, USA)

Chất hiện màu

Dung dịch ngừng phản ứng H2SO4 1,5 N

3.3 Phương pháp

3.3.1 Quy trình lấy mẫu [6]

Sán trưởng thành từ gan trâu hoặc bò bị nhiễm sán lá gan được rửa 4 lần với PBS 1X cho sạch máu và mật, sau đó cho vào ống chứa PBS và bảo quản ở -200C

Đối với sán sống cho vào môi trường nuôi RPMI 1640 (1 con/5 ml/1 ống nghiệm), ủ ở 370C/24h Sau đó ly tâm (3000 vòng/phút/40C/30phút) thu lấy dịch nổi, bảo quản ở -200C

3.3.2 Định lượng protein bằng phương pháp đo mật độ quang OD 280 [9]

Phương pháp này sử dụng một máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – VIS) Cấu tạo gồm nguồn sáng, một khe hở cho ánh sáng đi vào, các lăng kính và cách tử để tạo thành các ánh sáng đơn sắc, ngăn chứa mẫu và đầu dò để đo lượng ánh sáng sau khi qua mẫu Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát qua hệ thống các lăng kính và cách tử sẽ chỉ tạo ánh sáng đơn sắc với bước sóng nhất định Khi đi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn

Phân tử protein hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 280 nm, sự hấp thụ này

có được chủ yếu là do các amino acid có nhân thơm như phenylalanine, tyrosine, tryptophan Tuy nhiên, mỗi protein có thành phần và số lượng các amino acid trên khác nhau nên mỗi protein sẽ có một hệ số tắt (extinction) tương ứng Hệ số tắt này là tỉ

số giữa độ hấp thụ quang ở bước sóng 280 nm (OD280) trên nồng độ (mg/ml) của protein

Ví dụ, protein BSA có hệ số tắt là 0,66; như vậy nếu BSA giá trị OD280 = 0,66 thì nồng độ của BSA là 1 mg/ml

Hình 3.3.2 – Biểu đồ quang học máy đo quang phổ 250 – 700 nm (UV – Vis)[9]

3.3.3 Xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford [7,18]

Bradford là một phương pháp định lượng protein rất phổ biến bởi vì nó đơn giản, nhanh, không đắt và nhạy Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Coommassie Briliant Blue G-250 (CBBG) Thuốc nhuộm này liên kết chuyên biệt với protein ở vị trí các nhóm amino acid arginine, tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine trong đó chủ yếu là liên kết với arginine (nhiều hơn 8 lần so với nhóm khác) CBBG liên kết với các nhóm này dưới dạng amin, mà ở dạng này nó hấp thụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 595 nm (màu xanh); Thuốc nhuộm ở dạng tự

do là cation, mà ở dạng này nó hấp phụ ánh sáng tối đa ở bước sóng 470 nm (màu đỏ) Phương pháp này được đo ở bước sóng 595 nm bởi một máy quang phổ kế, và

vì vậy đo phức hợp CBBG với protein

Hình 3.3.3 – Cấu trúc hóa học của Coommassie Brilliant Blue G-250

Sự lựa chọn protein chuẩn cho phương pháp này cũng ảnh hưởng nhiều đến kết quả Đối với mỗi protein được định lượng nên có một protein chuẩn thích hợp BSA là một protein chuẩn thường được lựa chọn và kết quả là tương đối với BSA

 Cách thực hành:

Xác định đường chuẩn theo nồng độ protein chuẩn (BSA)

Dung dịch BSA có nồng độ 200 µg/ ml

Thực hiện đường chuẩn độ protein tương đối với BSA

Chuẩn bị mẫu protein tinh chế

Pha loãng mẫu sao cho sự quan sát có đựơc nằm trong giới hạn cho phép của đường chuẩn

Thứ tự các chất cho vào giếng: nước cất, BSA chuẩn (hoặc mẫu protein), dung dịch Bradford 4X

Trộn đều các chất trong giếng (tránh tạo bọt), để phản ứng trong 5 phút

Đo bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 595 nm

Xử lý số liệu bằng phần mềm KC4 và Microsoft Excel 2003

Bảng 3.3.3 – Tổ chức thực hiện đường chuẩn protein theo nồng độ BSA

Giếng

Lượng BSA(µg)

V ( BSA) (200µg/ml)(µl)

Nước cất hai lần (µl)

3.3.4 Điện di SDS-PAGE 12% xác định thành phần protein trong dịch

tiết của sán lá gan lớn [9,16]

Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) được Laemmli (1970) phát triển từ sự hiệu chỉnh bằng cách thêm 0,1% SDS (chất tẩy mang điện tích âm) vào hệ PAGE của Ornstein-Davis (1964) nhằm xác định trọng lượng phân tử các loại protein trong phổ điện di; xác định thành phần và độ sạch của chế phẩm protein trong quá trình được tinh chế (Davis E.Garfin 1995) [16] Trong kỹ thuật này, protein được xử lý với chất tẩy SDS

và tác nhân khử cầu nối disulfide là mercaptoethanol hoặc dithiolthretol (DTT) Với các tác nhân này, protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả protein đều được tích điện âm Tỷ lệ lượng SDS bám được vào protein là không thay đổi:

SDS/ protein (g/g) =1,4

Tổ chức của phức hợp protein-SDS cấu tạo thành một hình bầu dục dài (ellipsoid) với các cực âm của các nhóm sulfate ở phía ngoài Protein càng lớn, bầu dục càng dài Do đó, có sự liên quan giữa trọng lượng phân tử của protein với tốc độ di chuyển của các protein trong môi trường có SDS cho đường biễu diễn tuyến tính log.(M.W.) = ax + b (chiều dài đường di) Công thức này cho thấy trọng lượng phân tử (M.W) càng lớn, đường đi càng ngắn, tức a < 0 và cắt các cầu nối S-S là cần thiết để đảm bảo quy luật trên

Tốc độ di chuyển của một protein trong phương pháp điện di dựa trên sự khác nhau về điện tích, kích thước lỗ gel, trọng lượng phân tử, cường độ điện trường, thời gian điện di, nhiệt độ…

Các thành phần được sử dụng để xây dựng nên giá thể đa phân (polymer) là acrylamide, N,N’-methylene-bis (acrylamide), tetramethylenediamine (TEMED) và ammonium persulfate

Hình 3.3.4.1 – Các thành phần đƣợc sử dụng để tạo gel polyacrylamide

Khi ammonium persulfate bị phân ly trong nước, nó hình thành nên các gốc tự do:

S2O82- → 2SO4Nếu các gốc tự do này được tiếp xúc với acrylamide, gốc tự do trong phân tử acrylamide được hình thành Sau đó acrylamide được hoạt hóa này sẽ phản ứng với các phân tử acrylamide khác để tạo ra một chuỗi đa phân dài

2-Hình 3.3.4.2 – Phản ứng chuỗi đa phân hóa acrylamide